SuperDendrix算法揭示癌症中的遗传依赖与基因组改变

0文章0SuperDendrix算法整合了通路和癌症类型中的遗传依赖性和基因组改变0图解摘要0亮点0d  SuperDendrix发现样本特征和CRISPR遗传依赖之间的关联0d  体细胞突变与DepMap项目中的127个遗传依赖关系相关0d  转录因子上的谱系特异性依赖与基因表达相关0d  鉴定的关联与致癌通路内相互作用的方向一致0作者0Tae Yoon Park, Mark D.M. Leiserson,Gunnar W. Klau, Benjamin J. Raphael0通讯作者braphael@princeton.edu0简而言之0Park等人使用SuperDendrix检查了769个癌细胞系中的遗传依赖关系。他们报告说，127个遗传依赖关系由相互排斥的体细胞突变组合解释，聚集成少数致癌通路跨癌症亚型。这些呈现出癌症中少数突出且高度特异的遗传易感性。0Park等，2022年，Cell Genomics  2 , 100099 2022年2月9日  ª  2022The Author(s). https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100099 ll0SuperDendrix算法整合了通路和癌症类型中的遗传依赖性和基因组改变0Tae Yoon Park, 1,2,5 Mark D.M. Leiserson, 3,5 Gunnar W. Klau, 4,5 and Benjamin J. Raphael 1,2,6, * 1 Department of Computer Science,Princeton University, Princeton, NJ 08540, USA 2 Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, NJ 08540, USA3 Department of Computer Science and Center for Bioinformatics and Computational Biology, University of Maryland, College Park, MD 20742,USA 4 Algorithmic Bioinformatics, Heinrich Heine University D € usseldorf, D € usseldorf 40225, Germany 5 These authors contributed equally 6Lead contact *Correspondence:  braphael@princeton.edu https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.1000990摘要0最近的全基因组CRISPR-Cas9功能丧失筛选已经确定了许多癌细胞系中的遗传依赖关系。这些依赖关系与同一细胞系中的基因组改变之间的关联揭示了致癌基因依赖和合成致死现象等现象。然而，由于基因在遗传异质性癌症类型之间的复杂相互作用，全面确定这些关联是复杂的。我们引入并应用了SuperDendrix算法到769个癌细胞系的CRISPR-Cas9功能丧失筛选中，以识别细胞系间的差异依赖关系，并找到差异依赖关系与基因组改变和细胞类型特异标记的组合之间的关联。这些关联尊重通路内相互作用的位置和类型：例如，我们观察到对通路下游激活剂（例如 NFE2L2）的依赖增加，对通路上游激活剂（例如 CDK6）的依赖减少。SuperDendrix还揭示了数十种对谱系特异性转录因子的依赖，确定了依赖之间的癌症类型特异相关性，并使个体突变残基得到注释。0癌症生物学中的一个关键问题是识别癌细胞依赖于哪些基因来获得生长和存活优势。这一知识既有助于我们理解癌症的发展，也提示了治疗靶点。一些癌症必需基因被体细胞突变改变，因此通过高通量DNA测序进行鉴定，但其他一些癌症必需基因在癌症中很少或没有突变，比如特定于谱系的转录因子或主要调控因子。识别癌症必需基因的另一种方法是扰乱  invitro癌症模型中的基因，比如细胞系，并测量这种扰乱后的生长或存活情况。扰乱导致生存能力变化的基因揭示了潜在的癌症特异性遗传依赖关系。最近的技术，如全基因组混合RNAi或CRISPR失活筛选，实现了高通量的全基因组扰动筛选。诸如DRIVE和癌症依赖图（DepMap）等项目已将这些技术应用于数百种癌细胞系，并鉴定了在特定癌细胞系中必需的基因，通常称为条件必需基因或差异依赖关系。结合差异性依赖关系0在相同细胞系中的基因组改变与依赖性的关联揭示了一些特定上下文的依赖性，包括致癌基因上瘾和合成致死。0最近有几项研究试图系统地识别大规模RNAi和CRISPR数据集中差异依赖与基因组改变之间的关联。一组研究确定了差异依赖与单个基因组生物标志物之间的关联，重现了许多经典的致癌基因上瘾和合成致死相互作用，以及一些额外的关联。然而，限制为单一生物标志物会限制检测罕见基因组改变的关联，这些基因组改变在少数细胞系中发生，但与频繁突变的驱动突变扰乱了相同的癌症途径。0第二组研究确定了差异依赖与多个生物标志物集之间的关联。0Tsherniak等人使用随机森林分类器从基因组改变中预测DepMap数据集中的依赖性。然而，数千个报告的关联中，大多数是与基因表达标记和其他频繁事件相关的，这并不奇怪，因为分类器倾向于解释最频繁的关联。REVEALER和UNCOVER0《细胞基因组学》，2022年2月9日，100099，2022年作者。本文是根据CCBY许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）的开放获取文章。0ll0开放获取ll0是不足为奇的，因为分类器倾向于解释最频繁的关联。REVEALER和UNCOVER0利用这样的观察结果，即同一途径中的驱动突变在肿瘤间往往是相互排斥的，即很少有肿瘤在同一途径中有多个驱动突变。这些方法概括了早期识别癌症基因组中相互排斥突变集的方法。然而，REVEALER无法扩展到大规模屏幕的系统分析，而UNCOVER预测了数百到数千个质量通常未知的关联。在分析大规模RNAi或CRISPR屏幕时，虚假关联是一个重要挑战，因为表型（基因扰动）的数量和特征（基因组改变）的数量比样本数量大几个数量级。当搜索多个生物标志物集时，这一挑战进一步加剧，因为这类集的数量是庞大的，而最佳集是未知的。还开发了几种相关方法来识别基因组改变与药物反应实验中测得的癌症依赖之间的关联，包括LOBICO、CELLector和使用惩罚线性回归的其他方法0和随机森林。0我们引入了一种新算法SuperDendrix，用于识别与大规模干扰实验中的差异依赖相关的近似互斥的基因组改变和细胞类型特征集。SuperDendrix包括几个关键特点：（1）使用2组分混合模型识别和评分差异依赖的原则方法；（2）一种组合模型和优化算法，用于找到与差异依赖相关的特征集；和（3）一种模型选择标准，用于选择相关集的大小和一个健壮的统计检验，考虑样本间基因组改变的不同频率。我们应用SuperDendrix来识别癌症基因中的体细胞突变与DepMap48中769种癌症细胞系中的18,119个基因敲除的大规模CRISPR-Cas9敲除功能屏幕中的差异依赖之间的关联。我们确定了127个与突变集相关的差异依赖。其中许多关联分组成众所周知的癌症途径，包括NFE2L2、RB1、MAPK和Wnt途径。我们观察到差异依赖与途径内相互作用的拓扑结构和调控逻辑相一致。具体而言，我们发现包含途径上游的致癌突变的细胞系——无论是致癌基因的激活突变还是肿瘤抑制基因的失活突变——通常对同一途径中下游基因有增加的依赖性。这些关联将致癌基因上瘾的现象推广到了致癌基因途径上瘾。另一方面，我们发现途径下游的致癌突变通常与同一途径中上游基因的减少依赖性相关。当将癌症类型作为每个细胞系的附加特征时，SuperDendrix识别出了与突变和/或癌症类型特征相关的总共227个差异依赖，其中最突出的是0对于特定的细胞系，我们发现了对特定的转录因子的依赖性，并且发现了TCF3依赖性与患有BCL2突变的骨髓瘤或血液癌症之间的前所未有的关联。SuperDendrix软件可在https://github.com/raphael-group/superdendrix公开获取，并且Dep-Map数据集的结果可通过https://superdendrix-explorer.lrgr.io/的Web门户获取。0结果0SuperDendrix我们介绍了SuperDendrix，这是一种用于识别二进制特征集（例如基因组改变和/或细胞类型）的算法，这些特征集（大致上）是相互排斥的，并且与定量表型相关联。虽然SuperDendrix适用于任何定量表型，但在这项工作中，我们专注于全基因组CRISPR-Cas9功能丧失筛选后细胞存活能力变化的表型。SuperDendrix的输入如下。0细胞存活能力测量来自全基因组CRISPR-Cas9功能丧失筛选。我们将这些测量表示为表型矩阵P，其中P的每个条目pgj表示基因g被敲除时细胞系j的生存能力。这些分数中的每一个量化了细胞对基因的依赖性。我们将一个基因在细胞系间的依赖性分数（即P的行）称为依赖性概况。每个细胞系的体细胞改变清单。在这里，我们分析每个细胞系的体细胞错义和无义突变。（可选）每个细胞系的分类信息（例如细胞类型）。0SuperDendrix由三个模块组成（图1A）：（1）评分差异依赖性并选择基因组和细胞类型特征；（2）找到与差异依赖性相关的特征集；（3）评估关联的统计显著性。我们简要描述下面的三个模块。评分差异依赖性并选择基因组和细胞类型特征SuperDendrix中的第一个模块有两个步骤：（1）从依赖性分数中评分差异依赖性；（2）选择将要评估的基因组改变和细胞类型特征。在第一步中，我们为每个基因敲除（P的行）导出差异依赖性概况。该概况量化了基因敲除对每个细胞系相对于背景分布的影响大小。我们假设基因敲除的依赖性分数p g 1；.；pgn来自两个群体：不受敲除影响的背景群体和受敲除影响的响应群体。我们对依赖性分数p g 1；.；pgn拟合了一个两组分混合模型，并使用贝叶斯信息准则（BIC）决定分数分布是更适合于单组分还是双组分。在两组分拟合被优先选择的情况下，我们说细胞系对基因敲除g具有差异依赖性，或者基因g是差异依赖性。我们将组分1指定为具有更小02细胞基因组学2，100099，2022年2月9日0文章0开放获取dgj = log0.000.050.100.150.20−10−9 −8 −7 −6 −5 −4 −3 −2 −1 0123456789 10 11 120.00.10.2−7−6−5−4−3−2−1012345670.00.10.20.30.4−11−10 −9 −8 −7 −6 −5 −4 −3 −2 −101234560Sample alterationserocsC2Cell lines0.000050.00010.0650.10P-valueAlterationsCell linesGenesResponsiveBackgroundFrequencyCell linesDependency scoreNot alteredM1M2Multiple alterations0DensityIncreased dependencyDecreased dependencyIncreased dependencyDecreased dependencyCell linesCancer typeActivatingInactivatingOtherDecreased dependencyIncreased dependencyW(M)W(M)P[ W(M) ≤ W(M) ]Cancertypes^^GeneMutationAA changeCell linemissenseG12CACH-91missenseV600EACH-52nonsenseQ1367*ACH-3KRASBRAFAPCAlterationsCancertypesCell linePrimary diseaseSecondary diseaseACH-4ACH-5ACH-7LeukemiaLeukemiaColorectalAMLAMLSample information0.00.10.20.30.4−11−10 −9 −8 −7 −6 −5 −4 −3 −2 −1 01234567ResponsiveBackground0均值并定义差异依赖性分数，或2C分数，0Pr ð z gj  =  1 j p gj Þ对于细胞系j，作为后验的对数比率0细胞系j来自组分2（z gj = 2）的概率和细胞系j来自组分1（z gj = 1Þ的概率。因此，负2C分数表示生存能力下降，或对敲除增加依赖性。相反，正2C分数表示对敲除减少依赖性。我们假设少数细胞系对基因敲除具有响应，并因此将包含较少细胞系的组分称为响应组分，包含更多细胞系的组分称为背景组分。总之，我们说，其响应组分具有负分数的差异依赖性是增加依赖性，而其响应组分具有正分数的差异依赖性是减少依赖性。接下来，我们构建基因组改变和细胞类型特征矩阵A。该矩阵包含两种类型的特征。第一种类型是基因组改变特征。我们使用OncoKB数据库49来选择基因和突变定义这些特征。0癌症中具有注释角色的基因。对于OncoKB中的每个癌症基因，我们使用非同义体细胞突变的功能注释来创建三种突变特征：使功能增益的激活突变被合并为一个标记为GENE（A）的单一特征，使功能丧失的失活突变被合并为一个标记为GENE（I）的单一特征，而其余未注释的突变被合并为一个标记为GENE（O）的单一特征。A中的第二种特征是细胞类型特征。在此分析中，我们为分析的细胞系中代表的每种癌症类型构建一个二进制特征。根据定义，这些癌症类型特征在细胞系之间是相互排斥的。找到与差异依赖性相关的特征集SuperDendrix的第二个模块是一种严格而实用的组合优化算法，用于找到A中的特征子集M，这些特征子集（1）大致相互排斥并且（2）与增加（或减少）依赖性相关联。我们推导出集合M的SuperDendrix权重W（M），该权重结合了标准（1）和（2），并使用整数线性0依赖性得分02C配置差异依赖性0（2）找到相关的特征集0输入0显著关联0输出0（3）评估统计学显著性0M*0CTNNB1 GRB2 B0A0SuperDendrix0基因组和细胞类型特征0（1）评分依赖性并选择特征0M0模型选择0排列测试0依赖性得分0图1.SuperDendrix概述（A）SuperDendrix输入是来自CRISPR-Cas9筛选的基因敲除的依赖性得分、基因组改变，以及可选的细胞类型特征。在第一步中，SuperDendrix推导出差异依赖性-那些依赖性得分更适合由两个组分的混合分布构成的基因-并构建基因组改变和细胞类型特征矩阵。在第二步中，SuperDendrix找到最大化SuperDendrix权重W（M）的特征子集M*。在第三步中，SuperDendrix执行模型选择来定义对权重有实质贡献的特征子集M，并使用排列测试计算权重W（M）的统计显著性。输出的FDR（虚发现率）％0.2的关联包括特征与依赖性增加的关联（右上）以及特征与依赖性减少的关联（右下）。（B）来自DepMap数据的差异依赖性示例，这些依赖性是通过将依赖性得分与混合模型拟合而得出的。蓝色曲线是背景组分，红色曲线是响应组分。绿色虚线表示Tsherniak等人的6s标准，该标准仅识别对敲除具有响应的细胞系子集。BRAF和CTNNB1显示对敲除的依赖性增加，而PTPN11和GRB2显示依赖性减少。另请参见图S1。0细胞基因组 2，100099，2022年2月9日30文章0细0开放获取ll0程序（ILP）来找到最小（或最大）权重W（M*）的集合M*。评估关联的统计显著性SuperDendrix的第三个模块包括两个步骤。首先，模型选择步骤确定第二模块中找到的M*中特征的子集M，其中M中的每个特征都对权重W（M）有显著贡献。此步骤使用条件排列测试迭代地删除对权重W（M*）的贡献几乎与随机特征相同的特征。其次，排列测试评估集合M的统计显著性。由于细胞系中的体细胞突变数量差异很大（图S1），我们使用条件排列测试4，该测试条件是基因每个细胞系的突变数和每个细胞系的突变数。我们还开发了一个交互式工具，用于可视化和探索SuperDendrix结果，该工具可在https://superdendrix-explorer.lrgr.io/上获得。有关SuperDendrix算法的更多详细信息，请参阅STAR方法。0在DepMap中识别差异依赖和基因组特征我们使用SuperDendrix来分析ProjectDepMap中包含来自31种癌症类型的769个癌细胞系中的18,119个基因进行CRISPR-Cas9敲除功能筛选的Avana数据集（20Q2/5.20.2020）。DepMap为每个基因敲除在所有细胞系中提供了一个CERES依赖得分48。CERES得分在所有基因敲除中进行了标度，使得已知“必需”基因的中位数得分为1，而“无依赖”的基因的中位数得分为0。我们使用Tsherniak等人的“6s”标准19从CERES得分中定义了一组差异依赖，得到了2074个至少有一个细胞系的CERES得分至少比平均值低或高六个标准偏差的基因。我们将这2074个基因的CERES得分概况称为6s差异依赖（表S1）。SuperDendrix的第一个模块计算出511（25%）的6s差异依赖更适合于两成分混合模型。我们将这些基因称为双成分（2C）差异依赖（图1B，表S2）。这511个2C差异依赖包括446个增加依赖的基因和65个减少依赖的基因，并富集了108个GO分子功能50，51，包括蛋白结合、酶结合和催化活性（表S3）。此外，2C差异依赖中的88个在COSMIC癌症基因普查（CGC）52中（p %0.001）—包括BRAF、KRAS、NRAS和PIK3CA（图S2）—比非2C基因的比例显著更高（2C：17.2%，非2C：11.2%，p %0.001；双样本比例检验）。此外，2C差异依赖包括优先靶标的比例显著高—基于CRISPR筛选的基因敲除效应和生物标记相关性识别的差异依赖，由Sanger研究所20—比非2C基因（2C：29.0%，非2C：13.4%，p %0.001；双样本比例检验）高。与应用于相同数据集的正态性似然比检验（NormLRT）18识别的差异依赖相比，2C差异依赖对于优先靶标具有更高的精确度和召回率（见STAR方法中的与NormLRT的比较）。最后，我们发现不是2C差异依赖的6s差异依赖要么只包含少数异常样本（例如，86.8%的样本少于5个异常样本），要么具有单峰分布和大方差的依赖得分分布（图S3）。我们使用Cancer Cell LineEncyclopedia（CCLE）44中报告的767个769个DepMap分析的细胞系中的399,559个非同义编码突变来为SuperDendrix派生基因组特征。我们还将每个细胞系的注释癌症类型作为特征。SuperDendrix的第一个模块中的特征选择步骤产生了一个包含621个基因中的897个突变特征（76个激活和258个失活）的基因组改变矩阵，共计20,089个突变，跨越了767个细胞系。更多细节请参阅STAR方法。我们还使用不同的输入评估了SuperDendrix，包括DepMap提供的依赖概率和OncoKB获得的所有399,559个非同义突变，而不是使用897个突变特征（请参阅STAR方法中的CERES依赖概率的分析和SuperDendrix对所有非同义突变的分析）。0差异依赖不是2C差异依赖的要么只包含少数异常样本（例如，86.8%的样本少于5个异常样本），要么具有单峰分布和大方差的依赖得分分布（图S3）。我们使用Cancer Cell LineEncyclopedia（CCLE）44中报告的767个769个DepMap分析的细胞系中的399,559个非同义编码突变来为SuperDendrix派生基因组特征。我们还将每个细胞系的注释癌症类型作为特征。SuperDendrix的第一个模块中的特征选择步骤产生了一个包含621个基因中的897个突变特征（76个激活和258个失活）的基因组改变矩阵，共计20,089个突变，跨越了767个细胞系。更多细节请参阅STAR方法。我们还使用不同的输入评估了SuperDendrix，包括DepMap提供的依赖概率和OncoKB获得的所有399,559个非同义突变，而不是使用897个突变特征（请参阅STAR方法中的CERES依赖概率的分析和SuperDendrix对所有非同义突变的分析）。0突变与差异依赖之间的关联我们使用SuperDendrix来识别突变集和511个2C差异依赖之间的关联。SuperDendrix识别出91个单一突变和大约36组几乎互斥的突变，这些突变与127个差异依赖显著关联（FDR %0.2）（图2A和表S4）。其中113组与增加的依赖相关，14组与减少的依赖相关。许多这些关联是众所周知的依赖关系，包括肿瘤基因成瘾的例子（例如，BRAF（A）和对BRAF的依赖增加53）以及合成致死性（例如，ARID1A（I）和对ARID1B的依赖增加54）。我们发现，与这些显著关联的127个基因富集了Reactome数据库中注释的241个通路。550此外，16个关联分组成了三个众所周知的癌症途径（NFE2L2、RB1和MAPK）。我们在下面重点介绍了SuperDendrix在这些途径中的新发现。首先，SuperDendrix发现了一组三种突变{KEAP1(O)，KEAP1(I)，NFE2L2(A)}与对NFE2L2的依赖性增加之间的关联（图2B）。KEAP1-NFE2L2途径在癌症中频繁受到干扰，KEAP1失活突变或NFE2L2激活突变在超过30%的肺鳞状肿瘤中有报道。0NFE2L2(A)，KEAP1(I)或KEAP1(O)突变在767个DepMap细胞系中出现69次，其中包括31%（5/16）的肺鳞癌细胞系。此外，这三种突变几乎是相互排斥的，只有3/69的改变细胞系有多于一个突变（图2A）。NFE2L2在各种癌症中都是一个致癌基因，包括肺癌、胰腺癌、乳腺癌和胆囊癌，因此NFE2L2(A)突变细胞系对NFE2L2的依赖性增加符合致癌基因成瘾模型。细胞系中KEAP1失活突变对NFE2L2的依赖性增加符合KEAP1通过靶向NFE2L2进行泛素化降解来抑制NFE2L2的作用。因此，细胞系中KEAP1失活突变对NFE2L2的依赖性增加可以被视为致癌基因成瘾的另一种形式。这些关联04细胞基因组学2，100099，2022年2月9日0文章0开放获取−20−15−10−505ACBNFE2L2MutationNot mutatedNFE2L2(A)KEAP1(I)KEAP1(O)Multiple mutationsNumber of cell lines451563698CUL3RBX1KEAP1unannotatedfunctionalNFE2L2 2C scoreBTB/POZ domainBACKKelch_1Kelch motifKelch_1Kelch_1Kelch_1Kelch_10304665116 133161193 211 227 242278 294322350 365396 413 4294594-20-15-10-50510ARID1BBRAFCCND1CTNNB1DUSP4E2F3GRB2HRASKRASMAPK1NFE2L2NRASPIK3CAPTPN11RAF1SMARCA2STAG1TCF7L2CDK6FANCGMEF2B0123456−1.0−0.50.51.0−log10(P)FDR ≤ 0.2FDR > 0.2SetSingletonKEAP1(O)KEAP1(I)NFE2L2(A)0将致癌基因成瘾现象推广到致癌途径成瘾：21,22致癌途径中基因的突变赋予了同一途径中其他基因的强烈依赖性。需要注意的是，只有一小部分关联突变发生在CERES得分低于6s的细胞系中（图2B），这证明了SuperDendrix的2C差异依赖得分的优势。SuperDendrix报告的差异依赖性关联对于注释单个错义突变也是有用的。具体来说，KEAP1(O)特征中的一些突变（包括在OncoKB中未注释的错义突变）发生在对NFE2L2的依赖性增加的细胞系中。例如，KEAP1G364C突变在OncoKB中没有被报道为功能性突变，但0细胞系02C得分0依赖性增加0靶向泛素化NFE2L2激活的靶基因：开启0E3泛素连接酶复合物0KEAP1蛋白位置0依赖性增加 依赖性减少0SuperDendrix权重0图2.SuperDendrix在多个生物途径中识别突变和2C差异依赖性之间的关联（A）SuperDendrix权重和与突变显著相关（FDR≤0.2）的127个2C差异依赖性的p值。其中36个关联是多个突变的集合；例如，{KEAP1(O)，KEAP1(I)，NFE2L2(A)}是几乎相互排斥的突变集合，与对NFE2L2的依赖性增加相关联（B）（顶部）细胞系中NFE2L2的2C差异依赖性得分的瀑布图。细胞系按照关联突变集合{KEAP1(O)，KEAP1(I)，NFE2L2(A)}的状态进行着色。绿色虚线表示6s阈值。（底部）KEAP1-NFE2L2途径。实心圆圈表示途径上的基因，颜色表示它们的突变。绿色方框表示被敲除的基因。KEAP1失活突变与对NFE2L2的依赖性增加一致，符合KEAP1作为NFE2L2上游激活剂的作用。（C）KEAP1蛋白中错义突变的位置，这些突变被注释为其他。与对NFE2L2的依赖性增加相关的KEAP1(O)突变包括：BTB/POZ结构域中的两个突变（方框），这是KEAP1二聚化的重要结构域；一个Kelch结构域中的一个注释突变（方框），这个结构域介导与NFE2L2的相互作用；一个位于与NFE2L2相互作用的残基的突变（圈出）。橙色（紫色）氨基酸变化出现在具有独特（多个）KEAP1突变的细胞系中。三角形表示在UniProt中报告影响KEAP1-NFE2L2相互作用的突变的位置。另请参见图S2和S3以及表S2、S3和S4。0位于报道会破坏NFE2L2抑制的位置。另外两个突变位于BTB/POZ结构域，这是KEAP1二聚化和KEAP1-CUL3结合的重要结构域（图2C）。最后，突变R413L位于Kelch结构域，并且位于与NFE2L2的蛋白质相互作用界面，这表明该突变对KEAP1-NFE2L2相互作用具有很强的功能相关性。这些发现将这些突变列为功能验证研究的优先对象。其次，SuperDendrix识别出RB1失活突变与E2F3、CCND1和CDK6三个RB1通路成员的差异依赖的关联（图3）。我们发现携带RB1失活突变的细胞系对E2F3的依赖增加。活性的RB1结合并抑制E2F3转录因子的活性，RB1-E2F3复合物的解离导致E2F3启动靶基因的转录，促进G1/S转变。我们的结果表明，携带RB1失活突变的细胞系对E2F3活性高度依赖，这一现象类似于肿瘤通路对物质的依赖。另一方面，我们观察到携带RB1失活突变的细胞系与CCND1和CDK6的依赖减少相关联。这一关联与CCND1-CDK4/6复合物在失活RB1中的作用一致。携带RB1失活突变的细胞系不需要CCND1或CDK6来失活RB1，使得这些细胞系对CCND1和CDK6的敲除不太敏感。这些结果表明依赖的方向与通路中激活/失活的模式之间存在对应关系。类似于上述KEAP1-NFE2L2通路中的肿瘤通路依赖，我们观察到携带RB1失活突变的细胞系对下游转录因子E2F3的依赖增加。另一方面，我们观察到对RB1上游调节因子的依赖减少。第三，SuperDendrix发现了MAPK通路中12个差异依赖与约相互排斥的突变集合{BRAF(A)、KRAS(A)、NRAS(A)、HRAS(A)}的子集之间的关联（图4A）。这些包括已知的激活突变BRAF、KRAS、NRAS或HRAS与对应基因依赖增加之间的关联。其他涉及RAS基因的关联包括NRAS(A)与SHOC2依赖增加之间的关联，以及约相互排斥的突变集合{KRAS(A)、NRAS(A)}与RAF1依赖增加之间的关联。后者与RAF1作为RAS在MAPK通路中传导信号的介质的作用一致。0细胞基因组学2，100099，2022年2月9日50文章0ll0开放获取−20−15−10−505−15−10−505−20−15−10−50ll0致癌基因依赖0在MAPK通路中识别出的关联之一是BRAF(A)突变与MAPK信号通路其他下游成员（包括MAP2K1、MAPK1、MITF和DUSP4）的依赖增加相关联02C分数0CDK40G1/S转变0RB10CCND10CCND10CDK60细胞系0E2F30突0E2F30CDK602C分数0依赖减少0依赖增加0图3.SuperDendrix识别出突变与RB1通路中2C差异依赖的关联。RB1失活突变与对E2F3的依赖增加相关联，与RB1在失活E2F3转录因子中的作用一致（与图2B格式相同）。另一方面，RB1失活突变与对CDK6和CCND1的依赖减少相关联。这与CDK4/6-CCND1复合物在失活RB1的作用一致。另请参阅表S4。0与BRAF(V600E)黑色素瘤中对这些基因的条件依赖性的先前报告一致。70-72与DUSP4的依赖性增加的关联令人感兴趣，因为关于DUSP4在癌症中的作用有争议的报告。一方面，有报道称DUSP4是抑制核中ERK1和MAPK1（ERK2）活性的肿瘤抑制因子。73，74作为肿瘤抑制因子，预期DUSP4敲除会导致依赖性降低。另一方面，还有报道称结直肠癌中DUSP4的高表达0和皮肤癌76与RAS或RAF突变相关，这表明DUSP4的活性可能有助于这些癌症的发生。我们发现具有BRAF(A)的细胞系对DUSP4的依赖性增加与致癌作用一致。为了研究这些相互竞争的假设，我们调查了DUSP4依赖性与MAPK1之间的关系，因为DUSP4是MAPK1的负调节因子。我们发现，在具有BRAF(A)的细胞系中，DUSP4的依赖性得分与MAPK1的表达呈显著负相关（R：-0.32，p％0.01；皮尔逊相关性）（图4B）；即具有BRAF(A)和最高MAPK表达的细胞系对DUSP4的依赖性最高。相反，在没有BRAF(A)突变的细胞系中，DUSP4的依赖性和MAPK表达之间没有显著相关性（R：0.01，p =0.72）。这些观察结果与“金发女孩原则”77一致，该原则指出必须维持生物因子的精确水平才能保持强健，过量或缺乏致癌信号都会导致肿瘤退化。在这种情况下，由于BRAF(A)突变导致MAPK信号高度活跃，DUSP4对MAPK1的抑制在细胞系中最为重要。SuperDendrix还确定了突变集合与MAPK通路中PTPN11和GRB2的依赖性降低之间的关联。具体而言，我们发现具有KRAS(A)、BRAF(A)或NRAS(A)突变的细胞系对PTPN11的依赖性降低，以及对GRB2在相同细胞系中的依赖性降低。对PTPN11的依赖性降低与先前的报告一致，即具有RAS或RAF信号的细胞系对PTPN11的抑制不敏感。78虽然我们不知道先前有关GRB2的关联的报告，但有趣的是，这两种依赖性降低的蛋白质——PTPN11和06细胞基因组学2，100099，2022年2月9日0文章0开放获取−50510GRB2PTPN11SOSBRAFRAF1MAPK1DUSP4SHOC2MITFPTPN11GRB2RAF1KRASMITFMAPK1−20−15−10−505NRAS(A)48−20−15−10−505BRAF(A) 65−15−10−50NRAS(A)48−20−15−10−505NRAS(A)46KRAS(A)128Multiple mutations2−20−15−10−505BRAF(A) 65−20−15−10−50BRAF(A) 65−20−15−10−50BRAF(A) 65−20−15−10−505BRAF(A) 65−20−15−10−50510HRAS(A)140.02.55.07.5−5051015BRAF(A) NRAS(A)Multiple mutations61446KRAS(A)126BRAF(A) NRAS(A)Multiple mutations61446KRAS(A)126−20−15−10−505KRAS(A)1300GRB2——是导致RAS/RAF突变的上游激活剂。因此，具有RAS或RAF信号的细胞系对RAS信号的上游激活剂不敏感，类似于RB1缺失细胞系对上游调节因子CDK6和CCND1敲除不敏感的情况（图3）。除了上述三个通路中的成员之外，SuperDendrix还确定了其他成员之间的关联0同一蛋白质复合物中的相互作用以及其他癌症相关通路中的关联。蛋白质复合物中的关联包括对具有ARID1A(I)突变的细胞系对ARID1B的增加依赖性，对具有SMARCA4(I)突变的细胞系对SMARCA2的增加依赖性，以及对具有STAG2(I)突变的细胞系对STAG1的增加依赖性。通路中显著的关联包括Wnt通路中的关联。0与突变集合相关的CTNNB1的依赖性增加0DUSP40SHOC20细胞系02C分数0NRAS0MAP2K10MAP2K10DUSP4 CERES分数0MAPK1（log2TPM）0A0B0减少依赖0RAS0BRAF0HRAS0−2 −1 00R = -0.320R = 0.010图4.突变与MAPK途径中2C差异依赖之间的关联（A）SuperDendrix识别了BRAF、KRAS、NRAS和HRAS中大致互斥的激活突变与MAPK途径中12个差异依赖的关联（与图2B相同的格式）。激活RAS/RAF的突变与途径中十个下游基因的依赖增加相关。相反，这些相同的突变与两个上游激活RAS的基因PTPN11和GRB2的依赖减少相关。（B）MAPK1的表达与DUSP4的CERES依赖分数的相关性。具有BRAF激活突变的细胞系（红色点）显示DUSP4依赖分数与MAPK1表达呈负相关（R = -0.32，p <0.01），而在没有BRAF激活突变的细胞系中没有观察到相关性（R = 0.01，p = 0.72）。另请参阅表S4。0细胞基因组学2，2022年2月9日，1000990文章0ll0开放获取Cancer-type-specific differential dependenciesNext, we investigated associations between differential depen-dencies and cancer types. We augmented the mutation matrixwith 31 cancer-type features, each feature representing one ofthe 31 cancer types in the Avana dataset. We ran SuperDendrixon the augmented mutation matrix and identified 298 differentialdependencies that are significantly associated (FDR % 0.2) withmutations and/or cancer types (Table S6), with 227 of theseincluding at least one cancer-type feature in the association.Among the 227 differential dependencies that ar