免疫信息学评价分选酶C和E蛋白作干酪性淋巴结炎疫苗靶标，巴西研究结果

医学信息学解锁26（2021）100718评价分选酶C和E蛋白作为干酪性淋巴结炎疫苗靶标的免疫信息学方法费利佩·席尔瓦a，1，马塞洛·多斯桑托斯·巴尔博萨b， 1，桑迪普·蒂瓦里 c，努比亚·塞弗特a， c，瓦斯科·阿里斯顿·德卡瓦略·阿泽维多c，罗伯托·乔·梅耶·纳西曼托a，Thiago Luiz de Paula Castroa，c，Silencia Beutinger Marchioroa，b，*a巴西巴伊亚州萨尔瓦多巴伊亚联邦大学健康科学研究所免疫学实验室b大多拉多斯联邦大学，健康科学学院，多拉多斯，MS，巴西c巴西米纳斯吉拉斯州米纳斯吉拉斯联邦大学遗传、生态和进化系A R T I C L EI N FO保留字：伪结核棒状杆菌干酪性淋巴结炎分选酶蛋白疫苗免疫信息分析A B S T R A C T假结核棒状杆菌是一种兼性胞内病原体，可引起干酪性淋巴结炎，这是一种在小型反刍动物中具有兽医重要性的疾病。为了减少该病造成的经济损失，必须采取有效的预防措施。我们采用免疫信息学方法来评估分选酶C和E的免疫学特征。为此，我们进行了同源性分析，寻找T和B细胞表位，评估免疫原性能力，对毒性和变应原性，以及这些表位在不同C.假结核菌株。预测了该蛋白的三级结构，并与TLR-2进行了分子对接分析。还评价了两种分选酶的理化参数。观察到S酶C和E通过T淋巴细胞的特异性表位产生细胞免疫，通过B淋巴细胞的表位产生体液免疫，并且还表现出对Toll样受体2的高结合能力。我们筛选出6个分选酶C和2个分选酶E非致敏性和非致敏性表位，并证实它们与绵羊OVAR-N*0201等位基因的相互作用。我们的研究结果表明，分选酶C和E具有参与C。假结核感染，并可以作为免疫生物学候选人在预防干酪性淋巴结炎。1. 介绍革兰氏阳性致病菌表达可能与宿主细胞相互作用并在毒力中起作用的表面蛋白[1]。这些细菌使用分选酶半胱氨酸转肽酶将蛋白质共价连接到细胞壁并组装菌毛。基于结构特征和底物特异性，分选酶同源物被分为六类：A-F。每类分选酶识别不同的分选信号基序并执行不同的功能[2，3]。A类、B类和D类分选酶在厚壁菌门内的细菌中普遍存在，而E类和F类分选酶在放线菌中占优势。在厚壁菌门和放线菌门中发现的C类分选酶形成分选酶的第二大组，并且主要参与菌毛的组装[4革兰氏阳性细菌物种产生多种分选酶。由于它们在棒状杆菌属物种中的丰富性和保守性[7]，蛋白质是用于开发新疫苗或诊断的有希望的靶，所述新疫苗或诊断基于它们的结构，所述结构涉及通过宿主细胞模式识别受体将有毛细菌有效粘附到涉及先天免疫应答的细胞[8，9]。假结核棒状杆菌是一种革兰氏阳性致病菌，是兽医相关疾病的病原体，如干酪性淋巴结炎（CL），影响不同的动物物种，并对全球农业综合企业造成损害。到目前为止，还没有针对这种病原体的完全有效的治疗方法[10]。由于该病原体的不利影响，在过去十年中对其物种的几个基因组的序列分析[11]已经揭示了至少一个分选酶E的编码序列和两个或更多个分选酶C的编码序列。从C.结合先前的实验知识，发现两个基因簇编码参与分选酶介导的蛋白质，* 通讯作者。 巴伊亚联邦大学，健康科学研究所，萨尔瓦多，文学士， 巴西电子邮件地址：silmarchioro@hotmail.com（S.B.Marchioro）。1 两位作者对这份手稿的贡献相当。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100718接收日期：2020年11月24日;接收日期：2021年8月13日;接受日期：2021年8月24日2021年8月25日网上发售2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuF.M. Silva等人医学信息学解锁26（2021）1007182==+-+号粘附菌毛的聚合可能介导宿主组织的粘附，以促进额外的配体-受体相互作用和毒力因子的递送。研究了菌毛蛋白单体或菌毛聚合物对C.需要更好地评估假结核对宿主组织的影响以及它们的表达是如何控制的[12]。基因组测序工作已经确定了近一千个分选酶同源物，其功能才刚刚开始被发现。在细菌病原体中，C.白喉杆菌和炭疽杆菌具有C类分选酶基因，其编码含有LPXTG和基序特异性分选信号的成簇表面蛋白。这些基因编码菌毛的组分：粘附素和菌毛蛋白亚基。C类分选酶将粘附素和菌毛蛋白亚基连接在一起以构建菌毛[13E类分选酶主要由土壤和淡水栖息的放线菌表达，尚未被广泛研究。生物信息学预测表明，E类分选酶识别不寻常的LAXTG分选信号基序，其中高度保守的脯氨酸残基被丙氨酸取代[17]。在病原菌中，分选酶是潜在的靶标，因为许多分选酶都是潜在的靶标。在细菌表面展示的蛋白质在感染过程中起关键作用[2]。 由于缺乏有效的治疗方法， 对C. 假结核和缺乏分类酶的特征，C.假结核菌株，我们的特点分选酶C和E，并评估其作为可能的免疫目标控制CL的用途。2. 材料和方法整个工作流程的示意图如图所示。1.一、2.1. 数据的检索和选择对于所有计算机模拟分析，我们使用国家生物技术信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih）公布的序列。gov/protein/？术语）的 分 选 酶 C 和 C 的 E 。 假 结 核 ， 分 别 在 以 下 登 录 号 下 ：WP_013242727.1和WP_013242868.1。为了避免与可能的宿主同源的序列（其可能导致自身免疫），我们 使 用 BLASTp （ https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi ？ PAGEProteins）[18]，并验证了它们与山羊亚科（taxid：9963）基因组的同源性，因为绵羊和山羊属于同一亚科，可能受到CL的影响。考虑到 相 似 性 等 于 或 大 于 70% ， 覆 盖 率 大 于 或 等 于 40% ， 检 索 了Orthopathic字符串。2.2. 理化参数和细胞定位为了预测物理化学参数，使用来自EX PASy服务器的ProtParam[19]估计分选酶C和E的理论pI（等电点）、分子量、R和R（阳性和阴性残基的总数）、消光系数、不稳定指数（II）、脂肪族指数（AI）和总平均亲水性（GRAVY）通过使用SurfG工具基于亚细胞位置对分选酶进行分类。它在四个软件和集群上执行自动搜索，并将输入表征为细胞质、膜、潜在表面暴露或分泌[20]。进行隐马尔可夫模型搜索（HMMsearch）以预测基序和结构域信号[21]，使用LipoP来预测序列的脂蛋白[22]，使用SignalP来分析可能分泌或输出到一般分泌途径（SEC途径）中的靶氨基酸[23]。使用用于跨膜蛋白拓扑预测的隐马尔可夫模型（TMHMM）来预测具有跨膜螺旋和螺旋拓扑的序列[24]。2.3. 三级构造预测与精细化为了提供二级和三级结构以及3D模型，使用Phyre2 [25]。在通过Phyre2预测分选酶C和E的三级结构后，我们使用locPREFMD服务器[26]来细化结构。这位服务员使用轻松和积极的放松方法。使用MolProbity软件上实施的Ramachandran图评价模型[27]。使用TM-Align对3D细化模型进行比对，以验证一级、二级和三级结构的结构相似性[28]。所得到的模型与C.白喉，因为没有C.假结核分选酶C与分选酶C PDB代码5K9A比对，分选酶E与分选酶E PDB代码5UUS比对。2.4. 分选酶与TLR-2免疫受体的TLR-2受体的结构从RCSB PDB数据库（PDB ID：5d3 i）检索。对于所有结构编辑（去除配体和水分子）和分析，使用Discovery StudioBiovia（2021）。SwarmDock服务器（http://bmm.crick.ac.uk/SwarmDock/index.html）[29]用于进行分子对接并评估TLR-2与分选酶C和E之间的相互作用。SwarmDock生成低能构象并返回聚类对接的排名列表图1.一、选择最终表位的完整工作流程。F.M. Silva等人医学信息学解锁26（2021）1007183≤=≤≤姿势及其相应的结构。2.5. 表位预测2.5.1. 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免 疫 表 位 数 据 库 （ IEDB ） 分 析 资 源 （ http ：//tools.org/2014/04/04/04/04/04/04/04/04/04/04/04/）iedb.org/mhci/）用于预测分选酶蛋白质与小鼠MHC I等位基因之间的使用9聚体的长度进行预测，并且基于每个MHC等位基因的1%的百分位数排序进行选择[30]。IEDB的评价指出了将产生最佳结果的方法，如果数据不令人满意，则使用三种方法之间的共识该工具生成一个预测列表，每个预测都有一个分数，分数越低，被认为是更好的分析选项。如前所述，通过与OVAR-N*0201等位基因的分子对接证实了所选CTL 表 位 与 绵 羊 MHC I 的 相 互 作 用 [31] 。 从 IPD-MHC 数 据 库（ www.example.com ） 获 得 MHCI OVAR-N*0201 的 一 级 结 构https://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/allele/?登录号0LA 02433）。使用Discovery Studio 2018（BIO-VIA）制备用于对接的表位最后，使用SwarmDock服务器（http://bmm.crick.ac.uk/SwarmDock/index.html）[29]来进行引导的分子对接并评估MHC I OVAR-N*0201与所选分选酶C和E CTL表位之间的相互作用。2.5.2. 辅助性T淋巴细胞（HTLs）为了预测HTL表位，使用IEDB分析资源（http://tools.iedb.org/mhcii/）[32，33]。 百分位数秩10%用于预测可能的结合物[34，35]。在这项分析中，我们使用了工具上可用的三个MHC II小鼠等位基因，具有15肽长度的表位。2.5.3. B细胞表位使用分选酶的整个序列用BCPRED服务器预测线性B细胞表位固定长度表位为20肽，应用子序列核的新方法，准确度为75%[36]。软件中使用的参数是氨基酸之间的最小分数为0.5，最大距离为6 μ m。2.5.4. 细胞和体液表位免疫信息学方法预测的HTL和CTL表位均与线性B细胞表位重叠。因此，可能的体液和细胞表位进行编译，以寻找刺激体液和细胞免疫应答。我们使用了Tosta在2021年描述的内部Python脚本方法[37]。2.6. 表位抗原性、免疫原性、变应原性和毒性预测在 预 测 HTL 、 CTL 和 B 细 胞 表 位 之 后 ， 使 用 VaxiJen 2.0（ http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html ） 来确定具有良好抗原特性的表位。用于指示细菌靶标的这种质量的评分为0.40 [38]。IEDB分析资源（http://tools.iedb.org/immunogenicity/）用于预测表位的免疫原性水平，同时考虑理化性质和氨基酸位置[39]。因此，选择具有阳性免疫原性值的表位[40]。过敏原FPv.1.0（https://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/method.htmL/）用于预测过敏性和非过敏性表位[41]。将TOX-IPRED（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toX inpred/multi_submit.php）用于表位中的Toxicity分析[42]。2.7. 表位保守性和变异性分析我们分析了30种分选酶C的序列（WP_014401407.1，WP_013242729.1、WP_014300987.1、WP_013242727.1、WP_014523636.1 、 WP_032802609.1 、 WP_014367717.1 、WP_014524091.1、WP_014367694.1、WP_014558840.1、WP_048653482.1、WP_032802616.1、WP_014801016.1、WP_088238502.1、WP_050926151.1 、 WP_048589290.1 、 WP_048589292.1 、WP_048589309.1、WP_032802608.1、WP_058093290.1、WP_058093299.1、WP_058831600.1、WP_058832173.1、WP_058832174.1、WP_081352374.1、WP_072577949.1、OMH76836.1、1 、 WP_041481454.1 、 WP_0508591 20.1 、 WP_075142894.1 、WP_100086596.1 、 OMH76746.1 和 OMH 76857.1 ） 和 八 种 分 选 酶 E（ WP_013242868.1 、 WP_014655924.1 、 WP_041481454.1 、WP_050859120.1 、 WP_075142894.1 、 WP_100086596.1 、OMH76746.1和OMH77569.1）从不同的C. NCBI中描述的假结核菌株，并将它们与在研究的先前阶段中选择的分选酶C和E表位对抗。使用来自IEDB分析资源（http://tools.iedb.org/conservancy/）的表位工具预测肽的表位线性序列保守性[43]。3. 结果3.1. 数据的检索和选择使用C类（WP_013242727.1）和E类（WP_013242868.1）分选酶序列对山羊亚科的整个基因组进行BLASTp宿主同源性分析，结果显示没有蛋白质相似性。3.2. 理化参数和细胞定位用于预测分选酶C的理化参数的序列分析表明，该蛋白质具有接近中性的等电位（7.24）;也就是说，在其带负电荷的残基（36）和带正电荷的残基（36）之间存在平衡，并且其是高度可溶的蛋白质。然而，在分选酶E中，这些残基不平衡，表明它是一种潜在的不溶性蛋白质。GRAVY分析显示两种蛋白质均为阴性，表明蛋白质本质上是亲水性的通过Prot-Param分析的其他参数证实了GenBank数据库中提交的参数（氨基酸数量和分子量）（表1）。在分选酶C和E中未发现信号肽或脂蛋白。TMHMM结果显示，分选酶C存在两个螺旋跨膜结构域，而分选酶E仅存在一个结构域。分选酶C中HMMsearch、LipoP和SignalP的阴性结果添加到TMHMM中的阳性和具有细胞外拓扑结构的具有超过100个氨基酸的环，并产生将该序列分类为潜在暴露于表面的输出。分选酶E的分析在HMMsearch、LipoP和SignalP中给出阴性结果，并添加到TMHMM中的阳性结果;此外，具有少于50个氨基酸的N-末端具有细胞外拓扑结构，并产生将该序列分类为膜蛋白的输出（表1）。3.3. 三级构造预测与精细化的分选酶的三级结构预测Phyre2。分选酶C和E的预测在正常模式下进行，并且在模型中具有100%的置信率，并且由loc-PREFMD服务器处理以提高模型质量（图2A和B）。通过Ramachandran图验证了结构。在分选酶C中，87.7%的残基被发现在有利的区域中，8.5%的残基在允许的区域中，并且仅3.8%在异常区域中。观察到分选酶E在有利区域中具有89.1%的残基，在允许区域下具有9.2%的残基，并且在异常区域中仅具有1.7%的残基3.4. 分选酶与TLR-2免疫受体的TLR-2对接和分选酶C分析（图3A）显示TLR-2之间的相互作用的117种可能的模型，并且基于最小能量值（~ 34.47）考虑最佳对接的一致性。所有的F.M. Silva等人医学信息学解锁26（2021）1007184-表1理化参数和跨膜螺旋的存在，肽信号，脂蛋白的预测，分选酶C和E的细胞定位分析。理化性质分选酶C分选酶E数目的氨基酸319295分子量（Da）3584932057理论pI7.245.47带负电荷残基总数（Asp3635+Glu）最小能量值（38.22）。 图3D中突出显示了所有相互作用。我们选择的一些表位参与TLR2与C和E分选酶之间的相互作用（图1B）。 3）。3.5. 分选酶蛋白的表位预测3.5.1. 细胞毒性T淋巴细胞IEDB服务器预测CTL表位，其中10个较高评分的序列是每只MHC I小鼠的在分选酶C中，60个表位低于临界值的被预测为良好的粘合剂，而在分选酶中，带正电荷残基总数（Arg+赖氨酸）EX着色系数36 2558900 26930E，预测80个表位低于截止值。所有预测肽均在补充材料- S1中提及ABS. 0.1%（=1克/升）1643 0.840不稳定指数38.97 31.50亲水性的总平均值分析（预测因子）分选酶C分选酶E信号肽（HMMsearch）否否脂蛋白（LipoP）否否3.5.2. 辅助性T淋巴细胞通过IEDB服务器预测小鼠的HTL表位，其具有15肽长度。基于建立的百分位等级，分选酶C具有53个表位，并且发现分选酶E具有低于百分位等级的22个表位。阈值（补充材料SEC途径分泌的蛋白质（SignalP）跨膜螺旋数量X（TMHMM）不不2 13.5.3. B细胞在线性B细胞表位的预测中，发现了7个表位循环次数跨膜螺旋X1长度23 aa 23 aa跨膜螺旋x2长度23aa环1长度217aaC_out长度0 0N_out长度0 39 aa对于分选酶C和对于分选酶E的八个线性表位（补充材料分析还显示分选酶C的六个不连续表位和分选酶E的两个不连续表位（补充材料图4A示出了分选酶C中具有高ElliPro评分（黄色）的残基的序列位置，如Ponomarenko等人潜在表面分类EX posed膜（2008）[44]，有助于抗体反应性表位。 图4B显示分选酶E中具有高ElliPro评分的残基位置（黄色）。B细胞构象表位和分选酶蛋白的三维结构可能的相互作用在图3C中突出显示。E类分选酶的分析（图1B）。图3B）显示了TLR-1和TLR-2之间相互作用的117种可能模型。2 和 的 最佳停靠 构象 是 认为 根据 到如图5所示。图二. 多表位分选酶的建模和改进。A：由Phyre2服务器生成并由locPREFMD优化的分选酶C的三级结构。B：由Phyre2服务器生成并由locPREFMD精制的分选酶E的三级结构。通过Ramachandran图验证分选酶的三级结构：C：分选酶C的Ramachandran图D：分选酶E的Ramachandran图F.M. Silva等人医学信息学解锁26（2021）1007185图三. 使用SwarmDock服务器的配体-受体对接复合物。A：分选酶C（配体，紫色），而TLR-2（受体，蓝色）。B：分选酶E（配体，紫色），而TLR-2（受体，蓝色）。C：分选酶C（五边形）和TLR 2（圆形）的氨基酸之间相互作用的图示。D：分选酶E（五边形）和TLR 2（圆形）的氨基酸之间相互作用的图示。* 绿色五边形代表表位中存在的表位残基。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版3.6. 细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞表位的筛选在根据所需特征过滤后，8个表位（6个分选酶C和2个分选酶E）被认为是非毒性的、非过敏性的，并且具有免疫原性潜力。我们将这些表位与B细胞表位重叠，分析结果显示分选酶C有4个CTL表位，分选酶E有2个。对所得表位进行对接以确认与MHC 10 VAR-N *0201的相互作用（表2和图1B）。6）。MHC-N *0201与OVAR-N* 0201的对接结果显示，MHC-N*0201的Ser72、Asn 65、Trp 146、Thr 69、Trp 113、Lys 145、Asn 76、Trp 96、Arg 162、Tyr 158、Thr 79、Tyr 6和Tyr 83残基与所测试的表位的相互作用更频繁;其中Tyr 6、Phe 73、Tyr 83、Lys 145、Trp 146和Tyr 158在其它31个绵羊MHC I等位基因中高度保守。表位与N*0201之间的所有相互作用见补充材料预测的HTL表位也与B细胞表位重叠，并且该分析返回了分选酶C的8个HTL表位和分选酶E的9个HTL表位，其在其序列中具有B细胞表位的一部分（表3）。对所选的B细胞、CTL和HTL表位与C和E分选酶的其他序列进行保守性分析（表3）。所有表位的保守性分析结果见补充材料S5和S6。表3C和E分选酶的重叠B和辅助T淋巴细胞（HTL）表位，以及分选酶之间的保守性。HTL表位中存在的B细胞表位加下划线。4. 讨论在本研究中，我们从C.假结核这些蛋白质序列被提议作为疫苗成分以规避C.假结核病来逃避免疫系统据我们所知，这是第一个假设分选酶是开发干酪性淋巴结炎疫苗的重要候选物的研究。先前的研究使用了基于使用计算机工具选择的表位的疫苗学方法，试图用最多样化的病原体规避这种方法的挑战[31，45]。我们利用一个基于表位的方法来证明C和E分选酶是潜在的靶标，无论是在它们的整体中还是在可能的亚基或多表位疫苗中。我们评估了C和E分选酶的结构和理化性质，以推断这些蛋白质的疫苗学潜力。根据我们的数据，分选酶C是一种潜在的表面表达蛋白，分选酶E是一种膜蛋白;这两种蛋白都是可能的抗原，由于它们与宿主的相互作用，使它们成为有趣的疫苗学靶标。我们还进行了分选酶和TLR-2之间的蛋白质-蛋白质对接。TLR是先天免疫受体，在识别和结合病原体相关分子模式、启动信号传导途径并导致先天免疫应答中发挥关键作用[46]。TLR2分析生成了一个模型，该模型为疫苗学研究的连续性提供了更一致和相关的相互作用。在分选酶和TLR 2之间观察到的相互作用表明分选酶可以诱导1型辅助T细胞（Th1）和Th2细胞，并间接导致抗体产生或细胞免疫应答[47]，可能产生能够中和C. 假结核除了B细胞表位外，已知T淋巴细胞还发挥免疫调节作用。在刺激细胞免疫应答中起重要作用，直接作用于细胞内或兼性细胞内生物，如C.假结核[48-50 ]。因此，进行了分选酶C和E中线性和构象B细胞表位以及线性CTL和HTL表位的预测分析。通过蛋白质序列的表位预测分析，我们鉴定了10个具有分选酶C的相关评分的B细胞表位和8个分选酶E的表位，以及从IEDB小鼠数据库中的分析产生的数十个表位。为了选择具有最大疫苗学潜力的表位，我们过滤了具有以下特征的表位：i）与MHC的强结合，ii）非过敏性和非毒性表位，iii）潜在的抗原性和免疫原性表位，以及iv）在T细胞和B细胞之间具有重叠的表位;因此，仅少数相关候选物保留为可能的疫苗靶标。我们用绵羊MHC I等位基因（OVAR-N*0201），并观察到先前在棒状杆菌属物种中选择和保守的六个潜在表位（四个用于分选酶C，两个用于分选酶E）之间的稳健相互作用。我们还选择了F.M. Silva等人医学信息学解锁26（2021）1007186见图4。蛋白质一级结构中表位存在的图示，峰（黄色）表示可能的表位，红线表示阈值。A，分选酶C; B，分选酶E。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本图五. 分选酶C和E中B细胞表位的定位。A：C类分选酶的3-D结构，其中不连续表位以蓝色、紫色和橙色突出显示。B：E类分选酶的3-D结构，其中不连续表位以绿色和粉红色突出显示。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版分选酶C和分选酶E各5个B细胞表位，并与来自HTL（8个分选酶C和9个分选酶E）和CTL（4个分选酶C和2个分选酶E）的表位重叠。这些分析使我们能够选择具有激活T和B细胞并防止C.假结核感染在LC中，感染动物具有复杂的免疫病理状态，包括体液免疫和细胞免疫F.M. Silva等人表7医学信息学解锁26（2021）1007187C和E分选酶的重叠B和CTL表位被预测为可能的非过敏原、非毒性、免疫原性和抗原性;通过对接由MHC I OVAR确认识别;以及分选酶之间的保守性CTL表位中存在的B细胞表位加下划线。分选酶C（WP_013242727_1_）细胞B表位CTL表位等位基因潜在疫苗CTL表位OVAR-N*0201相互作用保守性分析MHC表位E-总序列，100%身份最小恒等式YAKIDNSTPKVVHEAWDAARAAAEYAKI H-2-Qa1;H-2-Dd RAAAEYAKI 24 8-26.43 23.33%（7/30）33.33%RAAAEYAKI H-2-Qa1KQQRAAAEY H-2-Qa1;H-2-Dd KQQRAAAEY 17 9-17.25 23.33%（7/30）33.33%KQQRAAAEY H-2-Qa1TGHTGIPTATLFDNLNRVKE EGDAFFIHI H-2-Dd EGDAFFIHI 23 9-22.81 40. 00%（12/30）33.33%RVKEGDAFF H-2-Qa1 RVKEGDAFF 22 9-19.17 40. 00%（12/30）33.33%分选酶E（WP_013242868_1_）NNQLQNQWDNERVNPRKKIA AQNEANNQL H-2-Kd，H-2-Kk，H-2-Qa1YSSVSGRYITTPGDVNTISSTTPGDVNTI H-2-Db，H-2-Dd，H-2-Qa1AQNEANNQL 22 7-9.43 100.00%（8/8）100.00%TTPGDVNTI 25 8-5.3 100. 00%（8/8）100. 00%见图6。使用SwarmDock服务器的相互作用表面和配体-受体对接复合物，用于MHC I OVAR-N*0201和表位之间的相互作用。黄色，MHCIOVAR-N *0201;蓝色，表位。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本反应相关的细胞因子的产生，无论是在原发性以及继发性感染[49，51]。对所有预测表位的保守性分析导致了大多数表位的有希望的结果，这是寻找疫苗学靶点的非常重要的数据。观察到分选酶E的选定表位是最保守的，在两个CTL中为100%，在HTL中为 93%（最小值表位，在所有分析的序列。对于分选酶C，表位保守性表明较低的值，尽 管 在 C 的 不 同 基 因 组 中 发 现 了 大 量 的 分 选 酶 C 序 列 。pseudotuberculosis）中的30条分选酶C序列和8条分选酶E序列。在来自分选酶C的两个CTL和一个HTL表位中，在30个评估序列中的12个中发现100%的同一性。这些结果表明，许多F.M. Silva等人医学信息学解锁26（2021）1007188表3C和E分选酶的重叠B和HTL表位，以及分选酶之间的保守性HTL表位中存在的B细胞表位加下划线。33.33%这些表位在分布于世界上大多数不同地区的不同菌株中是保守的，使它们成为用于疫苗开发的有希望的靶标[52]。虽然本研究预测的抗原表位可能诱导较强的抗C.假结核，一些局限性需要强调。最重要的限制与小鼠对绵羊MHC I的充分性有关;尽管我们已经表明，6个表位与一个绵羊等位基因（OVAR-N * 0201）相互作用，但31个以上的等位基因和数千个其他表位可能对针对绵羊MHC I的疫苗学应答很重要。C.假结核另一个限制与TLR2分析有关，因为它不是对特定区域或表位进行的，这在开发多表位疫苗时是期望的。5. 结论CL对畜牧业造成损害和损失;因此，迫切需要一种有效的疫苗，绕过细菌逃避免疫系统的能力。两种分选酶都表现出与体液和/或细胞介导的免疫应答的最终产物结合的高潜力，这可能诱导针对C.假结核然而，必须通过在山羊和绵羊中的研究来评估它们的有效性和安全性作者贡献概念化，FMS，MSB和SBM;方法学，FMS，MSB，ST和NS;正式分析和调查，FMS，MSB，VACA，RJMN和TLPC;原始草案的准备，FMS，MSB，ST，NC，VACA和RJMN;审查和编辑，RJMN，TLPC和SBM;资金获取，SBM;监督，SB。所有作者都阅读并批准了最终手稿。资金这项工作得到了保护和预防残疾基金会的支持竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认一个也没有。附录A. 补充数据本文的补充数据可在https：//doi网站上找到。org/10.1016/j.imu.2021.100718。引用[1] Selvaraj C，Priya RB，Singh SK. E探索分选酶在革兰氏阳性病原体中生物膜形成中 的 生 物 学 和 结 构 架 构 。 Curr Top Med Chem2018;18 ： 2462-80.https://doi.org/10.2174/1568026619666181130133916网站。[2] Jacobitz AW，Kattke MD，WereszczynskiJ， Clubb RT. 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Silva等人医学信息学解锁26（2021）1007189+[13] Ton-That H，Schneewind O.白喉棒状杆菌表面菌毛的组装。分子微生物学2003;50：1429-38. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2003.03782. X.[14] Mandlik A，Swierczynski A，Das A，Ton-That H.白喉棒状杆菌利用特异性小菌毛蛋白靶向人咽上皮细胞。Mol Microbiol 2007;64：111-24.https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.05630. X.[15] Bu