高通量、多指标等温扩增平台快速检测19种常见呼吸道病毒

工程6（2020）1130研究冠状病毒疾病2019-文章高通量、多指标等温扩增平台快速检测SARS-CoV-2等19种常见呼吸道病毒邢万里a，b，c，#，刘莹莹b，d，#，王慧丽e，#，李尚林a，#，林永平f，陈雷g，赵燕h，双超i，黄小兰j，葛少麟b，d，邓涛c，赵田b，d，李宝莲b，d，王汉波b，d，王磊b，d，宋云鹏c，金荣华k，何建兴l，赵秀英m，刘鹏a，李伟民n，李伟，Jing Chenga，b，da清华大学医学院生物医学工程系，北京100084b北京生物芯片技术国家工程研究中心，北京102206c首都生物技术有限公司，北京101111，中国d首都生物技术股份有限公司，北京102206，中国e清华大学医学院基础医学系，北京100084广州医科大学附属第一医院检验科，广州510120g四川大学华西医院神经内科，成都610041h首都医科大学附属北京佑安医院检验中心，北京100069i中国北京102218清华大学临床医学院北京清华长庚医院儿科首都儿科研究所实验中心，北京100020k首都医科大学附属北京佑安医院院长l中国呼吸疾病临床研究中心呼吸疾病国家重点实验室心胸外科，广州呼吸卫生研究所广州医科大学附属第一医院，广州510120m清华大学临床医学院北京清华长庚医院检验科，北京102218n四川大学华西医院呼吸与危重症医学科，成都610041阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年6月28日修订2020年7月21日接受2020年9月5日网上发售保留字：2019冠状病毒病严重急性呼吸综合征冠状病毒2型微流控核酸检测等温扩增A B S T R A C T快速准确地诊断并立即隔离感染严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的患者本文介绍了一种高通量、多指标核酸等温扩增分析仪（RTisochipTM-W），该系统采用离心式微流控芯片，在90 min内对16个样本中的19种常见呼吸道病毒（包括SARS CoV-2）进行了单次检测。RTisochipTM-W系统具有重复性好、鲁棒性强、特异性高等优点。最后，我们使用RTisochipTM-W系统分析了201例临床前样本、14例COVID-19阳性样本、25例临床诊断样本以及614例来自呼吸道感染患者或疑似患者的临床样本。检测结果与参考结果吻合较好，反映了呼吸道传染病的流行特征。 RTisochipTM-W与参考试剂盒检测SARS-CoV-2的符合率为98.15%。基于这些广泛的试验，我们相信RTisochipTM-W系统为抗击COVID-19大流行提供了一个强大的平台©2020 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。*通讯作者。电子邮件地址：pliu@tsinghua.edu.cn（P. Liu），weimin003@163.com（W. Li），jcheng@tsinghua.edu.cn（J. Cheng）。#这些作者作为本作品的第一作者做出了同样的https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.07.0152095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng-W. Xing等/ Engineering 6（2020）1130-114011311. 介绍由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行正在全球迅速蔓延[1]。作为截至二零二零年六月二十六日止，尽管全球多个国家采取严格限制措施，188个国家及地区已报告超过947万宗COVID-19确诊病例，导致约48万人死亡。由于目前还没有针对COVID-19的有效药物或疫苗，因此对SARS-CoV-2感染者的快速诊断和隔离被认为是抑制持续流行的最有效方法。不幸的是，COVID-19与流感和感冒有许多共同的症状，如发烧、干咳和肌痛或脂肪[2]。因此，在对抗COVID-19的斗争中，非常需要用于区分新型冠状病毒与其他常见呼吸道病毒的可靠诊断工具。到目前为止，已经开发出多种基于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的核酸检测试剂盒，并在临床诊断COVID-19中发挥核心作用[3，4]。然而，这些RT-PCR试剂盒通常很耗时，只能检测SARS-CoV-2，并且偶尔会由于采样或灵敏度问题而产生假阴性结果。在临床实践中，经RT-PCR检测为SARS-CoV-2阴性，但持续出现COVID- 19样症状的患者，如果治疗不当，仍会消耗大量宝贵的医疗资源，交叉感染风险很高。因此，迫切需要开发一种诊断工具，不仅可以快速检测SARS-CoV-2，而且可以准确识别其他常见的呼吸道病毒，如流感病毒、人副流感病毒（HPIV）等[5-多重RT-PCR能够检测多种类型的病毒将所有的引物混合在一个试管中然而，由于这些混合引物的不可避免的干扰和用于检测的可用荧光团的有限数量，开发稳健的多重系统是极其困难的，并且检测到的靶标的数量通常限于每个反应少于10个[8]。打破这一限制的最有希望的方法之一是通过将不同的引物对物理隔离到指定的隔室中，将多重聚合酶链反应（PCR）转化为在过去的几十年中，微流控技术已经成为实现样品分配策略而不引入额外的手动操作的在各种微流体技术中，例如我们的小组先前开发了一种在具有单通道的紧凑型仪器中操作的盘形离心微型装置（每次运行仅测试一个样品），并且通过在单个芯片上使用环介导等温扩增（LAMP）检测13种呼吸道病原菌来证明该系统的优异的多重能力[19]。然而，当检测到病毒时，由于热循环和引物设计问题，RT-PCR和LAMP都不适合与微芯片一起使用还发明了几种其他微流体系统，包括FilmArray®和Verigene®，用于多重病原体检测，并具有与样品制备整合的优势[20不幸的是，目前还没有微流控系统用于区分SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒的报道基于核酸序列的扩增（NASBA）是一种基于酶的等温扩增方法，其采用逆转录酶、核糖核酸酶（RNase）H、T7核糖核酸（RNA）聚合酶、两种特殊设计的引物和一种特殊设计的探针的混合物[23，24]。在NASBA的初始反应阶段，引物1与单链RNA退火，合成互补的脱氧核糖核酸（cDNA），并形成RNA：DNA杂合体。随后，RNase H水解RNA链并产生单链DNA。与引物2退火后，逆转录酶合成具有可被T7RNA聚合酶识别的启动子区的双链DNA[23，24]。一旦产生具有启动子区的双链DNA，反应就进入RNA：DNA杂合体中RNA的转录、逆转录和水解的连续循环[23由于在转录的每个步骤中可以产生10作为一种等温扩增方法，NASBA具有稳健性、特异性，特别适用于检测单链RNA，但不适用于双链DNA[23，27]。在目前的研究中，我们展示了一种高通量、多指标核酸等温扩增分析仪（RTisochipTM-W）基于我们的圆盘形离心微流控技术，具有两个主要改进。首先，我们选择NASBA，这是一种有效且灵敏的等温RNA扩增技术[23，26，28，29]，以取代不相容的PCR和LAMP来检测离心微芯片中的病毒。其次，我们设计了一个由16个单通道子模块组成的阵列，这些子模块是在以前的单通道仪器的 基 础 上 更 新 的 ， 以 增 加 系 统 的 吞 吐 量 。 因 此 ， 这 种 全 新 的RTisochipTM-W系统能够在90分钟内从16个临床样本中检测19种常见呼吸道病毒，包括SARS-CoV-2。我们的系统的出色性能，通过当前研究中的全面表征得到证明，促使我们设想这种RTisochipTM-W系统在抗击COVID-19大流行中发挥关键作用2. 材料和方法2.1. 样品收集和RNA提取含有靶向病毒序列的质粒由Sangon Biotech（Shanghai）Co.，根据制造商的说明书，使用HiScribeTMT7高产量RNA合成试剂盒（NewEngland BioLabs，USA）通过体外转录制备RNA模板。所有灭活病毒培养原液均由广州医科大学附属第一医院钟南山博士赠送。在患者知情同意的情况下，于2018-2020年期间从北京清华长庚医院、首都儿科研究所、广州医科大学附属第一医院、四川大学华西医院和首都医科大学北京佑安医院采集临床样本用DNA植绒拭子（93050，Miraclean Technology Co.，有限公司、China）通过在喉部旋转拭子尖端以收集细胞材料;然后将拭子置于病 毒 转 运 培 养 基 （ MT 0301 ， Youkang Hengye Biotechnology（Beijing）Co.，有限公司、中国）。将拭子尖端浸入病毒转运培养基几秒钟后，将拭子尖端末端折断，将样本保持在70 °C下长期储存。使用TRIzolTM试剂（Invitrogen，USA）或QIAamp®病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen，Germany）按照制造商的说明书西街1132号 邢 等/工程 6 （2020）1130根据用户操作手册，用KingFisherTMFlex纯化系统（Thermo FisherScientific，USA）进行自动RNA提取。将提取的RNA溶解在不含RNA酶的水中，并使用Nanodrop 2000或Qubit定量。3.0（均来自Thermo Fisher Scientific，USA）。使用1%甲醛变性凝胶电泳检查RNA的完整性。2.2. 引物设计和NASBA反应我们的系统可以检测到的常见呼吸道病毒包括SARS-CoV-2（S和N基因），甲型流感（H1N1，H1N1 2009，H3 N2，H7N9），乙型流感，呼吸道合胞病毒（RSV），人偏肺病毒（HMPV），HPIV 1，HPIV 2，HPIV 3，HPIV 4，人鼻病毒（HRV），肠道病毒71（EV71），柯萨奇病毒A16（CA 16），柯萨奇病毒A6（CA 6）、人冠状病毒（HCoV）-229E/NL63和HCoV-OC 43/HKU 1。NASBA是一种等温扩增技术，用于病毒RNA的芯片检测。NASBA引物和探针使用Primer Premier v.5.0 软 件 （ Premier Biosoft ， USA ） 设 计 并 由Sangon Biotech（shanghai）Co.有限公司、中国引物和探针序列见附录表S1A.我们还对每种病原体的引物和探针进行了覆盖率分析;结果见附录A的补充数据2。我们下载了10个最近发表的每种病原体的完整全基因组序列，以进行覆盖率分析。总体而言，本系统设计的引物和探针具有很好的覆盖性。 例如，对于H1N12019年，引物和探针与最近发表的10个完整的全基因组序列完全匹配，表明我们选择的引物和探针设计区域非常保守。 在芯片上NASBA测定中，将总共1μ L含有每组引物和探针的自制点样溶液移液到每个相应的反应室中，并在室温下完全干燥。在分析过程中，将含有16.5μ L缓冲溶液、13μ L核苷三磷酸（NTP）溶液、5.5μ L酶混合物（均来自CapitalBio Technology，China）和20μ L RNA模板的总共55μ L总NASBA混合物在管中混合，然后注入芯片用移液管2.3. 微流控芯片的设计与操作本课题组此前已报道了用于检测19种呼吸道病毒的微流控芯片[30，31]。简而言之，如图1（a）所示，盘形微流体芯片具有62mm的直径和0.6 mm的厚度;它由通过双面胶带连接的结构层和薄覆盖层组成。结构层包含24个反应室（每个反应室直径为3mm，深度为0.2mm），每个反应室的体积为1.45μ L，24个缓冲池，正弦形主通道（宽度为0.2mm，深度为0.1mm），入口和出口。每个反应室通过缓冲池和短管连接到主通道结构层由聚碳酸酯材料通过精密注射成型制造，得到粗糙度小于10μ m的光滑表面如图所示Fig. 1.呼吸道病毒检测圆盘型微流控芯片的设计与工作流程。(a)微流控芯片示意图;（b）芯片上每种靶向病毒和对照的指定反应室布局;（c）NASBA的机制;在非循环阶段，引物1与靶序列退火，形成RNA：DNA杂交体。RNA酶H水解来自该RNA：DNA杂合体的RNA;接下来，引物2退火至单链DNA（ssDNA）并通过逆转录酶（RT）合成双链DNA（dsDNA）;在循环阶段，反应重复从dsDNA模板转录RNA、合成cDNA、水解RNA：DNA杂合体中的RNA链和形成dsDNA的循环;（d）病毒检测的工作流程从左至右：接收灭活的临床样本，从样本中提取RNA，将试剂加载到芯片中，用胶带密封芯片，将芯片加载到仪器中，将试剂分配到芯片上的反应室中，在RTisochipTM-W系统中进行扩增和检测W. Xing等/ Engineering 6（2020）1130-11401133图如图1（b）所示，将每组NASBA引物和探针移液到指定的反应室中并在室温下干燥。此外，将具有一对靶向甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的引物的人基因组DNA将酿酒酵母的质粒连同相应的引物和探针一起用作阳性对照（PC），并且将无菌的无核酸酶的水用作阴性对照（NC）。在预固定底漆之后，通过双面胶带将结构层和覆盖层密封在一起，并用压机压制。每个芯片单独真空包装并在使用前储存在-20 °C下。NASBA的作用机制如图所示。 1（c）和整个ana-RTisochipTM-W系统的裂解过程如图1（d）所示。简言之，在采集咽拭子样本后，使用市售核酸提取试剂盒从临床样品中提取RNA，并与NASBA的反应混合物混合，而不使用引物和探针。然后，通过入口孔将总共55μL的混合物移液到微芯片中以填充主通道。之后，用两片胶带密封入口和出口。一旦将芯片装载到仪器的托盘中，并点击控制程序中的开始按钮，系统将自动执行其余程序。首先将芯片以6000转/分钟（rpm）的速度旋转两个时间段：首先旋转10秒，然后在间隔120秒后再次旋转30秒，导致试剂从主通道装载到24个反应室中。 接着将微流体芯片在41°C下孵育35分钟。在此期间，检测扩增产物产生的荧光信号并实时显示在计算机屏幕上。2.4. 用于呼吸道传染病分析的微流控仪器RTisochipTM-W由四个相同的子模块组成，每个子模块都可以控制和检测微流控芯片。 四个分析仪可以堆叠起来，形成一个16通道系统，由一台计算机控制（图1）。 2（a））。 如图如图2（b）和（c）所示，子模块主要由电机、控制面板、电源模块、温控模块、检测模块和通信模块组成。控制面板控制电机的旋转、微流控芯片的进入/退出以及所有其他模块。比例-积分-微分（PID）温度控制器提供核酸扩增所需的温度。光学检测系统实时监测反应室中的荧光信号。荧光数据同时发送到计算机，计算机通过通信模块与路由器连接。3. 结果3.1. RTisochip TM-W系统中RNA提取方法的优化从临床样本中提取RNA作为分析的第一为了选择合适的RNA提取方法，我们比较了TRIzolTM通用总RNA提取试剂盒和QIAamp®病毒RNA迷你试剂盒从咽拭子中提取病毒RNA的提取效率正值时间（Tp）定义为指数扩增曲线的二阶导数拐点处的时间，用作评价提取效率的关键因素，因为Tp通常与模板浓度负相关。如图3（a）所示，我们发现TRIzolTM通用试剂盒提供的Tp值为图二. RTisochipTM-W系统的设计。(a)照片的16通道RTisochipTM-W与四个堆叠的分析仪，其中每一个包含四个子模块。(b) 分析仪的分解图，包含四个子模块。一曰：金属板框架;第二章：右侧面板;第三章：上面板;第四章：子模块;五：前面板;第六章：后面板;第七章：开关固定上盖板; 8：开关; 9：开关固定面板; 10：网口安装面板; 11：隔板; 12：电源插座安装面板; 13：插座式电源滤波器; 14：系统电源; 15：微芯片加热器电源; 16：左侧面板; 17：橡胶脚。(c)仪器内部子模块结构示意图。最多可通过路由器将16个相同的子模块连接到计算机PMT：光电倍增管; LED：发光二极管; PID：比例-积分-微分。总是略短于QIAamp®套件提供的。因此，我们选择TRIzolTM试剂盒作为我们系统的推荐手动方法。接下来，为了进一步减少人工操作的强度，我们采用了KingFisherTM Flex纯化系统来自动化RNA提取过程。 图 3（b）和(c) 这表明，这种自动化系统通常提供了一个·····×··西街1134号 邢 等/工程 6 （2020）1130图3.第三章。用于芯片病毒检测的不同RNA提取方法的比较（a）通过检测四种不同的病毒靶标比较QIAamp®和TRIzolTM试剂盒的RNA提取效率（n= 3）;（b）比较手动TRIzolTM试剂盒和自动KingFisherTM Flex纯化系统在检测HCoV-229 E/NL 63和H1N1 2009中的效率（n= 3）。所有误差条代表一个标准偏差。TCID50：组织培养感染剂量中位数与 手 动 TRIzolTM 方 法 相 比 ， 在 以 组 织 培 养 感 染 剂 量 中 位 数（TCID50）为代表的广泛病毒浓度范围内，在检测两种病毒靶标HCoV-229 E/NL 63和H1N1 2009时，具有然而，由于自动化系统的成本较高，我们选择TRIzolTM通用试剂盒和KingFisherTM系统进行后续测试。3.2. RTisochip TM-W的灵敏度和重复性评价为了评估平台的灵敏度，将这19种呼吸道病毒的合成RNA模板稀释以形成从250、50、25至10个拷贝1L-1的浓度梯度。其中SARS-CoV-2N和SARS-CoV-2S被一起稀释所有病毒的检测限（LOD）见图4（a）。我们确定H7N9、CA 16、RSV、HPIV 1、HPIV 2、HPIV3、HPIV 4、HCoV-229 E/NL 63和HMPV的LOD为50个拷贝/L-1;H1N1、H3 N2、乙型流感、EV 71、HCoV-0 C43/HKU 1、CA 6、HRV和SARS-CoV-2 N基因的LOD为25个拷贝/L-1; H1N1 2009和SARS-CoV-2 S基因的LOD甚至可以达到10个拷贝/ L-1。所有这些结果与常规RT-PCR方法的结果相当。H1N1 2009和SARS-CoV-2 S在不同RNA浓度以及NC下的典型扩增曲线显示在图1A和1B中。4（b）和（c）。2009年H1N1流感病毒和SARS-CoV-2 S基因的Tp值与RNA浓度呈良好的线性关系。我们选择2009年H1N1和SARS-CoV-2作为检测目标，以评估系统的重复性。首先，用H1N1 2009和SARS-CoV-2 S的灭活病毒储备液基因以500个拷贝/L的浓度。RNA提取后，将制备好的样品装入RTisochipTM-W系统进行检测.如图4（d）所示，在每批内和三批之间，这两种靶的Tp值没有观察到显著差异，表明我们的RTisochipTM-W系统具有优异的重复性。在模拟样本评价后，进一步选择SARS-CoV-2 S和N基因作为靶基因，用临床样本提取的RNA进行重复性图 4（e）表明，S和N基因在10个重复序列上的变异系数（CV）分别为16.96%和15.91%。这些结果清楚地表明，我们的微流控平台可以提供可接受的灵敏度和高重复性，用于多指标病毒检测。3.3. RTisochipTM-W系统的耐用性和专属性评价稳健性是医学诊断平台的关键特征，特别是对于传染病的诊断，因为临床样品可能以各种形式出现并且含有不能通过提取过程消除的多种扩增抑制剂。在我们的研究中，咽拭子或其他类型的标本可能有多种干扰物，包括微生物、血液和患者在采样前服用的残留抗菌和抗病毒药物。因此，我们使用人工添加干扰物的样品彻底评估了我们平台的抗干扰能力。首先，如图5（a）所示，我们发现将最终浓度为10 mg L-1的粘蛋白添加到1 × 104拷贝mL-1的H1N1 2009、H3 N2、乙型流感病毒、RSV、HPIV 3和SARS-CoV-2 N的病毒混合物中，W. Xing等/ Engineering 6（2020）1130-11401135见图4。RTisochipTM-W系统的灵敏度和重复性测试。(a)19种呼吸道病毒芯片检测的最低检测限（LOD）;（b）2009年H1N1流感病毒Tp与模板浓度的典型扩增曲线及线性拟合（n=3）;（c）SARS-CoV-2 S基因的典型扩增曲线及线性拟合（n= 3）;(d) 用H1N1 2009和SARS-CoV-2 S基因的合成RNA模板的三种微流控芯片的重复性测试（n= 10）;（e）用提取的RNA样品检测SARS-CoV-2 S和N基因的重复性（n= 10）。所有误差条代表一个标准偏差。影响这五个靶标的扩增，因为Tp值没有显著变化。接下来，我们制备了干扰物质的混合物，包括盐酸羟甲唑啉、地塞米松、干扰素、拉米夫定、金刚烷胺、薄荷醇、氯化钠和粘蛋白（见图5（b）），以更严格地评价平台的抗干扰性能。如图5（c）所示，加入这些混合干扰物后，H1N1 2009、H3 N2、乙型流感病毒、RSV、HPIV 3和SARS-CoV-2N基因的Tp值没有显示出显著变化。然而，这些试验证明，在我们的RTisochipTM-W平台上没有显著的负面影响。由于我们的平台可以同时检测19种不同类型的病毒，因此这些目标之间的交叉反应需要由于交叉反应可能会导致测试中的假阳性结果，因此应进行彻底调查。在这里，我们准备了19个样本，每个样本包含一种类型的病毒模板（P1-P19）和六个NC（N1-N6）来测试我们的系统。如图5（d）的热图所示，我们发现在所有25个样品中没有由交叉反应引起的非特异性扩增，表明RTisochip TM-W系统的可靠性接下来，我们注意到这19个不同目标的竞争效应是平台的另一个潜在风险当单个样品中存在多个靶标时，由于来自非靶向RNA背景的干扰，我们的系统可能不如一次仅检测一个靶标的系统灵敏为了评估这种竞争效应，我们制备了单一或混合RNA样品，将其稀释至5000和500拷贝· L-1的最终浓度。作为西街1136号 邢 等/工程 6 （2020）1130图五、RTisochipTM-W的抗干扰、交叉反应和竞争效应测试（a）在有或没有粘蛋白的反应中，七种选定靶标的相似Tp值和扩增曲线（b）加入反应缓冲液中的干扰物质的最终浓度（c）在有或没有混合干扰物质的反应中，七种选定靶标的Tp值相似（d）平台的交叉反应测试阳性结果显示为橙色方块，而蓝色方块表示阴性结果。P1（e）混合目标样本的竞争效应测试检测了两种不同浓度的单一或混合靶标样本，在500拷贝· L-1的低浓度下漏测了乙型流感病毒。NS：不显著。·W. Xing等/ Engineering 6（2020）1130-11401137示于图 5（e），单独检测的H1N1 2009、H3 N2、RSV、HPIV 3、SARS-CoV-2 S和SARS-CoV-2 N的Tp值与从浓度为5000和500拷贝/L的混合RNA样品获得的Tp值没有显著差异。虽然我们确实观察到由于非靶向RNA背景，在较低浓度下在混合样品中检测不到乙型流感病毒，但可以进一步优化乙型流感病毒的引物浓度和引物序列以解决该问题。以上结果表明，RTisochipTM-W系统特异性好，稳健性强，可同时检测16份临床标本中的19种呼吸道病毒。3.4. RTisochipTM-W用于SARS-CoV-2和另外18种呼吸道病毒的临床试验在SARS-CoV-2爆发前，我们利用RTisochipTM-W系统对北京市18种呼吸道病毒的流行趋势进行了跟踪分析。于2019年12月27日至2020年1月16日的流感季节期间，北京清华长庚医院共采集了101份流感季节儿童咽拭子样本。作为对比，首都儿科研究所于2019年9月18日至11月7日期间采集了100份非流感季节儿童咽拭子样本。所有临床样本均通过RTisochipTM-W系统进行检测;结果列于附录A的表S2和S3中。从这201份临床样本中，我们发现这些呼吸道病毒的阳性率在采样时间内表现出很大的变化。如图6（a）所示，几乎71.3%的流感季节样本被发现感染流感病毒，而首都儿科研究所的非流感季节样本仅为2.9%。RSV、HPIV 1 、 HPIV 2 、 HMPV 、 HCoV-229 E/NL 63 、 HCoV-OC43/HKU 1的阳性率呈上升趋势。相反，流感季节样本中HRV、HPIV 3和HPIV 4的阳性率随着时间的推移，呼吸道病毒的阳性率发生了显著变化，强调了临床呼吸道病毒多指标检测的重要性。在SARS-CoV-2爆发后，我们增加了SARS-CoV-2S和N个基因，并使用临床SARS-CoV-2样本评估系统性能。首先，用RTisochipTM-W系统和商品化RT-PCR试剂盒（中国华大基因）平行检测14份临床确诊的阳性和3份阴性样本。如图6（b）和附录A表S4所示，两种方法显示出100%的一致性，表明我们的平台的检测性能与常规RT-PCR相同。为了进一步验证我们的平台用于检测临床样本的稳定性和可重复性如图6（c）中的热图所示，我们的RTisochipTM-W系统报告的结果都与临床记录一致，并且没有获得假阳性或假阴性结果。在这些小规模评估之后，我们与广州医科大学附属第一医院（380例）、四川大学华西医院（63例）和首都医科大学北京佑安医院（171例）（列出）合作，共收集了614份疑似或确诊COVID-19患者的临床拭子样本见附录A表S5如图6（d）所示，本系统报告的SARS-CoV-2、H1N12009 、 H3 N2 、 HPIV 、 RSV 和 B 型 流 感(38/614 ） ，3.75%(23/614），百分之十二点三八(76/614），5.21%(32/614）。 总符合率为RTisochipTM-W与参考试剂盒（RT-PCR，上海中杰生物技术有限公司，有限公司、中国）在SARS-CoV-2，H1N1 2009的测试H3N2 、 HPIV 、 RSV 和 乙 型 流 感 病 毒 的 检 出 率 分 别 为 98.15% 、98.70%、99.35%、99.57%、97.61%和99.35%。在这些临床样本中，一些疑似COVID-19患者最终被诊断为甲型流感、乙型流感或RSV，而不是SARS-CoV-2。例如，四川大学华西医院的1号病例被诊断为甲型流感，突出了我们的平台在精确识别疾病确切病因方面的价值。在一些临床确诊的COVID-19病例中，我们的平台和传统的RT-PCR方法都无法检测到SARS-CoV-2，这可能是由于样本的病毒载量较低。如此大规模的临床试验清楚地证明，我们的平台是临床环境中检测呼吸道病毒的强大而可靠的诊断工具。4. 讨论由于目前没有针对COVID-19的有效药物，因此抗击COVID-19的唯一可行方法是尽早诊断、分类和隔离患者不幸的是，由于所有呼吸道感染疾病的症状都很相似，在医疗资源有限的情况下，一名SARS-CoV-2阴性患者出现咳嗽和发烧症状，与其他COVID-19患者一起住进重症监护室（ICU），并被当作患有COVID-19进行治疗的情况 从这个角度来看，开发一种核酸检测工具来区分COVID-19和其他病毒（如流感病毒、副流感病毒、腺病毒、RSV、鼻病毒和HMPV）引起的肺炎病例是非常有价值的。RTisochipTM-W系统能在一次检测中鉴定19种常见呼吸道病毒，具有周转时间短（小于90min）、处理量可从1到16个样品灵活、多指标检测所需人工操作最少、灵敏度与常规RT-PCR相当、对各种干扰物的耐受性高等优点。因此，RTisochipTM-W系统应能在抗击COVID-19疫情中发挥重要作用RTisochipTM-W系统在临床实践中的应用应在大流行的背景下精心规划在这里，我们通过综合考虑所有分子诊断方法的优缺点， 如图 7、首先，当有COVID- 19样症状的患者到达发热门诊时，可以进行常规的RT-PCR检测，以快速确定患者（及其密切接触者）是否感染了SARS-CoV-2。由于其相对低的成本和高通量，在机器人技术的辅助下，RT-PCR适用于在大流行情况下筛选如果患者被诊断为COVID-19，他或她可能会被转移到指定的COVID-19医院。在治疗过程中，可以使用数字PCR（dPCR）密切监测患者的病毒载量，这可以提供绝对的病毒定量。最近的研究表明，患者体内的病毒载量如果患者这种检测策略应该能够提高COVID-19患者的存活率其次，如果 发 热 门 诊 的 患 者 在 SARS- CoV-2 检 测 中 呈 阴 性 ， 我 们 的RTisochipTM-W可以很快识别出症状是否由系统病原体列表中的其他已知病毒和细菌引起。一旦确诊，患者可以被转移到医院的肺病科，并由RTisochipTM-W进行密切监测。第三，如果发热门诊的患者检测结果仍然为阴性，则可以使用下一代DNA/RNA测序来识别任何未知或不常见的病原体。然后，病人可能会西经1138号 邢 等/工程 6 （2020）1130图六、RTisochipTM-W用于呼吸道病毒的临床鉴定（a）2019-2020年度收集的临床样本中各病毒靶标的阳性率北京清华长庚医院样本采集于2019 - 2020年流感季（n= 101），首都儿科研究所样本采集于2019年非流感季（n= 100）。（b）RTisochipTM-W与常规RT-PCR检测SARS-CoV-2结果的比较 (c)RTisochipTM-W使用临床样本的重复性测试。阳性和阴性结果分别显示为橙色和天蓝色正方形。（d）合共614个怀疑或确诊新型冠状病毒病患者的临床咽拭子样本的阳性率详细的数字显示出来了。在呼吸科得到适当的治疗，并由我们的RTisochipTM-W监测任何HAI迹象。最后，康复的病人在出院前应接受另一轮RT-PCR检测同时，考虑到RT-PCR可能出现的假阴性结果，应按照新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第7版）的建议，将基于免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）的免疫检测与RT-PCR联用，以提高检测的准确性[35]。基于该指引，RTisochipTM-W系统可用于以下场景：①在大多数情况下快速诊断COVID-19样症状的确切原因，以防止患者之间的误治和交叉感染;②在治疗过程中密切监测由于大流行导致的医疗情况恶化而导致的HAI的发生。RTisochipTM-W系统，协同组合与其他体外诊断工具，将使我们对抗COVID-19的斗争更加有效和更加精确。在未来，W. Xing等/ Engineering 6（2020）1130-11401139图7.第一次会议。COVID-19检测指南。NGS：下一代测序; dPCR：数字PCR; IgM：免疫球蛋白M; IgG：免疫球蛋白G。通过将更多的病原体引入到检测列表中，通过整合样品分离以形成“样品输入-应答输出”系统，以及通过与自动化机器人系统组合以达到更高的通量，可以进一步改进RTisochipTM5. 结论综上所述，我们成功开发了一种高通量核酸等温扩增系统，能够在90 min内从16份临床样本中检测出包括SARS-CoV-2在内的19种常见呼吸道病毒在广泛的临床试验中证明，我们的RTisochipTM- W系统具有高灵敏度、良好的特异性、强鲁棒性和良好的重复性，可作为一种强有力的核酸检测工具，用于发热门诊、ICU、医疗隔离区和许多其他迫切需要肺炎精确病因的环境中确认感谢广州医科大学附属第一医院钟南山医生及其同事提供灭活病毒培养原液。我们感谢北京清华长庚医院的赵秀英医生和她的同事以及首都儿科研究所的崔小岱医生和他的同事提供临床样本。本研究由中国科学技术部国家重点研发计划（2020YFC 0847400）、清华大学新冠肺炎 防 控 科 技 应 急 项 目 （ 20201080055 ） 和 广 州 呼 吸 健 康 研 究 所（2020GIRHHMS 02和2020GIRHHMS 03）资助。遵守道德操守准则Wanli Xing ， Yingying Liu ， Huili Wang ， Shanglin Li ，Yongping Lin ， Lei Chen ， Yan Zhao ， Shuang Chao ， XiaolanHuang，Shaolin Ge，Tao Deng，Tian Zhao，Baolian Li，HanboWang，Lei Wang，Yunpeng Song，Ronghua Jin、Jianxing He、Xiuying Zhao、Peng Liu、Weimin Li和Jing Cheng声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可以在https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.07.015上找到。引用[1] 王C，霍比PW，海登FG，高GF。 一种新型冠状病毒爆发的全球健康问题。柳叶刀2020;395（10223）：470-3。[2] Huang C，Wang Y，Li X，Ren L，Zhao J，Hu Y，et al.中国武汉2019新型冠状病毒感染患者的临床特征。柳叶刀2020;395（10223）：497-506。[3] Corman VM，Landt O，Kaiser M，Molenkamp R，Meijer A，Chu DKW，等.2019新型冠状病毒（2019-nCoV）实时荧光RT-PCR检测。欧洲调查2020;25（3）：2000045。[4] Chu DKW，Pan Y，Cheng SMS，Hui KPY，Krishnan P，Liu Y，et al.导致肺炎爆发的新型冠状病毒（2019-nCoV）的分子诊断。临床化学2020;66（4）：549-55。[5] Wilder-Smith A，Freedman DO.隔离、隔离、社交距离和社区遏制：旧式公共卫生措施在新型冠状病毒（ 2019-nCoV）爆发中的关键作用。J Travel Med2020;27（2）：taaa020.[6] 作者：Li G，De Clercq E. 2019年新型冠状病毒（2019- nCoV）的治疗选择。Nat Rev Drug Discov2020;19（3）：149-50.[7] Zhai P，Ding Y，Wu X，Long J，Zhong Y，Li Y. COVID-19的流行病学、诊断和治疗。Int J AntimicrobAgents 2020;55（5）：105955.[8] Westh H，Lisby G，Breysse F，Böddinghaus B，Chomarat M，Gant V，等. 多重实时PCR和血培养鉴定疑似脓毒症患者血流病原体临床微生物感染2009;15（6）：544-51。[9] 李勇，郭世军，邵宁，涂松，徐明，任志荣，等.一种利用疏水微阵列进行100-plex扩增的通用多重PCR策略。Lab Chip2011;11（21）：3609-18.[10] Wang Y，Sims CE，Allbritton NL.用于微阵列和微流体装置的溶解引导润湿。LabChip2012;12（17）：3036-9.[11] DuW，Li L，Nichols KP，Ismagilov RF. 滑动芯片实 验 室芯片2009;9（16）：2286-92.[12] 沈春，徐平，黄正，蔡东，刘世杰，杜伟。滑动芯片上的细菌趋化性。Lab Chip2014;14（16）：3074[13] Shen F，Du W，Davydova EK，Karymov MA，Pandey J，Ismagilov RF.滑动芯片上的纳升多重PCR阵列。 Anal Chem 2010