肝硬化患者胃粘膜菌群特征及与胃肠道症状的关联

工程7（2021）507研究肠道微生物群与疾病-文章肝硬化患者胃粘膜菌群特征及其与胃肠道症状的陈燕飞a，郭静a，陈春雷a，丁世a，方代琼a，冯吉b，李兰娟a，李伟a浙江大学医学院附属第一医院传染病诊疗协同创新中心国家传染病临床研究中心传染病诊疗国家重点实验室b浙江大学医学院附属第一医院消化内科，杭州310003阿提奇莱因福奥文章历史记录：2019年12月18日收到2020年4月1日修订2020年4月7日接受2020年9月25日网上发售关键词：微生物群肝硬化症状静脉曲张胃镜检查A B S T R A C T一些研究表明，肝硬化患者的口腔和肠道微生物群可能存在差异。对胃中的微生物群知之甚少，胃位于口腔和肠道之间。在这项研究中，肝硬化患者和对照组的胃粘膜微生物群进行了分析与16S核糖体RNA（rRNA）焦磷酸测序。肝硬化患者幽门螺杆菌（H. pylori）感染率，如通过组织学方法和焦磷酸测序方法两者所证实的。In H. 幽门螺杆菌阴性的受试者，健康和肝硬化组群的胃细菌群落基于细菌组成被聚类为四个簇：pH_1和pH_2（主要是肝硬化）、pH_3（主要是健康）和pH_4（大约各一半）。这些不同的集群之间的组成和功能的差异。在属水平上，菌株1和菌株2分别表现出奈瑟菌和链球菌的富集。在功能上，β_2的特点是缺乏遗传信息处理，以及与聚糖生物合成和代谢相关的模块。与其他组相比，第2组患者有更严重的胃肠道症状和更高的既往内镜下静脉曲张结扎（EVL）治疗率我们的研究结果表明，这两个H。pylori和non-H.幽门螺杆菌在肝硬化中受到影响。虽然H. pylori阴性的胃粘膜菌群显示出相当大的异质性，可以观察到特定胃粘膜菌群与临床特征之间的关联。 既往EVL治疗可能导致胃粘膜微生物群结构的改变，从而加重H.幽门螺杆菌阴性的幽门螺杆菌感染患者。©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍研究表明，肠道微生物群的变化可能在肝硬化的发展中起重要作用[1]。此外，越来越多的证据表明，肝硬化患者的下胃肠道（GI）中口腔微生物组过多[2]。在几项研究中观察到肠道和口腔中的微生物生态失调与炎症反应和肝硬化进展密切相关[2不过，胃里的微生物群连接着口腔和肠道，还没有很好地表征肝脏*通讯作者。电子邮件地址：jifeng1126@sina.com（F. Ji），ljli@zju.edu.cn（L. Li）。肝硬化更好地了解胃微生物群可能会提供肝硬化复杂微生物群的更完整的图片。长期以来，人们一直认为幽门螺杆菌（H. pylori），这是由于酸性条件和其它抗菌因素。随着高通量测序技术的发展，对产气细菌的鉴定数量除H.幽门螺杆菌，有一个特征性的微生物群存在于胃。据报道，胃细菌的最主要的门是变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和梭菌门[7，8]。各种证据表明，胃微生物群在胃疾病的发展和进展中起着关键作用[9，10]。此外，胃微生物群定殖与病理学、免疫应答，https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.04.0142095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engY. Chen，J. Guo，C. Chen等人工程7（2021）507508-··以及促炎基因和癌症相关基因的信使RNA（mRNA）表达[11]。胃中的非螺杆菌细菌定殖也涉及疾病，例如胃癌和胃息肉[12]。从浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生到胃黏膜型胃癌，不同的胃病存在不同的胃内微生物群[10，13 -15]。胃症状在肝硬化中很常见。病理生理学复杂，可能涉及结构变化、心理困扰、胃对扩张的敏感性增加和肠道传输延迟等因素[16-19]。粘膜改变和静脉曲张是肝硬化的主要内镜表现[20]。肝硬化的胃粘膜改变包括慢性胃炎、糜烂性胃炎和胃溃疡[21]。静脉曲张最常见于食管和/或胃底。大多数肝硬化患者存在胃排空延迟或小肠传输受损[17]。不同的pH值，氧气，营养物质，离子和化学物质可能会在肝硬化的胃微环境中存在相当大的变化，这可以优先支持特定细菌菌株的定植。胃细菌也可能通过诱导粘膜炎症而导致胃症状。本研究的目的是描述肝硬化患者的胃粘膜微生物群，并确定其与胃症状的关系。正常人作为对照组。 应用16S rRNA焦磷酸测序和聚类分析。结果表明，H.幽门螺杆菌定植率降低。此外，胃粘膜微生物群的H. pylori阴性的受试者表现出相当大的异质性。特定的胃微生物结构与先前的内镜静脉曲张结扎（EVL）治疗和更严重的GI症状相关。2. 方法2.1. 患者病例组和对照组在浙江大学医学院附属第一医院进行招募和抽样患者组包括29例在医院接受预先安排的上消化道内窥镜检查的肝硬化患者肝硬化的诊断主要依据临床及实验室检查资料，并辅以肝活检或超声检查。在肝硬化患者中，24例（82.8%）与乙型肝炎病毒相关，3例（10.3%）患有原发性胆汁性肝硬化，2例（6.9%）患有酒精性肝硬化。采用 肝硬化组Child-Pugh A级25例另外，共31名接受胃镜检查的受试者进行常规体格检查，内镜检查结果基本正常，作为对照。肝硬化患者和对照组在年龄和性别上相匹配。如果受试者在过去两个月内接受过抗生素或质子泵抑制剂（PPI），在内镜检查前，要求所有受试者根据胃肠道疾病症状严重程度指数（PAGI-SYM）问卷的患者评估对其症状进行评级[23]。获得所有参与者在他们进入研究之前。这项研究遵循了1975年赫尔辛基宣言的伦理准则。该研究计划获得了第一附属机构机构审查委员会的批准2013年12月11日，浙江大学医学院附属医院2.2. 内镜样本采集所有内镜检查均由同一位胃肠病学家（冯骥博士）进行。健康对照组的内镜检查结果通常正常。从胃窦共采集两份活检标本。1例活检用于组织病理学分析。将用于16S rRNA焦磷酸测序的另一活检样品悬浮在无菌半浓度蛋白胨水中，并储存在80°C下用于随后的微生物学程序。2.3. 粘多糖DNA提取用QIAamp DNA分离试剂盒（Qiagen，USA）结合珠粒击打法进行粘多糖DNA提取。总而言之，将活检组织在56 ℃下在180 μ L Qiagen组织裂解缓冲液ATL缓冲液中与20 μL蛋白酶K孵育1小时。然后将不同直径（0.1、0.5和1.0mm; Sigma，USA）的玻璃珠加入到混合物中。 之后，应用FastPrep FP 120珠粒搅拌器（Bio 101，USA）以4 ms-1进行样品均质化30秒。接着，将混合物在56 °C下再孵育1小时。然后将裂解物加入到4 mL RNA酶A（100 mg mL-1）和200 μL Qiagen裂解缓冲液AL中，并在70 ℃的温度下孵育30分钟。纯化裂解物如所述在QIAamp柱上进行由制造商在加入200 L无水乙醇后进行。总共200μ L Qiagen洗脱缓冲液AE用于洗脱。2.4. 16S rRNA焦磷酸测序用通用引物（27 F 5 0-AGAGTTT GATCCT G GCTCAG-3 0，533R 5 0-TTACCGCGGCT G CTGGCAC-3 0）扩增16S rRNA基因（V1- 3区），前所述[24]。使用来自Roche/454（瑞士）的标准软件工具在454Genome Sequencer FLX Titanium系统上进行16 S rRNA基因的焦磷酸测序。2.5. 生物信息学和统计学微生物生态学定量分析（QIIME）管线（1.7.0）用于处理和比较16S rRNA读数[25]。应用200个碱基对（bp）的最小读段长度和沿着引物序列不允许超过两个错配。序列中均聚物的授权数目的上限高质量序列的生成数量平均序列长度为464 bp。为了标准化测序深度、a/b多样性和分类群，用从每个样品随机挑选的5491个读数的子集 进 行 比 较 相 似 性 阈 值 设 定 为 97% ， 以 生 成 操 作 分 类 单 元（ OTU ） 。 选 择 具 有 最 丰 富 序 列 的 OTUGreengenes 数 据 库（gg_13_8_otus）用于代表性读段的分类学分配。进行了USEPCR以鉴定嵌合体[26]。使用R软件包Phyloseq分析QIIME结果[27]。功能基因含量预测基于通过未观察状态重建（PICRUSt）对群落的系统发育研究[28]。肝硬化患者和对照之间的多样性和临床参数的显著性检验基于双侧Student鉴别细菌分类群、功能模块和临床特征Y. Chen，J. Guo，C. Chen等人工程7（2021）507509四个非H中的代表。 pylori聚类分析、单因素方差分析、Tukey检验或卡方检验。学生3. 结果3.1. 临床特征和内镜所见本研究共纳入60例受试者表1总结了31例对照组和29例糖尿病患者的特征。肝硬化患者的PAGI SYM评分显著高于p= 0.001）。疾病组和对照组的临床特征（年龄、体重指数和性别）基本匹配。附录A表S1总结了29例肝硬化患者的内镜检查结果。食管胃底静脉曲张发生在所有患者中。如前所述估计静脉曲张的严重程度[29]。根据新意大利内镜俱乐部标准，有15例（51.7%）门脉高压性胃病。3例患者（10.3%）患有胃十二指肠溃疡（2例胃溃疡和1例十二指肠溃疡）。糜烂性胃炎4例（13.8%）。萎缩性胃炎2例（6.9%）。31例对照组的内镜检查结果基本正常。3.2. 肝硬化与低H相关。胃幽门感染H.对照组中32.3%（10/31）的患者检出pylori，而腹泻组中仅6.9%（2/29）的患者检出pylori。肝硬化组H. 幽门螺杆菌感染率（p= 0.03）（表1）。 基于16S rRNA基因序列的微生物谱分析也揭示了H. pylori阳性者和H.幽门螺杆菌阴性受试者。幽门螺杆菌属读段在H.pylori阳性率为97.1%（90.1%~ 99.9%）;幽门螺杆菌阴性受试者占所有序列的0.7%（范围0 -8.5%）（见附录A中的表S2）。H.幽门螺杆菌阳性表1临床特点和研究对象的多样性临床特点HC（n= 31）LC（n= 29）p值年龄52.0± 10.548.5± 7.80.150性别（男/女）22/922/70.890体重指数20.1± 2.119.8± 1.90.640PAGI-SYM评分3.2± 2.76.7± 4.80.001H.幽门螺杆菌阳性率32.20%6.80%0.030观测OTU195 ± 48152 ± 810.016超1236 ± 52194 ± 860.024Shannon指数3.29± 0.932.55± 1.720.043H.幽门螺杆菌阳性受试者计数1020.030PAGI-SYM评分2.1± 2.13.5± 0.70.150观测OTU76 ± 4550 ± 300.560超1118 ± 7588 ± 430.570Shannon指数0.37 0.01 ±0.17± 0.20.010H.幽门螺杆菌阴性受试者计数21270.030PAGI-SYM评分3.7± 2.87.0± 4.90.006观测OTU203 ± 35201 ± 420.850超1245 ± 40244 ± 430.950Shannon指数3.50± 0.473.68± 0.470.190HC：健康对照; LC：肝硬化。阴性胃微生物群，如通过观察到的OTU（76 ± 45，在H. pylori阳性对照组为203 ± 35。pylori阴性对照，p< 0.001），和多样性，如Shannon指数（0.37 ± 0.01，H. 幽 门 螺杆菌-阳性对照vs3.50± 0.47。pylori-阴性对照，p< 0.001）（表1）。3.3. H.幽门阴性胃菌群H. pylori感染者以H.幽门螺杆菌读数。为了更好地描述胃非H蛋白的变化。pylori感染情况，进一步分析肝硬化患者的H.幽门螺杆菌阴性样本。肝硬化患者和对照组的胃粘膜微生物群落显示出接下来，应用另一种称为聚类的探索性和无监督数据分析方法来探索这种胃微生物群是否存在自然分组。为了确定聚类的最佳数量，使用Jensen-Shannon距离和OTU水平的相对丰度分布，应用围绕中心点的分区方法。观察到四个聚类的轮廓指数为1.83，表明对四个聚类的有力支持。类间分析表明，四个聚类显示出彼此之间的明显分离（图1（a））。观察到四个聚类的Calinski-Harabasz值最高当比较微生物多样性时，在四个簇之间没有观察到显著差异（表2）。在48个H. 幽 门 螺杆菌阴性的患者中，受试者（21%）被聚类为分类器_1，10（21%）被聚类为分类器_2，15（31%）被聚类为分类器_3，而其余13（27%）落入分类器_4。表2总结了每个聚类中个体的临床特征。虽然每个聚类中都有肝硬化患者和对照组，但肝硬化的比例不同。结果显示，1号组（80%）和2号组（80%）有明显较高的发病率，而3号组（20%）有明显较高的对照率（p= 0.02）。通过PAGI-SYM评分比较各组间上消化道症状的严重程度。患者2（9.6 ± 4.6）的PAGI-SYM评分最高，其次是患者1（6.1 ±4.0）、患者4（4.9 ± 3.8）和患者3（3.0 ± 2.9）（p= 0.001）。此外，有一种趋势，即在2012年2月（62.5%）比2013年1月（25.0%），虽然差异无统计学意义（p= 0.18）的胃底静脉曲张出血的患者接受过EVL治疗的比例较高。各组患者的既往静脉曲张出血、静脉曲张的存在、使用Child-Pugh评分表示的肝硬化严重程度3.4. 非H的组成分析。幽门螺杆菌胃微生物簇在整个数据集中显示> 1%相对丰度的分类群之间比较显著差异，以鉴定标志分类群（图2）。在四个集群之间观察到了重大差异。在门水平上（图2（a）），在细菌_2中观察到拟杆菌门的相对丰度显著低于细菌_3和细菌_4（p= 0.0007）。与其他集群相比，Chaer_1的特征在于变形杆菌的相对丰度显著更高（p= 0.00002）。厚壁菌在培养皿2中的含量较高，培养皿1中的含量较低，培养皿2中的含量较高，培养皿1中的含量较低，培养皿2中的含量较高，培养皿1中的含量较低，培养皿2中的含量较低，培养皿1中的含量较高，培养皿1中的含量较低，培养皿2中的含量较低，培养皿1中的含量较低，培养皿1中的含量较低，培养皿2中的含量较低，培养皿1中的含量较高，培养皿1中的含量较低，培养皿1中的含量较低，培养皿1中的含量较低，培养皿2中的含量较低，培养皿1中的含量较低，培养皿1中的含量较低，培养皿1中的含量较低。在1993年和1994年，放线菌的相对丰度在Cluster_4中显著高于Cluster_1（p= 0.002）。在类别水平上（图2（b）），大肠杆菌_2的类杆菌比率显著低于大肠杆菌_3和大肠杆菌_4（p= 0.0002）。细菌类在大肠杆菌_2中的相对丰度最高，Y. Chen，J. Guo，C. Chen等人工程7（2021）507510××××××Fig. 1.在非H中观察到四个簇。幽门胃菌群。(a)从OTU级相对丰度剖面图获得的詹森-香农距离的主坐标分析。根据通过围绕中心点聚类算法划分识别的聚类对样品进行着色（蓝色：着色剂_1;红色：着色剂_2;黑色：着色剂_3;绿色：着色剂_4）。（b）以最高Calinski-Harabasz（CH）伪F统计值支持四个聚类表2四种H. 幽门阴性的胃微生物集群。临床特点患者_1（n= 10）患者_2（n= 10）患者_3（n= 15）患者_4（n= 13）p值年龄49.2± 6.949.8± 7.250.6± 13.250.2± 6.80.990性别（男/女）9/16/411/49/40.490肝硬化患者80%H80%H20%L61%HL0.019PAGI-SYM评分6.1± 4.0HL9.6± 4.6小时3.0± 2.9L4.9± 3.8L0.001观测OTU202 ± 51213 ± 32206 ± 40190 ± 260.490超1244 ± 54247 ± 36253 ± 38235 ± 400.720Shannon指数3.49± 0.753.57± 0.413.69± 0.383.53± 0.370.740硬化患者计数8838Child–Pugh score7/1/008/0/01/2/007/0/10.810静脉曲张严重程度3/2/1a4/2/22/3/32/1/03/2/30.560高压性胃病百分之五十百分之五十百分之三十三百分之六十三0.850既往出血百分之六十二点五75.0%百分之六十六点七75.0%0.930普萘洛尔使用25.0%25.0%百分之六十六点七百分之三十七点五0.560PAGI-SYM评分6.3± 4.510.0± 5.24.3± 4.55.6± 4.40.001EVL率25.0%百分之六十二点五33.3%百分之十二点五0.180不同字母（H、L、HL）表示通过单因素ANOVA和Tukey检验得出的组间p <0.05的统计学差异。H：组间最高值; L：组间最低值; HL：最高组和最低组之间无显著差异a静脉曲张严重程度3/2/1表示根据新意大利内镜俱乐部标准，静脉曲张严重程度被诊断为重度、中度或轻度。与其他聚类的比较（p= 110- 7）。hadβ-变形菌与其它菌群相比水平最高（p= 110- 6）。 α-变形菌的数量在大肠杆菌2中明显高于其它菌群（p= 110- 5）。在属的水平上（图2（c）），与其他簇相比，奈瑟氏菌负责β-变形菌在大肠杆菌_1中的富集（p= 1 × 10- 5）。发现来自细菌纲芽孢杆菌的链球菌在四个簇中在大肠杆菌_2中具有最高的比率（p= 110- 8）。普氏菌的相对丰度在大肠杆菌_4中显著高于大肠杆菌_1和大肠杆菌_2（p=0.002）。发现来自梭杆菌纲的梭杆菌在细菌_1中明显富集，与细菌_2和细菌_4相比（p= 0.002）。3.5. 非H. 幽门菌群为了生成胃微生物群的功能潜力谱，使用PICRUSt分析来获得预测谱京 都 基 因 与 基 因 组 百 科 全 书 （ Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes，KEGG）对非H. pylori微生物簇的测定（图3）。当比较1级KEGG通路时（图3（a）），发现在p212中的遗传信息处理显著低于其他三个簇（p= 5 × 10- 4）。在KEGG通路水平2和水平3，涉及遗传信息处理的几个通路有助于下降，包括核糖体和翻译的核糖体生物合成，以及折叠、分选和降解通路（图3（b））。与其他簇相比，模块折叠、分选和降解显示出在p21 - 2中最低的相对丰度（p= 0.0005）。来自途径翻译的模块核糖体在p2p_2中显示出比p2p_1和p2p_3中显著更低的比率（p= 0.006）。另一个来自途径翻译的核糖体生物合成模块被发现在B_2中显著低于B_3。在搜索器_3和0.001）。结果表明，1号菌株的氨基糖和核苷酸糖的相对丰度显著低于3号和4号菌株，2号菌株的氨基糖和核苷酸糖的相对丰度显著低于3号和4号菌株Y. Chen，J. Guo，C. Chen等人工程7（2021）507511图二、细菌类群的相对丰度在不同类群间有显著差异（a）门级;（b）纲级;（c）属级。数据用小提琴图可视化，其中中间的线是中值，方框代表四分位数范围。从框中延伸的细线表示数据中的上（最大）和下（最小）相邻值不同颜色的图表示不同的聚类。M：组间中间水平，即显著高于最低水平，显著低于最高水平; ML：最高水平组与中间水平组间无显著差异图三. 功能模块的相对丰度在聚类间差异显著。(a)1级;（b）2级和3级。数据通过小提琴图可视化，其中中间的线是中位数，方框代表四分位数范围。从方框延伸的细线代表上限（最大值）和下限（最小值）数据中的相邻值不同颜色的图表示不同的聚类。Y. Chen，J. Guo，C. Chen等人工程7（2021）507512处于中间（p= 0.001）。与其他簇相比，p216 - 2具有最低水平的模块聚糖生物合成和代谢（p= 0.0005）。4. 讨论肠道菌群在肝硬化并发症中起着重要作用。然而，以前的大多数研究都集中在粪便微生物群上。我们的研究是第一个描述腹泻患者胃粘膜微生物群的研究。螺杆肝硬化组幽门螺杆菌感染率明显低于对照组。InH.幽门螺杆菌阴性患者，胃微生物群被聚集成四个不同的簇：p53 - 1和p53 - 2（大多数为肝硬化）、p53 - 3（大多数为健康）和p53 - 4（大约各一半）。在这些微生物群中观察到显著的组成和功能差异，特别是在细菌_2中。在临床特征方面，大多数来自第2次肝硬化的患者既往接受过EVL治疗，并有严重的上消化道症状，表明胃微生物群、EVL和肝硬化胃症状之间存在潜在联系。H.幽门螺杆菌是胃中研究最多的细菌。本研究表明，哮喘患者的H。幽门螺杆菌感染率最近，Chang和Hu [30]报道失代偿期肝硬化和代偿期肝硬化合并消化性溃疡患者的H。pylori感染率较非肝硬化患者为高。与Chang和Hu的工作一致，本研究的结果再次证实了H。幽门不是肝硬化患者胃十二指肠病变的主要病因[31]。肝硬化导致胃H减少的机制。幽门螺杆菌定植尚不清楚。可能有几个首先，在肝硬化患者中，发现胃pH值高于对照组，更大比例的肝硬化患者显示低氯血症[32]。其次，对于肝硬化患者，胃萎缩和肠上皮化生的频率已被证明高于对照组[33]。萎缩性胃炎的发展可减少或消除H。幽门定植[34]。肝硬化患者常因恶心、呕吐和胃肠道出血等症状而服用抗酸剂H.肝硬化患者中幽门螺杆菌感染也可能归因于频繁的PPI药物治疗。这些结果与最近的一项研究一致，该研究调查了PPI对健康犬胃肠道微生物群的影响，并显示螺杆菌减少。在奥美拉唑给药期间胃中[35]。H.长期以来，胃粘膜中的幽门螺杆菌与胃疾病有关，包括消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤[36]。然而，最近的一些数据提示H.幽门螺杆菌对自身免疫性和过敏性疾病[37]。如果H. pylori参与了肝硬化的并发症，这一点有待于进一步研究。胃微生物群的组成受多种因素的影响，多种因素如饮食习惯、药物使用、胃粘膜炎症、疾病和遗传背景[38]。为H. pylori阴性个体中，从肝硬化患者和对照组的直接比较中没有观察到许多特征性差异（图S1）。结果可能表明，肝硬化本身并不是胃微生物群的主要形成者。所有非H.然后基于微生物组成将幽门螺杆菌受试者分成四个簇。肝硬化患者在1991年和1992年显著增加，这表明与疾病相关的微生物状态。肝硬化常伴有胃肠道症状。潜在的病理生理学涉及与肝脏疾病、肠道功能障碍（例如，增加胃对远距离刺激的敏感性和延迟的肠道传输），和心理困扰[39]。PAGI-SYM已广泛用于评价疾病中的GI症状[23]。本研究中肝硬化患者的PAGI-SYM平均评分显著高于对照组特别是，如PAGI-SYM评分所估计的，与其他集群相比，在patiter_2中的患者具有最严重的上在分类学上，菌株2的特征是类杆菌相对减少，杆菌相对富集。胃肠道症状和胃微生物群之间的相关性最近已经被表征。Han等人[40]报道了H. 胃内pylori与组织学及内镜下胃炎关系密切，与症状性胃炎关系不明显。PAGI-SYM评分与以下物种的相对丰度正相关：分段棒状杆菌、南塞普雷沃菌、长形奈瑟氏球菌、泛菌属，和副溶血放线杆菌，但与苍白普雷沃氏菌、痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的相对丰度呈负相关[40]。最近，Fukui等人[41]发现，功能性呼吸困难时上消化道链球菌显著增加此外，链球菌的相对丰度与上消化道症状呈正相关。微生物群可能通过神经源性炎症过程和肠神经系统调节改变症状敏感性[42]。尽管很少有研究探索胃微生物群与GI症状之间的关联，但人们对脑-肠-微生物群（BGM）轴内的双向相互作用越来越感兴趣BGM轴的改变不仅与功能性肠道疾病（如肠易激综合征）有关[44]，还与伴有GI合并症的精神和神经系统疾病有关[45]。胃肠道症状与胃粘膜菌群之间的相关性研究结果应该是BGM轴的一部分，需要进一步研究。静脉曲张出血是最常见的并发症之一在肝硬化中。目前，EVL是肝硬化患者中最广泛使用的侵入性手术。它不仅是静脉曲张出血急性发作的首选，也是二级预防的首选[46]。EVL对肠道微生物群的影响以前没有系统地评估过。EVL与多种不良事件相关，包括吞咽困难、食管溃疡、胸骨后疼痛、吞咽痛、胃灼热、咽喉痛和发热[47]。在EVL后的患者中观察到上消化道运动障碍[48]。肝硬化的发生率在clus_1和clus_2中均较高。然而，与第一组相比，第二组有更多的患者接受过EVL。我们的研究结果表明，EVL诱导胃链球菌尽管数据有限，但仍有人担心EVL后细菌感染的风险。接受侵入性治疗的患者表现出由革兰氏阳性球菌引起的较高感染率[49]。链球菌是肝硬化患者感染的主要原因之一。先前的研究发现，肝硬化患者的粪便样本中存在更丰富的链球菌[6]。在随后接受EVL的患者的两份血液样本中分离出缓症链球菌和表皮葡萄球菌，但未发生细菌感染[50]。链球菌属属于正常口腔微生物群，可引起牙齿和牙周感染。我们的研究结果提示EVL可能增加口腔细菌移位的风险到胃。在我们的研究中，微生物组的功能分析显示，基因丰度的有趣变化。我们发现，与其他三个簇相比，在p21 - 2中参与聚糖生物合成和代谢以及遗传信息处理的基因的丰度显著较低。栖息在人类肠道中的共生微生物专门从事觅食Y. Chen，J. Guo，C. Chen等人工程7（2021）507513多糖和聚糖，包括宿主粘液分泌的内源性聚糖和膳食聚糖[51]。对于胃粘液微生物群，内源性聚糖提供了主要的营养来源。由于内源性多糖的化学多样性，粘膜微生物产生各种不同的降解酶以利用这些异质聚合物[51]。从生态学的角度来看，大肠杆菌2型中聚糖生物合成和代谢基因的下降可能表明，由于长期的进化，微生物群不是一个稳定的群落侵入性操作，如EVL，干扰微生物群并从上游位置，如口腔引入微生物。细菌生活在不断变化的环境中。为了快速适应，它们已经进化出广泛的机制来调节从转录起始到蛋白质失活和降解的每个细胞过程[52]。使用PICRUSt进行的生物信息学分析表明，恶劣的环境（如重金属暴露）对环境和遗传信息处理的丰富功能产生了强烈影响[53]。与遗传信息处理相关的功能基因丰度相对较低也证实了微生物菌群不是由适应恶劣环境的原始成员组成。然而，本研究仍有一定的局限性。第一、大多数来诊所就诊的人都有上消化道症状。虽然健康对照组的内镜检查结果基本正常，但严格来说可能并不正常。其次，胃微生物群的组成也可能受到其他因素的影响，例如饮食习惯和药物[38]。这里没有记录和比较的饮食我们试图通过排除在采样前四周内服用PPI、抗生素和益生菌的患者来减少药物的影响然而，从长远来看，肝硬化患者更有可能服用药物，这可能会影响微生物群。未来的大样本量研究是必要的，以评估这些因素的影响第三，基于PICRUSt的功能基因预测不能提供真正的宏基因组结果。 在未来，应该应用鸟枪焦磷酸测序的宏基因组分析。此外，本研究的结果不足以探索H. 幽门螺杆菌在肝硬化中的作用为了阐明具体的机制，有必要进行更大样本量的进一步研究总之，本研究比较了肝硬化患者与健康对照者的胃粘膜微生物群特征。H. 幽门螺杆菌在胃微生物群中的存在率在肝硬化患者中低于对照组。螺杆幽门螺杆菌阴性的个体，在肝硬化和对照组的直接比较中没有观察到很多特征性差异。然而，H.幽门螺杆菌阴性的受试者可分为四个微生物群，其中两个微生物群（pylori_1和pylori_2）具有显著较高的肝硬化患者比例。2号肠吻合器在结构和功能方面的差异最明显，其EVL和严重胃肠道症状的患者相对较多。我们的研究表明，胃微生物群，上消化道症状和肝硬化EVL等侵入性治疗之间存在潜在有必要进一步开展大规模队列研究，以确认胃微生物群、侵入性治疗和症状之间的关系此外，具体机制和微生物靶向治疗，以减轻胃症状需要探索。确认本工作得到了国家自然科学基金（81790631）和浙江省自然科学基金（LY15H030012）的资助。遵守道德操守准则Yanfei Chen、Jing Guo、Chunlei Chen、Ding Shi、DaiqiongFang、Feng Ji和Lanjuan Li声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.04.014上找到。引用[1] Tilg H，Cani PD，Mayer EA.肠道微生物组和肝脏疾病。Gut 2016;65（12）：2035-44。[2] QinN，Yang F，Li A，Prifti E，Chen Y，Shao L，et al. 肝硬化患者肠道微生物组的改变。Nature2014;513（7516）：59-64.[3] Acharya C，Sahingur SE，Bajaj JS.微生物群、肝硬化和新出现的口腔-肠道-肝脏轴。JCI Insight2017;2（19）：94416.[4] [10]杨文，杨文. 与肝硬化患者牙周炎相关的独特龈下微生物群。Sci Rep 2018;8（1）：10718。[5] Bajaj JS ， Betrapally N ， Hylemon PB ， Heuman DM ， Daita K ， WhiteMB，等. 唾液微生物群反映肝硬化肝性脑病患者肠道微生物群的变化。肝病学2015;62（4）：1260-71。[6] 陈永峰，杨峰，卢华，王宝，陈永，雷丹，等。肝硬化患者粪便微生物群落的特征。肝病学2011;54（2）：562-72。[7] BikEM，Eckburg PB，Gill SR，Nelson KE，Purdom EA，Francois F，et al. 人类胃中细菌微生物群的分子分析。Proc Natl Acad SciUSA 2006;103（3）：732-7.[8] 作者：Rosenvinge EC，Song Y，White JR，Maddox C，Blanchard T，BronkeWF. 免疫状态，抗生素药物和pH值与胃液微生物群的变化有关。ISMEJ 2013;7（7）：1354-66。[9] 吴文文，杨义生，彭路华.胃中的微生物群：新的见解。J Dig Dis2014;15（2）：54-61.[10] Liu X，Shao L，Liu X，Ji F，Mei Y，Cheng Y，et al. 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