微塑料和三苯基锡的联合毒性对水生生物肠脑轴功能的影响及环境风险评估

环境科学与生态技术16（2023）100266原创研究微塑料和三苯基锡的联合作用：来自肠脑轴的张思琪a，b，1，李平a，1，何淑文a，邢少英a，曹志涵a，赵学礼a，孙翠慈b，李志华a，*a山东大学海洋学院，山东威海，264209b中国科学院南海海洋研究所热带海洋学国家重点实验室，中国广州我的天啊N F O文章历史记录：收到日期：2022年9月29日2023年3月8日2023年3月13日接受保留字：水生生物复合毒性生态风险环境浓度A B S T R A C T微塑料是一种新兴的污染物，它不仅对水生生物具有直接的毒性作用，而且通过吸收其他污染物而产生复合毒性。三苯基锡（TPT）是应用最广泛的有机锡化合物之一，对水生生物具有一定的毒性。然而，关于MP和TPT对水生 生物的联合 毒性知之甚 少。为研 究MPs和 TPT的个体 和联合毒性 ，我们选 择鲤鱼（ Cyprinuscarpio）进行了42天的暴露试验。根据严重污染地区的环境浓度，MPs和TPT的实验浓度分别设定为0.5mg L-1和1 mg L-1通过检测鲤鱼肠道生理功能，生化参数、肠道微生物16S rRNA和脑转录组测序。结果表明，TPT引起鲤鱼脂质代谢紊乱，MP引起免疫抑制。当MP与TPT联合使用时，TPT的参与放大了MP诱导的免疫毒性作用。本研究还探讨了鲤鱼免疫抑制的肠脑轴关系，为评价MPs和TPT的联合毒性提供了新的思路。同时，本研究为评价水环境中MPs和TPT的共存风险提供了理论依据。©2023作者由爱思唯尔公司出版代表中国环境科学学会这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍塑料污染已被联合国环境规划署宣布为我们这个时代最严重的环境问题之一，塑料碎片已成为全球公认的新兴环境问题[1]。由于不可避免的释放，塑料，特别是微塑料（MP;小于5 mm的塑料颗粒）[2]，在海洋，河口，淡水和沉积物中被检测到[3，4]，甚至在北极和南极的偏远地区也被发现[5，6]。微塑料有各种形状，包括球形、纤维状、碎片状和薄膜状[7，8]。除了较大塑料的分解*通讯作者。山东大学海洋学院，山东威海264209。电子邮件地址：lizh@sdu.edu.cn（Z.- H. Li）。1对本文的贡献。微塑料“在西班牙的格拉纳达、东北大西洋和印度的奥里萨邦海滩都发现了球形MP[10]。随着塑料废弃物的不断降解和初级MP产量的增加，水中球形MP的残留量迅速增加因此，本研究选择球形一次MP颗粒作为研究对象。许多研究发现，MP可能对水生生物群产生负面影响。例如，MP暴露可影响生物体的生长和繁殖[11，12]，抑制代谢[13]，诱导免疫毒性，导致神经毒性[14]，以及内分泌紊乱[15]。肠道是主要的消化、吸收和免疫器官，在维持生物体生命活动中起着重要作用[16]。因此，肠道是MP潜在的靶器官，值得进一步研究.近年来，许多研究表明，https://doi.org/10.1016/j.ese.2023.1002662666-4984/©2023作者。由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表环境科学与生态技术期刊主页：www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.comS.- Q. Zhang，P.李，S.-W. He等人环境科学与生态技术16（2023）1002662×þ¼×-导致肠道菌群失衡，增加有害细菌的比例。同时，肠屏障功能也会受到MP的影响，即肠绒毛和粘液层的结构会发生变化[17，18]。肠脑轴是脑与肠之间的相互信息交换系统，由神经内分泌、迷走神经和免疫通路组成，在宿主发育、代谢和生理学中起着核心作用[19]。脑组织是“肠脑轴”中的重要环节，是环境污染物主要积聚的组织[ 20，21 ]，MP很可能通过血脑屏障对生物脑组织造成损伤。作为一种新兴的污染物，MP不仅通过食物链对生物体产生直接毒性[22]，而且由于其疏水表面和高表面积，它们还可以吸附并与其他环境污染物相互作用，导致联合毒性[23]。有机锡化合物（OTCs）由于其优异的一般性质而广泛用于工业，农业和水产养殖领域，但这导致了严重的水污染[24，25]。近年来，三苯基锡（TPT）污染已成为人们关注的话题例如，沙特阿拉伯水域和南非开普敦港口的TPT浓度最高分别达到1.9和23008.0± 0.03 × 10- 3mg L-1[26]。污水是MP和OTC的主要来源，因此与这两种污染物共存的风险很高[27]。据报道，MP和营养状况可以减轻食物暴露期间TBT对朝鲜臂尾轮虫的毒性，但TBT诱导的毒性及其遗留效应是不可避免的[28]。此外，在藻类暴露于MP与TPT组合的研究中，发现MP破坏了小球藻细胞的结构，从而增加了细胞对TPT的吸收并放大了毒性作用[29]。相比之下，MP不仅难以破坏硅藻的致密二氧化硅外壳，而且还可以吸附水中的TPT，降低水中的TPT浓度以及对硅藻的毒性作用[30]。目前，关于MP和OTCs对水生鱼类的联合毒性的报道很少，尽管它们共存的风险很高更重要的是，MP可以作为污染物的载体，如多硫酸盐和金属，通过非自愿摄入到达鱼类的肠道[31e33]。因此，有必 要 研 究 MPs 和 TPT 对 鱼 类 的 联 合 作 用 。 通 过 研 究 多 环 芳 烃（MPs）和三苯并噻吩（TPT）对鲤鱼（Cyprinus carpio）的联合毒性，全面探讨MPs和TPT共存鲤鱼常被用作受污染水生态系统的生物指示物，也是许多国家重要的水产养殖品种在本研究中，鲤鱼暴露于TPT，MPs，TPT与MPs的组合42天。考虑到MPs对TPT的吸附作用，推测MPs对鲤鱼的联合毒性可能低于TPT的单独毒性，但大于MPs单独毒性。为了验证这一假设，我们研究了肠道Escherichia coli，分析脑组织转录组测序结果，观察肠道糖蛋白分泌，检测生化指标及免疫、脂代谢相关基因的表达。结合微生物-宿主关系，探讨了MP与TPT联合毒性对鲤鱼肠-脑轴的影响，为评价MP与TPT联合毒性的风险提供理论依据。2. 材料和方法2.1. 化学品和试验鱼聚苯乙烯MP珠粒（直径：200 nm）购自无锡瑞高生物科技有限公司公司（中国无锡）。 通过扫描电子显微镜TES-CAN VEGA 3（Brno，Czech Republic）确认珠粒的形态（图1B）。S1）。最终浓度MP处理组的浓度为0.5mg L-1（将浓度为0.025g mL-1的600mL MP悬浮液加入30 L的水）。考虑到MP的尺寸依赖性毒性和塑料微球是否可以穿透生物体中的各种屏障的不确定性，我们选择了粒径为200 nm的亚微米塑料MP暴露组的MP浓度是参考先前的研究设定的[34，35]。三苯基氯化锡（纯度>96%，CAS：639-58-7）购自上海阿拉丁生化科技有限公司，Ltd.（Shanghai，China）.根据以前的研究[36]，TPT氯化物股票溶液制备到浓度300ng m L-1的DMSO溶液中，暴露组中DMSO的最终浓度小于0.001%。最终浓度根据沙特阿拉伯和南非开普敦水域中TPT的最高实际环境浓度，将处理组中的TPT设定为1m g L-1，该浓度可高达mg L-1 [26，37]。幼鲤（Cyprinus鲤鱼）（16.70 ± 4.72 g，（11.67± 1.20）cm）来自中国天津市新大养鱼场相对肥满度K（KW（g）/L（cm）3100）见表S1。在暴露实验之前，鲤鱼在实验室中暂时适应一周。将鱼随机分为四组（每组三个缸），每个玻璃缸中饲养6条健康鲤鱼，每个玻璃缸中有30 L水。在此期间，每天两次（上午9：00，下午15：00每两天换一次水，以去除残留的诱饵和代谢废物。暂养池为控温循环系统（pH7.6± 0.2，23± 1摄氏度），并设置了几个充气石，以确保足够的水中的氧气。本研究中对鲤鱼的所有实验操作都得到了当地动物伦理委员会的批准。2.2.实验设计和取样暴露试验在鲤鱼暂时适应一周后进行。对照组为1 mg L-1 TPT，0.5 mg L-1 MP和1mg g L-1 TPT0.5 mg L-1 MP（TPT_MP）根据污染物的实际环境浓度，考虑到最严重的污染情况，设立了处理组。暴露组设置喘息期的条件暴露期间，水质参数和摄食与适应期一致。我们每两天更换2/3的水，并加入污染物原液，以确保浓度稳定对所有溶液样品进行了分析，测得的TPT浓度（0.93± 0.10 mg L-1，相当于1.0 mg L-1）在20%以内标称浓度，符合OECD指南(OECD化学品测试指南编号204，“鱼，长期毒性试验”）。在连续暴露42天后，从每组中随机选择6条鱼（每组每个水箱中2条鱼）进行采样。鲤鱼在取样前24 h内不进食用MS 2 2 2（2 0m gL-1，甲磺酸三卡因）麻醉鲤鱼后，测定其体重和体长的切开鲤鱼腹部，迅速分离肝脏，取出肠组织然后，切开鲤鱼的头盖骨，用镊子小心地取出脑组织。将部分肠组织固定于10%福尔马林溶液中观察组织结构，剩余肠组织将脑组织在液氮中速冻并在80 ℃下保存用于生化指标、RT-qPCR和脑转录组测序此外，本发明还六鱼是S.- Q. Zhang，P.李，S.-W. He等人环境科学与生态技术16（2023）1002663×-从每组中随机选择（每组每个水箱中两条鱼）进行肠内容物取样。饲喂6 h后取出肠内容物，进行16S rRNA序列分析。2.3.组织病理学检查经过一系列处理后，将固定在10%福尔马林中的肠组织包埋在石蜡中，切成4μm厚的切片，然后用过碘酸e希夫（PAS）染色采用ImageProPlus5.1（MEDIACYBERNETICS，Rockville，MD，USA）。2.4.肠道菌群分析每组随机抽取3份粪便样本进行肠道菌群检测。根据制造商的说明书，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen 51504）从粪便样品中提取DNA。使用引物通过PCR扩增16 S-rDNA基因的高变V3和V4 区 。 根 据 标 准 方 案 ， 在 Gene Denovo Biotechnology Co. 的Illumina平台上以等摩尔和配对末端测序（2 250）的形式合并纯化的 扩 增 子 。 （ 中 国 广 州 ） 。 详 细 步 骤 和 所 用 试 剂 见 支 持 信 息（S1）。2.5.生化参数测定将肠组织取出置于冰冷的冰板上，然后通过超声处理在冰冷的盐水中均质化。按比例（重量（g）：体积（mL）1/41：9）加入生理那个妓女在4℃和2000 g下离心10 min，取上清液并储存在80 ℃下用于分析。与肠道免疫相关的酶包括溶菌酶（LZM）、补体C3和免疫球蛋白（IgM）、丙二醛（MDA），肠道消化指标包括总胆固醇（TCHO）和甘油三酯（TG）。检测C3（ELISA，CD90026）和IgM（ELISA，CD90081）的ELISA试剂盒由武汉春都生物技术有限公司生产，Ltd.（武汉，中国）. LZM（比浊法，A050-1-1）、MDA（TBA法，A003-1-2）、TCHO（单试剂GPO-PAP法，A111- 1-1）、TG（单试剂GPO-PAP法，A110-1-1）、总蛋白（TP）（考马斯亮蓝法，A045-2-2）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按照生产商方案（S2）使用。所有生物化学指标均由Tecanenzymemaker（Ma€nnedorf，Switzerland）检测。2.6.脑转录组分析为了提取样品的总RNA，使用常规试剂盒去除rRNA我们进一步逆转录富集的mRNA以形成双链cDNA，修复cDNA的两端，添加接头，并通过PCR扩增以构建计算机化文库。为了确保测序的质量，通过琼脂糖凝胶电泳和NanoPhotometer分光光度计（Hangzhou，China）检测RNA的纯度。使用Gene Denovo Biotechnology Co.的Illumina Novaseq6000完成测序。（中国广州）。详细步骤和所用试剂见补充信息（S3）。RNA提取和RT-qPCR的方法与先前研究中的方法相同[38]。详细步骤包含在支持信息（S4）中。2.7.统计分析使用SPSS版本25（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）进行所有统计分析。数据表示为平均值±SD。使用Kolmogorov e Smirnoff检验和Levene检验检查所有数据的分布正态性和方差齐性。使用单因素ANOVA和事后Tukeye Kramer检验确定统计学显著性。当方差的正态性 不 明 显 时 ， 使 用 等 效 非 参 数 等 效 检 验 （Wilcoxon ， 事 后 SteeleDwass检验）。对于所有分析，当p 0.05时存在显著差异<。Pearson相关分析用于评估变量之间的相关性进行肠道生化参数与脑中基因的相关性分析。然后，使用O2 PLS分析和Spearman相关性分析，基于相关系数“r“和显著性“p“确定微生物和转录组数据之间的相关程度（|R|> 0.6;p0.05）。<3. 结果3.1. 肠组织糖蛋白粘液可以包围细菌并筛选代谢物或毒素，以限制其进入上皮组织，粘液中有许多分子可以发挥免疫调节作用。糖蛋白是由杯状细胞分泌的肠粘液的主要成分。 如图 1、观察各组小肠糖蛋白总面积和相对密度的变化。与对照组相比，TPT_MP组的糖蛋白总面积显著增加（p0.05），TPT 和TPT_MP处理组的糖蛋白相对密度显著增加（p0.05）。<<3.2.肠道微生物群前三门是梭菌门、变形菌门和拟杆菌门。在属的水平上，在鲤鱼肠道中发现了前三个属，即鲸类杆菌属、拟杆菌属和气单胞菌属（图1）。 2 a和b）。 PCoA（主坐标分析）显示，不同处理组鲤鱼肠上皮细胞的结构存在差异（图1）。 2 c）。 对指示物种的分析显示，在门的水平上没有显著差异。在属水平上，MP中的嗜水气单胞菌丰度与TPT_MP组相比显著下调。其他治疗组与对照组之间无显著差异（图11）。 2 d）。 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）途径在KEGG 1级分为六类：“代谢”、“遗传信息处理”、“细胞处理”、“环境信息处理”、“有机体系统”和“人类疾病”（图1）。S2）。此外，肠道细菌群落的网络复杂性、顶点数、边数、平均度和平均聚类系数在不同暴露组中存在差异。此外，组合暴露TPT_MP具有最高的网络复杂性，这可能是因为两种污染物的联合作用（图11）。 2 e）。 在KEGG水平3中，TPT_MP组中的脂代谢的功能丰度如“脂肪酸降解”、“类固醇生物合成”和“脂肪酸生物合成“高于对照组，而免疫功能丰度“NOD样受体信号传导途径“低于对照组（图1B）。 2 f）。S.- Q. Zhang，P.李，S.-W. He等人环境科学与生态技术16（2023）1002664联系我们¼-图1.一、 鲤鱼肠道组织经TPT、MP和TPT_MP处理后的PAS染色分析。放大倍数为100×和400×。图2给出了鲤鱼肠道糖蛋白的总面积和相对密度。所示值为平均值±SEM（n 1/46）。3.3.肠道生化指标与免疫基因如图3 a和表1所示，暴露42天后，TPT_MP组的TG和TCHO水平（p<0.05）显著高于对照组。MP组的MDA水平显著低于对照组（p<0.05），TPT组的水平显著高于对照组（p<0.05）。与对照组相比，TPT组的IgM水平、MP组的IgM和LZM水平以及TPT_MP组的三项免疫参数（IgM、LZM和C3）水平均显著升高（p<0.05）。鲤鱼肠道免疫相关基因的RT-qPCR结果如图10所示。 3b和表1。与对照组相比，TPT组的IL-6显著降低（p0.01），MP组的IL-1和IL-6显著降低（p0.01）。<<在TPT_MP组中，IL-6和IL-10显著降低（p0.05）。<3.4.脑转录组测序为了进一步研究TPT和MP对鲤鱼脑组织的单一/组合毒性，我们基于所检测基因的FPKM（每百万映射读取的每个酶的片段） 根据PCA结果，鲤鱼脑转录组样品高度相关（图1）。 4 a），同一处理组内重复样品的相关性均高于0.99（图S5）。每组上调和下调的基因显示在图1B中。 4 b（倍数变化1.5或1.5，p值0.05）。与对照相比，呈现了TPT组（上调：698;下调：712）、MP组（上调：592;下调：717）和TPT_MP组（上调：673;下调：969）中的差异表达基因（DEG）（图4b）。在三组中总共发现了171个DEG（图4c）。随后，为了进一步确定DEG的功能并区分治疗组之间的差异，进行KEGG分析，每组中的15条顶级途径如图所示。 4 d. 显然，TPT对“脂肪消化和吸收”和“PPAR信号通路”有显著影响。此外，MP影响免疫相关途径。“肠免疫IgA生成网络”、“Toll样受体信号通路”、“Th17细胞分化”、“NF-κB信号通路”显著丰富。一些与免疫相关的途径，如“ 肠免疫网络IgA 的产生” ， “ 细胞因子和细胞因子受体TPT_MP组中的“JAK-STAT相互作用为探讨TPT、MP和TPT_MP对鲤鱼的毒性效应，采用加权共表达网络分析（WGCNA）方法研究了肠道免疫参数对鲤鱼的毒性效应。通过RT-qPCR和探索途径中的基因关系验证结果WGCNA分析结果表明，FPKM值>5的基因可分为21个模块。根据肠道免疫参数与前20个模块的相关性分析，LZM与模块仿古白显著负相关（r0.72，p0.01）（图5a）。<模块antique white中基因的KEGG结果涉及免疫相关的NF-κ B信号通路和胰岛素信号通路（图11）。 5b）。 基因调控网络图显示了模块antique white中前10对转录因子的关联（图1）。 5 c）。为了验证KEGG途径，我们选择了免疫相关基因（TNF-α、PI 3 K、STAT、JAK、IKb-a ）和脂肪代谢相关基因（SCP-X、PAGR和CPT-2），并使用RT-qPCR检查它们的相对表达。8个基因的RT-qPCR结果趋势与转录组一致，证实了转录组结果的可靠性（图S3和图5d）。KEGG富集的免疫途径和脂质代谢途径之间的基因关系如图5 e所示。在DEGs的变化方面，TPT诱导了脂质代谢相关基因水平的增加，MP诱导了免疫相关基因水平的降低此外，TPT_MP组的差异基因表达变化显著因此，TPT与MP的共同暴露放大了污染物的单一毒性作用。3.5.鲤鱼肠与脑的相关性分析在这项研究中，肠道免疫和脂质代谢的生化参数与脑组织免疫和脂质代谢基因相关（图1）。图6a和b），目的是研究TPT、MP和TPT_MP暴露对肠脑轴的影响。 肠道免疫参数（LZM、IgM和C3）与脑组织中的免疫基因（TNF、STAT和Ikb-a）呈显著负相关。为研究鲤鱼肠道微囊丰度与脑免疫和脂代谢相关基因表达的关系，采用Spearman相关分析构建了鲤鱼肠道微囊丰度与脑免疫和脂代谢相关基因表达的聚类热图。在我们的研究结果中，细菌属丰度的水平与脑中的脂质代谢几乎没有相关性然而，大脑中的免疫相关通路与肠道之间的相关性是显著的，主要是在S.- Q. Zhang，P.李，S.-W. He等人环境科学与生态技术16（2023）1002665图2. TPT、MP和TPT_MP暴露后鲤鱼肠道微生物的种类组成和指示种分析。a.门级微生物种类的组成。b.属级微生物种类组成c，OUT（操作分类单位）水平的主成分（PCoA）分析d，属级指示种*p<0.05表示显著差异。基于相关性分析的肠道细菌群落共现网络。f、KEGG水平三功能丰度聚类分析。Pir4系、单囊藻属、芽藻属、Pirellula属和Blastopirellula属。这些属属于浮游菌门。“NOD样受体信号通路“中的基因主要与疫霉门的上述5个细菌属正相关。“NF-κ B信号通路”和“Th 17细胞分化”中的一些基因与肠上皮细胞增生正相关，而一些基因与肠上皮细胞增生负相关（图1）。 6 c）。脑基因和属丰度前20位肠道基因的网络相互作用图见图6d。这些基因也通过KEGG在免疫相关途径中富集（图1B）。 S4）。总之，鲤鱼肠道细菌与脑免疫相关基因显著相关。4. 讨论4.1. 对肠屏障肠道健康对鱼类的生长有重要影响[39，40]。肠道屏障在生命健康中占有不可替代的地位。它对各种刺激都有反应，能有效防止机体受到内源性S.- Q. Zhang，P.李，S.-W. He等人环境科学与生态技术16（2023）1002666图三. TP T 、MP和TPT_MP对鲤鱼肠道组织生理参数和免疫基因的影响a、肠道生化指标。b，肠道免疫基因的实时-qPCR结果所示值为平均值±SEM（n 1/46）。*p0.05，**p0.01，表示与对照组存在显著差异<<表1TPT、MP和TPT_MP对慢性暴露后鱼类测量参数影响的单因素方差分析源控制FTPTMPTPT_MP平均值±SD平均值±SDP平均值±SDp平均值±SDpTG0.0733 ±0.01703.7050.0971 ±0.02860.93340.08633 ±0.03180.99500.1703 ±0.05590.0259TCHOMDAIgMC30.04318 ±0.00102.2926 ±0.2156247.1250 ±33.4833100.5405 ±19.66111.48411.714.8822.0960.0431 ±0.00533mm 41.5816 ±0.4588309.2925 ±30.8460107.8831 ±13.84200.99990.02680.03860.98510.0411 ±0.01201.3434 ±0.253031304545 ±25.2121118.5372 ±16.72250.99940.00390.02590.62800.0549 ±0.01012.4449 ±0.2019360.3239 ±13.1050127.8055 ±11.73820.04060.22520.00580.03518LZMIgIL1IL-62.5694 ±0.31821.0175 ±0.19481.0206 ±0.2340266.75.69915.452.8472 ±0.31820.8562 ±0.25570.5800 ±0.23670.99800.73400.007818.8194 ±0.63650.4598 ±0.08630.2475 ±0.0642<0.00010.0097<0.000118.7500 ±1.50230.5338 ±0.42800.5798 ±0.1115<0.00010.02720.0230IL-10IL1-b1.0438 ±0.32321.0382 ±0.318010.130.37981.1232 ±0.37211.1235 ±0.85710.98150.99511.6213 ±0.47411.3940 ±0.69110.06130.75490.3172 ±0.17341.1376 ±0.43120.03090.9933微生物及其毒素[41]。粘液是屏障中的第一道物理防御。肠上皮细胞的结构受多种因素影响[42，43]，其结构变化可能介导多种疾病[44，45]。粘液可以包围细菌并筛选代谢物或毒素以限制它们进入上皮组织。此外，粘液中有许多分子可以具有免疫调节作用[47]。糖蛋白是杯状细胞分泌的肠粘液的主要成分。最近的研究表明，MP、金属及其组合可以增加鲤鱼肠粘蛋白基因的表达[48]，这与本研究的结果一致。我们发现，在联合暴露组中，肠道分泌的粘液糖蛋白显著增加。TPT_MP可能对肠道有毒性作用，通过刺激和调节粘液糖蛋白的分泌，促进肠道屏障功能，从而保护肠道免受外源性TPT_MP的侵害。基于糖蛋白密度和面积的变化，进一步证明TPT在TPT_MP联合暴露中起重要作用为进一步确定TPT与MP联合应用的毒性，对鲤鱼肠道菌群进行了16SrRNA序列测定在属的水平上，在以前的研究中，MP极大地改变了水生生物的肠道微生物[49，50]。在我们的研究中，MP治疗组与对照组之间没有显著差异对照组（Fig. 2 d）。 这可能是因为塑料、暴露时间和受试动物物种的不一致性，这对肠粘膜的不平衡有不同的影响[51]。 肠道功能是由PICRUST预测的（图。 2 f）。 在KEGG 3级，TPT_MP组变化最明显，肠黏膜免疫功能丰度较对照组降低。可能是TPT和MP的组合放大了MP诱导的免疫毒性。本实验中，MP和TPT_MP影响肠道脂质Meta和糖脂消化.事实上，根据先前的研究，MP抑制贻贝的淀粉酶活性[52]。TPT_MP组TCHO显著升高，TG呈上升趋势，表明TPT与MP联用会增加鲤鱼肠道脂质的积累。这可能是因为胆汁酸的肠道循环紊乱，影响脂质的消化吸收，导致脂质代谢紊乱[53]。而且，以往研究的结果与本研究的结果一致。三苯基锡具有诱导鱼类、两栖动物和哺乳动物脂肪积累的作用[ 54，55]。微塑料还可以诱导生物体中的葡萄糖和脂质代谢紊乱[56]。目前，很难阐明MP暴露诱导的生物氧化应激的生化机制，但MP可以S.- Q. Zhang，P.李，S.-W. He等人环境科学与生态技术16（2023）1002667图四、TPT 、MP和TPT_MP暴露鲤鱼脑组织的转录组分析。a、PCA分析。b，差异表达基因（DEG）的直方图c，差异表达基因（DEG）的维恩图d，鲤鱼脑组织中DEG显著富集的KEGG通路暴露于TPT、MP和TPT_MP（p 0.05）。<导致氧化应激参数紊乱[57]。Huang等发现，当孔雀鱼暴露于浓度为100和1000mg·L-1的MP 28 d时，MDA含量的增加表明MP确实引起氧化应激，过氧化损伤[58]。然而，在本研究中，结果相反。丙二醛是脂质过氧化的指标。MDA水平取决于ROS和自由基以及底物、不饱和脂肪酸的存在[59]。因此，MDA的减少可能反映了肠脂肪中高度不饱和脂肪酸（HUFAs）的减少. 这进一步表明，暴露于这些有毒物质可能会影响脂质代谢，可能是通过改变脂肪酸的分布和减少HUFA的比例，导致MDA的减少。此外，鱼类可以代谢醛类，MDA的减少可能与水解酶的激活有关[60]。溶菌酶、C3和IgM在动物中发挥重要的免疫作用[61e 64]。在本研究中，与对照组相比，TPT显著增加IgM水平，MP显著增加LZM和IgM水平。 这可能是因为鲤鱼肠道在接触污染物后分泌免疫因子，增加免疫屏障功能[65]。三苯基锡与MP联合使用将显著提高三种免疫参数的水平。MP组还显著增加IgM和LZM的水平。此外，TPT联合暴露组的趋势也高于其他治疗组。有趣的是，肠道的免疫参数在联合暴露后显著增加，其免疫功能可能被激活。此外，我们还发现TPT_MP可通过PICRUST2预测肠道免疫功能而抑制肠道免疫功能，使肠道免疫功能受到抑制。其原因可能是基因水平对相应污染物的反应比生化生理参数更敏感，也可能是污染物对基因水平的损伤导致基因水平下降此外，在基因水平上，MP和TPT_MP逐渐抑制免疫反应的发生。抗炎症细胞因子IL-10可抑制促炎症因子的表达并防止炎症的发展[66]。基于抗炎因子IL-10基因的表达水平，MP与TP联合使用时，可进一步放大MP的单一毒性作用，抑制抗炎因子的产生。综上所述，MP长期暴露会在鲤鱼肠道产生免疫毒性，在基因水平上抑制免疫功能的发生。总体而言，长期暴露于TPT_MP诱导了鲤鱼的肠道TG和TCHO水平，导致S.- Q. Zhang，P.李，S.-W. He等人环境科学与生态技术16（2023）1002668图五. 脑转录组与免疫、脂代谢相关基因表达的加权相关网络分析。肠道免疫功能与各模块的相关性分析。b，模块仿古白中的KEGG通路（p0.05）

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