新冠病毒刺突蛋白与人ACE2的质谱分析揭示了其糖基化和翻译后修饰特征

工程7（2021）1441研究冠状病毒疾病2019-文章新出现的冠状病毒HCoV-19刺突蛋白和人ACE 2的质谱分析揭示了携带老化聚糖和独特的翻译后修饰孙泽宇a，任克一a，张星b，陈京华b，蒋正义a，蒋静a，季飞扬a，欧阳晓溪a，Lanjuan Lia，a浙江大学医学院附属第一医院传染病诊疗协同创新中心国家传染病临床研究中心传染病诊疗国家重点实验室杭州310011b浙江大学医学院生物物理系低温电子显微镜中心，杭州310011阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年6月22日修订2020年7月5日接受在线预订2020年保留字：N-糖基化刺突蛋白hACE2结构A B S T R A C T2019冠状病毒病（COVID-19）大流行导致全球努力了解新发现的人类冠状病毒（HCoV-19）病毒的生物学特征在这项基于质谱（MS）的研究中，我们揭示了HCoV-19刺突蛋白（S蛋白）中21个可能的糖位点中，20个完全被N-聚糖占据，主要是寡甘露糖型。发现人血管紧张素I转化酶2（hACE 2）中的所有七个糖基化位点被完全占据，主要被复合N-聚糖占据。然而，糖基化并不直接有助于HCoV-19 S蛋白与hACE 2之间的结合亲和力。鉴定了其他翻译后修饰（PTM），包括两种蛋白质中的多个甲基化位点和hACE 2中的多个羟基脯氨酸位点。通过将N-聚糖和PTM添加到最近发表的低温电子显微镜结构中，建立了HCoV-19 S蛋白和hACE 2的精细结构模型。HCoV-19 S蛋白和hACE 2的PTM和聚糖图谱为研究HCoV-19的宿主附着和免疫应答机制提供了额外的结构细节，以及开发迫切需要的©2020 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍当前的冠状病毒大流行自2019年12月以来一直持续（2019冠状病毒病（COVID-19）），已成为全球卫生紧急情况[1 该疾病是由一种新发现的β-冠状病毒，人类冠状病毒2019（HCoV-19）（也称为人类冠状病毒2019（SARS-CoV- 2））引起的，它与SARS-CoV密切相关。与SARS一样，HCoV-19引起下呼吸道感染（LRTI），最终可能进展为非典型肺炎，需要重症监护和机械通气[4与SARS-CoV相比，HCoV- 19更具传染性，在全球范围内感染了更多的人，因此造成了更多的伤亡[4，5]。虽然可能的病毒宿主包括蝙蝠和穿山甲已被认为是HCoV-19的来源[3，7]，但需要更多的研究来确定其来源和人畜共患病传播途径[8迄今为止，*通讯作者。电子邮件地址：ljli@zju.edu.cn（L. Li）。对于冠状病毒感染（包括HCoV-19）没有特异性的疫苗或药物可用。与SARS-CoV相似，HCoV-19S基因编码的病毒粒子表面刺突糖蛋白对于靶细胞附着和融合过程是必需的[11鉴于刺突蛋白（S蛋白）在COVID-19发病机制中的重要性及其对疫苗开发的潜在免疫原性，在第一个HCoV-19序列发表后不久，全球就开始努力阐明S蛋白的结构[1，13，14]。HCoV-19 S糖蛋白是一种1273个氨基酸的前体多肽;它可以被宿主细胞蛋白酶（组织蛋白酶L，TMPRSS 2）切割成S1片段和S2片段，S1片段含有受体结合结构域（RBD）以连接宿主受体人血管紧张素I转化酶2（hACE 2），S2片段负责随后的膜融合[1，12，13]。预计S蛋白具有可切割的N-末端信号序列（1-https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.07.0142095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engZ. 孙，K.Ren，X.Zhang等人工程7（2021）14411442×糖基化是许多病毒刺突蛋白或包膜蛋白中最突出的翻译后修饰（PTM）之一，并且已显示介导宿主附着、免疫应答以及病毒粒子包装和出芽[15特别是，冠状病毒S蛋白与其各自受体的结合已被证明是由病毒寡聚甘露糖N-聚糖介导的[19，20，23]。此外，C型凝集素树突细胞特异性ICAM- 3-抓取非整联蛋白1（DC-SIGN）和肝/淋巴结特异性ICAM-3-抓取非整联蛋白（L-SIGN）可通过与S蛋白聚糖结合增强病毒进入[25，26]。因此，已经设计了许多抗病毒策略来干扰蛋白质糖基化或基于聚糖的相互作用[21，24，27，28]。糖基化也被认为是开发有效疫苗的关键方面[29，30]。与含有23个N-连接糖基化序列子（N-X-S/T，X-P）的SARS-CoV S蛋白一样，HCoV-19 S蛋白被预测为每个原聚体宿主22个序列子或每个三聚体宿主66个序列子然而，HCoV- 19 S蛋白S1区的潜在糖基化位点模式与SARS-CoV 不同，而S2区的糖基化位点在HCoV-19和SARS-CoV之间显著保守。S1糖基化模式的这种差异可能与HCoV-19的生物学和临床特征与其他冠状病毒的在这项研究中，我们报告了HCoV- 19 S蛋白和hACE 2的一个强有力的N-糖基化谱，以及其他PTM，通过高分辨率质谱（MS）分析阐明基于这些分析，我们重新解释了当前的HCoV-19 S蛋白结构模型，以突出与COVID-19发病机制相关的重要聚糖特征然而，我们证明了HCoV-19 S蛋白和hACE 2的结合不依赖于它们的糖基化状态。2. 材料和方法2.1. HCoV-19刺突胞外区和hACE 2的表达和纯化合成了HCoV-19 S基因（GenBank编号QHD43416.1），并对其密码子进行了优化，以用于昆虫细胞表达。将其胞外域（Val 16-Pro1213）克隆到pFastBac载体（Life Technologies Inc.，USA），其具有N-末端蜜蜂蜂毒肽信号肽和C-末端His 6和Flag标签。HCoV- 19 S蛋白在Sf 9昆虫细胞中使用Bac-to-Bac系统（Life Technologies Inc.）并从细胞培养培养基中收获;随后使用Ni-次氮基三乙酸（NTA）柱和Superdex 200凝胶过滤柱（GE Healthcare，UK）串联进行纯化程序。在HEK 293细胞中表达具有C-末端Fc标签的hACE 2的细胞外结构域（Gln 18-Ser 740，NP_068576.1），并通过蛋白A琼脂糖珠（GEHealthcare）纯化。2.2. 十二烷基硫酸钠为了测试HCoV-19加标物和hACE 2蛋白的糖基化状态，在37 °C下在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中通过PNGase F（NEB，1：50）将两种蛋白去糖基化过夜。然后通过15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析HCoV-19加标物和hACE 2蛋白的糖基化和去糖基化形式，然后进行考马斯蓝染色。2.3. 糖肽样品制备将蛋白质根据Ref.[31]第30段。简而言之，hACE 2和S蛋白首先减少10mmol·L-1将二硫苏糖醇在50 mmol/L碳酸氢铵（ABC）中在室温下烷基化45min，然后在室温下在黑暗中用碘乙酰胺烷基化45 min。然后使用丙酮沉淀来清洁蛋白质，并重悬于50mmol·L-1 ABC。然后使用测序 级 胰 蛋 白 酶 、 胰 凝 乳 蛋 白 酶 或 内 切 蛋 白 酶 Lys-C （ 均 购 自Promega，USA）在37℃下消化烷基化糖蛋白14 h，蛋白质：蛋白酶比例为1 ： 50 ，溶于50 mmol/LABC 中。使用水 -亲脂平衡柱（Waters，USA）将肽脱盐将肽样品分成两份。在37°C下，在50mmol·L-1用纯H2O18制备的ABC中，用PNGase F（NEB，1：100）将第一份重复样品去糖基化 过 夜 。 第 二 个 重 复 样 品 用 于 通 过 亲 水 相 互 作 用 液 相 色 谱 法（HILIC）富集完整的N-糖肽简而言之，GlycoWorks（Waters）柱用包含15 mmol/L乙酸铵和0.1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈上样缓冲液预处理将上样缓冲液中的肽应用于柱，并收集未结合的流过级分。用上样缓冲液洗涤柱两次。糖肽在0.1%TFA中洗脱在进行液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析之前，通过自制C18级尖对所有肽2.4. 液相使用连接到混合Q-Exactive HFX质谱仪（Thermo Scientific）的Ultimate3000纳流液相色谱系统（Thermo Scientific，USA）质谱仪以数据依赖模式操作，具有全扫描MS光谱，随后是MS2扫描，记录使用高能碰撞解离顺序分离用于片段化的前20个最强前体。使用Xcalibur软件2.3（Thermo Scientific）记录MS和MS/MS谱。分离和MS采集的详细参数分别见附录A中的表S1和S2。2.5. 生物信息通 过 MaxQuant （ 版 本 1.6.10.43; Max-Planck- Institute ofBiochemistry，Germany）针对UniProtKB的hACE 2半胱氨酸氨甲酰甲基化为固定修饰，蛋氨酸氧化和谷氨酸O18脱酰胺为可变修饰。Tryp-sin被设定为最多有两个遗漏的卵裂。第一次和主要检索的质量容差分别设定为15和4.5 ppm。对于综合PTM分析，在平行数据库检索 中分 别研 究了 磷酸 化（ S/T/Y ） 、乙 酰化 （ K ） 、甲 基化（K/R/E）、琥珀酰化（K）、巴豆酰化（K）、法尼基化（K/N-末端（N末端））、肉豆蔻酰化（K/N末端）、棕榈酰化或异戊烯化、糖基磷脂酰肌醇加成和脯氨酸氧化，以获得相应的变量修饰。将肽水平错误发现率设定为1%以过滤结果。可信识别PTM的定位概率为99% 。通过使用以下等式将修饰肽（ MP ）和相应的未修饰肽（NP）的峰强度除来计算每个PTM的位点占用率：MP/（MP +NP）100。为了研究N-糖基化形式，将获得的MS粗品通过pGlyco（版本1）搜索来自HILIC实验的文件Z. 孙，K.Ren，X.Zhang等人工程7（2021）14411443××2.2.2，中国科学院，中国）[32]针对相同的hACE 2和HCoV-19 S序列。将半胱氨酸脲基甲基化设定为固定修饰，而将甲硫氨酸氧化设定为可变修饰。胰蛋白酶被设定为具有多达两个缺失的裂解。前体和碎片 质 量 公 差 分 别 设 定 为 5 和 15 ppm 的 质 量 公 差 通 过 内 置 的pGlyco.gdb聚糖结构数据库注释MS2光谱内的潜在聚糖片段[32]。通过MaxQuant 特征检测算法提取每个糖肽的前体强度 所有 LC-MS/MS原始数据均保存在iProX数据库中，链接如下：https：//www. iprox.cn/page/PSV023.html;? url= 1631583654953 TDY8，密码：th 2 J;密码：B73 w。2.6. 结构模型精化通过GLYCAM-Web（https://dev.glycam.org/gp）下载或预测蛋白质数据库（PDB）格式的聚糖结构基于Coot中的先前模型（PDB代码：hACE 2为 6 M18，S蛋白为6VXX），通过在每个位点手动添加MS鉴定的聚糖，制备hACE 2和三聚体S蛋白的N-连接聚糖模型[33]。使用Coot生成每个模型中的修饰残基[33]。此外，HCoV-19 S蛋白和hACE 2复合物（PDB 6 M0 J）的模型用于显示结合区域周围PTM的位置。所有结构分析均由PyMOL（Schr dinger Inc.，美国）。2.7. 通过生物层干涉法HCoV-19 S 蛋 白 和 hACE 2 的 结 合 通 过 Octet Re 96 E（ForteBio，USA）干涉测量系统上的生物层干涉测量（BLI）测量简言之，使用氨基丙基硅烷生物传感器（18-5045; ForteBio）固定HCoV-19 S蛋白为了评估HCoV-19 S蛋白糖基化对结合的影响，首先将S蛋白与1000 U/mLPNGase F（NEB）或失活的PNGase F在37 °C下孵育14h。 在用动力学缓冲液（1 PBS，pH 7.4，0.01%牛血清白蛋白（BSA）和0.002%吐温20）洗涤后，通过将传感器暴露于浓度分别为6.25、12.5、25、50、100和200 nmol·L-1的动力学缓冲液中的hACE 2，在30 °C下测量HCoV-19 S蛋白和hACE 2之间的缔合180 s。在结合阶段之后，将传感器暴露于1个动力学缓冲液以在30 °C下解离300秒。在使用等摩尔结合模型进行数据拟合之前减去信号基线。平均结合速率常数（kon）和解离速率常数（koff）使用所有数据用全局拟合模型确定还使用与不同浓度的HCoV-19 S蛋白溶液孵育的hACE 2 负载的传感器进行了分离实验类似地，通过PNGase F或失活的PNGase F预处理固定化的hACE 2以评估hACE2糖基化对结合的影响。在所有实验中，通过在75 °C下加热10分钟使PNGase F失活。3. 结果3.1. HCoV-19 S蛋白和hACE 2如图1（a）所示，PNGase F去糖基化导致HCoV-19 S蛋白和hACE2在SDS-PAGE上的分子量降低。通过PNGase F的消化从N-X-S/T基序内的Asn释放N-连接的聚糖，这也通过失去一个氢和一个氮而导致Asn脱酰胺化，同时结合-N-连接的聚糖。从溶剂中分离出一种氧[34]。为了对糖基化位点进行彻底的研究，将来自两种蛋白质的蛋白酶消化的肽在H2O18中进行PNGase F去糖基化;这使得O18能够掺入，并导致+2.98Da质量增量，其用于标记糖基化位点。通过LC-MS/MS分析来自S蛋白的去糖基化肽，证实存在20个N-连接的糖基化位点，包括N61 、N74 、 N122 、N165 、 N234 、N282 、N331 、N343 、 N603 、 N616 、 N657 、 N709 、N717 、N801 、 N1074 、 N1098 、 N1134 、 N1135 、 N1136 、 N1137 、N1138、N1138 、N1139 、N1139 、N1139、N1310 、N1311 、N1311、N1312 、N1314 、N1313 、N1314、N1315 、N1316 、N1314、N1315、N1316、N317、N318、NN1158、N1173和N1194（表1）。两个剩余的N-X-S/T位点-N17和N149位点-未在任何去糖基化肽中鉴定然而，具有糖基化N149的肽在没有PNGase F处理的情况下被直接鉴定，如稍后所述，导致HCoV-19S蛋白中具有N-X-S/T序列子的22个潜在位点中总共有21个糖基化位点（图1B）。 1（b））。此外，位点占有率的定量分析显示，18个位点完全糖基化，而N603和N657分别达到43%和74%的占有率（表1）。图1（c）提供了显示N331和N343糖基化证据的质谱示例。位点占有率的定量分析显示，hACE 2中所有7个可能的糖基化位点-即N53、N90、N103、N322、N432、N546和N690-均被完全糖基化（表1）。图1（d）提供了显示N90糖基化的质谱的实例。这些数据表明HCoV-19 S蛋白和hACE 2都被N-聚糖高度修饰3.2. HCoV-19 S蛋白和hACE 2为了揭示除糖基化以外的可能的PTM，对来自HCoV-19 S蛋白和hACE 2的去糖基化肽的LC-MS/MS数据进行了几轮光谱数据库匹配，以获得常见的PTM。在两种蛋白质中发现的主要PTM是赖氨酸、精氨酸或谷氨酸上的甲基化，如表1所总结。使用大于50%的占有率作为鉴定主要用PTM修饰的位点的标准，我们发现HCoV-19 S蛋白中的R78、E224、E654和E661以及hACE 2中的E57、K68和E329高度甲基化。此外，发现hACE 2中位点253、263、321和346处的脯氨酸被显著氧化并转化为羟脯氨酸。然而，在HCoV-19 S蛋白和hACE 2中未发现常见的PTM，如磷酸化、乙酰化或其他形式的脂肪酸酰化。3.3. HCoV-19 S蛋白和hACE 2的全局N-糖基化谱为了解析HCoV-19 S蛋白和hACE 2表面上的聚糖伪装，将源自蛋白酶消化并通过HILIC分级分离的完整糖肽直接进行专门设计用于检测由于N-聚糖附着而具有额外分子量的肽的LC-MS/MS分析。由于聚糖链的高度异质性，在我们的研究中将独特的糖肽指定为独特的肽序列和特定的N-聚糖组成的组合。根据这些标准，分别从HCoV-19 S蛋白和hACE 2中鉴定出419和467个独特的N-糖肽（表2和3）。除N1134外，在PNGase F实验中鉴定的20个HCoV-19 S糖基化侧中，有19个通过完整糖肽分析得到确认。此外，还发现N-聚糖存在于位点N149。尽管hACE 2中的所有7个糖基化位点先前在用脱酰胺标记的去糖基化肽中鉴定，但在5个位点获得N图附录A中的S1提供了HCoV-19 S蛋白和hACE 2的N -糖肽光谱示例。Z. 孙，K.Ren，X.Zhang等人工程7（2021）14411444Fig. 1. HCoV-19 S蛋白和hACE 2中的潜在糖基化位点。(a)完整和去糖基化形式的HCoV-19 S蛋白和hACE 2的15% SDS-PAGE分析。分子量标记显示在左侧。(b)HCoV-19 S蛋白（上图）和hACE 2（下图）的功能亚基和结构域的示意图。CD：连接结构域; CH：中央螺旋; CT：胞质尾区; FP：融合肽; TM：跨膜结构域; UH：上游螺旋; HR 1/2：七肽重复序列1/2。蓝色表示可能负责S蛋白和hACE2之间相互作用的结构域或氨基酸指出了每个结构域内的潜在糖基化位点红色标记代表本研究中鉴定的糖基化位点（c，d）去糖基化肽的质谱，（c）HCoV-19 S蛋白中含有N331和N343，（d）hACE 2中含有N90NTD：N-末端结构域; PD：肽酶结构域; CLD：C-末端凝集素样结构域; de：脱酰胺。在HCoV-19 S蛋白中发现总共144个N-聚糖，其中大多数含有共同的N-乙酰葡糖胺核心（表2）。S蛋白中的所有N-糖基都与多种类型的N-聚糖连接，其中N343被最多样化的N-聚糖修饰。HCoV-19 SN-聚糖组合物优先由低甘露糖或高甘露糖寡糖组成，除了在四个N-糖位点（N73、N343、N717和N1173）中含有高比例的复合和杂合N-聚糖（图1A和1B）。 2（a）和（b）及表2）。基于LC-MS强度，寡甘露糖Hex 3 HexNAc 2是HCoV-19 S蛋白中最常见的N有趣的是，在HCoV-19 S蛋白的N在hACE 2中共发现220种N-聚糖;其中93%为复合聚糖，而杂合、高甘露糖和寡甘露糖聚糖分别仅占4%、2%和1%（图2（a）和表3）。基于LC-MS强度，最主要的hACE 2聚糖为NeuGc 1Hex 5 HexNAc 4，预测其为远端含有唾液酸的双触角复合物。所有hACE 2位点的N-聚糖谱主要是复杂的。值得注意的是，N90、N103和N690都含有超过100种类型的N-聚糖，其最主要的形式都含有唾液酸。总的来说，我们的LC-MS/MS数据证实了HCoV-19 S蛋白及其受体hACE 2在其预测的大部分N-X-S/T序列子处确实是高度N图2（c）提供了HCoV-19 S蛋白和hACE 2的每个位点的最主要N-聚糖组成和预测结构3.4. 用聚糖和PTM细节精制的HCoV-19 S-hACE 2复合物的结构建模通过基于LC-MS/MS结果将每个位点处最丰富的N -聚糖的化学结构添加到HCoV- 19 S蛋白和hACE 2的最新冷冻电子显微镜（cyro-EM）模型中，我们生成了代表两种蛋白上N -聚糖最可能的空间分布的原子模型（图1A和1B）。3（a）和（b））。尽管由于模型6VXX中的残基缺失，S蛋白的四个位点（N74、N149、N1158和N1194）未在模型中显示，但我们的模型表明，包裹的N-聚糖屏蔽了超过三分之二的HCoV-19S蛋白表面，这可能导致宿主附着和免疫逃避。此外，HCoV-19 S蛋白和hACE 2模型均显示，HCoV-19 S蛋白的N331和N343以及hACE 2的N90处的聚糖与两种蛋白的结合区域接近，尽管不完全在其内部（图1A和1B）。3（c）和（d））。S蛋白-hACE 2复合物的模型3.5. HCoV-19 S蛋白与hACE 2的结合不依赖于N-糖基化为了了解蛋白质糖基化对HCoV-19 S蛋白和hACE 2之间相互作用的贡献，我们比较了Z. 孙，K.Ren，X.Zhang等人工程7（2021）1441表14451445在来自HCoV-19 S蛋白和hACE 2的去糖基化肽中鉴定的PTM总结网站PTM序列职业（%）HCoV-19 S蛋白61，74N-糖基化SSVLHSTQDLFLPFFSNa VTWFHAIHVSGTNa GTK10074N-糖基化HAIHVSGTNa GTKRF10078甲基化Ra FDNPVLPFNDGVYFASTEK100122N-糖基化TQSLLIVNNa ATNVVIK100IVNNa ATNVVIKVCEF100165N-糖基化VYSSANNa CTFEYVSQPFLMDLEGK100224甲基化DLPQGFSALEa PLVDLPIGINITR100234N-糖基化VDLPIGINa ITRF100282N-糖基化YNENA GTITDAVDCALDPLSETK100NENa GTITDAVDCALDPLSETKCTL100331N-糖基化RVQPTESIVRFPNa ITNL100三百三十一，三百三十四N-糖基化FPNa ITNLCPFGEVFNa ATR100340甲基化FPNITNLCPFGEa VFNATR2.02603N-糖基化GGVSVITPGTNa TSNQVAVL43.50616N-糖基化YQDVNa CTEVPVAIHADQL100六五四，六六一甲基化AGCLIGAEa HVNNSYEa CDIPIGAGICASYQTQTNSPR100657N-糖基化AGCLIGAEHVNa NSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPR74.80IGAEHVNa NSYECDIPIGAGICASY79.76七零九，七一七N-糖基化SNa NSIAIPTN a100801N-糖基化TPPIKDFGGFNa FSQILPDPSKPSK100Na FSQILPDPSKPSKRSF1001074N-糖基化Na FTTAPAICHDGK1001098N-糖基化VSNa GTHWF1001134N-糖基化VSGNCDVVIGIVNa NTVY100一一五八，一一七三N-糖基化Na HTSPDVDLGDISGINa ASVVNIQKEIDRLNEVAK99.171194N-糖基化NLNa ESLIDLQELGK99.73hACE253N-糖基化FNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNa ITEENVQNMNNAGDK100NYNTNa ITEENVQNMNNAGDKW10068甲基化NYNTNITEENVQNMnNAGDKa W10084羟脯EQSTLAQMYPa LQEIQNLTVK20.7490N-糖基化WSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNa LTVK100103N-糖基化LQLQALQQNa GSSVLSEDKSK100QLQALQQNa GSSVL100253羟脯LMNAYPa SYISPIGCLPAHLLGDMWGR98.35263羟脯LMNAYPSYISPIGCLPa AHLLGDMWGR88.57284羟脯FWTNLYSLTVPa FGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQR4.06289羟脯Pa NIDVTDAMVDQAWDAQR1.70321羟脯FFVSVGLPa NMTQGFWENSMLTDPGNVQK58.24322N-糖基化FFVSVGLPNa MTQGFWENSMLTDPGNVQK100VSVGLPN a100329甲基化FFVSVGLPNMTQGFWEa NSMLTDPGNVQK100346羟脯AVCHPa TAWDLGK88.88415羟脯NGANEGFHEAVGEIMSLSAATPa K0.68432N-糖基化SIGLLSPDFQEDNa ETEINFLLK100LSPDFQEDNa ETEINF100451羟脯QALTIVGTLPa FTYMLEK43.59469羟脯GEIPa KDQWMK4.09546N-糖基化CDISNa STEAGQK100HKCDISNa STEAGQKLF100565羟脯SEPa WTLALENVVGAK0.37583羟脯NMNVRPa LLNYFEPLFTWLK2.12612羟脯NSFVGWSTDWSPa YADQSIK0.21690N-糖基化ISFNFFVTAPKNa VSDIIPR100VTAPKNa VSDIIPRTEVEKAIRM100Na VSDIIPRTEVEK100一 修改网站。在BLI实验中，纯化的hACE 2胞外域与固定在生物传感器表面的糖基化和去糖基化的HCoV-19 S胞外域（ECD）的结合动力学和亲和力我们发现hACE 2与HCoV-19 S蛋白结合，该蛋白已用活性或非活性PNGase F预处理，其平衡解离常数Kd分别为1.7nmol·L-1（图4（a））和1.5 nmol·L-1（图4本研究中测定的hACE 2与HCoV-19 S蛋白结合的亲和力与先前的报告一致[13]。 当HCoV-19 S ECD与固定化的hACE 2结合时，也观察到相当的亲和力（Kd= 16.7 nmol·L-1，图1B）。4（c））或去糖基化hACE 2（Kd=18.2 nmol/L，图4（d））。因此，我们的数据表明，gly-HCoV-19 S蛋白与hACE 2之间的结合并不直接影响HCoV-19 S蛋白与hACE 2之间的结合。BLI结合动力学的详细总结见附录A中的表S3。4. 讨论糖基化是一种普遍存在且复杂的PTM，其极大地扩展了许多蛋白质的结构和功能多样性。然而，蛋白质N-糖基化的全面表征在技术上具有挑战性。在这项研究中，脱糖基肽，这是更容易通过LC-MS分析比他们的Z. 孙，K.Ren，X.Zhang等人工程7（2021）14411446表2HCoV-19 S蛋白中糖肽和N-聚糖鉴定总结结构域位点序列最丰富组成最可能结构S1 61FSNa VTWF FSNa VTWHex6HexNAc 274SSVLHSTQDLFLPFFSNaVTWFHAIHVSGTNaGTKSSVLHSTQDLFLPFFSNaVTWFHAIHVSGTNaGTKRHAIHVSGTNaGTKRFFuc1NeuGc2Hex6HexNAc 4122TQSLLIVNNa ATNVVIKIVNNaATNVVIKVCEFLIVNNaATNVVIKVCEF149VCENFCNDPFLGVYYHKNNa K YHKNNaKSWMESEF HKNNaKSWMESEF165VYSSANNa CTFEYVSQPFLMDLEGK SSANNaCTFEY SSANNa CTFEYVSQPF234DLPQGFSALEPLVDLPIGINa ITR VDLPIGINaITRFHex3HexNAc 2Hex3HexNAc 2Hex4HexNAc 2Hex5HexNAc 2282YNENa GTITDAVDCALDPLSETKHex4HexNAc 2FPNa ITNLCPFGEVFNa ATRRVQPTESIVRFPNaITNLCPFRVQPTESIVRFPNa ITNL343FPNITNLCPFGEVFNa ATR CPFGEVFNaATRF GEVFNa ATRFHex3HexNAc 2Fuc1NeuGc2Hex5HexNAc 4603GGVSVITPGTNa TSNQVAVLYGGVSVITPGTNaTSNQVAVLFuc1Hex3HexNAc 2616 YQDVNa CTEVPVAIHADQLTPTW QDVNaCTEVPVAIHADQLTPTWQDVNaCTEVPVAIHADQLTPTWRVYYQDVNa CTEVPVAIHADQLQDVNa CTEVPVAIHADQL657AGCLIGAEHVNaNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRQTRAGCLIGAEHVNaNSYECDIPIGAGICASYIGAEHVNaNSYECDIPIGAGICASYQTRAGCLIGAEHVNa NSYHex3HexNAc 2Fuc1Hex3HexNAc 2S2 709SNa NSIAIPTNFHex3HexNAc717SNNSIAIPTNa F Fuc1NeuGc2Hex4HexNAc 4801 DFGGFNa FSQILPDPSKPSK DFGGFNaFSQILPDPSKPSKRTPPIKDFGGFNaFSQILPDPSKTPPIKDFGGFNaFSQILPDPSKPSK DFGGFN aFSQILPDPSK NaFSQILPDPSKPSKRSFS2（S20）1074NaFTTAPAICHDGKLHVTYVPAQEKNa FHex3HexNAc 2Hex3HexNAc 2109 EGVFVSNa GTHWFVTQRAHFPREGVFVSNaGTHWFVTQR VSNa GTHWFVSNa GTHWHex3HexNAc 21134b-1158NaHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKYFKNaHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKFuc1Hex3HexNAc2（接下页）Z. 孙，K.Ren，X.Zhang等人工程7（2021）14411447表2（续）结构域位点序列最丰富组成最可能结构1173YFKNHTSPDVDLGDISGINaASVVNIQKNHTSPDVDLGDISGINaASVVNIQKFuc2NeuGc1Hex5HexNAc 41194NLNa ESLIDLQELGKYEQYIK NLNaESLIDLQELGKFuc1Hex3HexNAc 2一 糖基化N位点。B 仅在去糖基化肽上鉴定的位点。表3hACE 2蛋白中糖肽和N-聚糖鉴别总结结构域位点序列最丰富组成最可能结构PD 53a-90EQSTLAQMYPLQEIQNb LTVKNeuGc1Hex5HexNAc 4103LQLQALQQNbGSSVLSEDKSKLQLQALQQNbGSSVLSEDKSKRFuc1NeuGc1Hex5HexNAc 4322a-423SIGLLSPDFQEDNb ETEINFLLKFuc1Hex3HexNAc 4546CDISNb STEAGQKFuc1Hex5HexNAc 4CLD 690 Nb VSDIIPRISFNFFVTAPKNb VSDIIPR一 仅在去糖基化肽上鉴定的位点。B 糖基化N位点。NeuGc1Hex5HexNAc 4糖基化前体，以确认HCoV-19 S蛋白和hACE 2中的N-糖基化位点。O18脱酰胺修饰确保了糖基鉴定的可信度，因为在H2 O18中PNGase F介导的水解过程中掺入了同位素。然后进行完整的N-糖肽分析，以进一步验证糖位点，并提供有关每个位点中相关N-聚糖的组成和结构异质性的详细信息。我们的研究表明，除了N17之外，HCoV-19 S蛋白中的所有位点都高度糖基化。根据S蛋白的N-连接聚糖模型，S蛋白表面的大部分被聚糖覆盖，这与之前的报道一致[13，14，35，36]。当比较HCoV-19和SARS-CoV的S蛋白时，值得注意的是，糖基化位点的大部分差异发生在远端S1亚基，导致由刺突三聚体簇形成的病毒最外层冠层中的聚糖谱存在这种糖基的改变可能是宿主或环境选择压力的结果，并可能意味着病毒感染性，发病机制和宿主反应的显着差异。在我们的研究过程中，我们注意到其他几个研究小组也试图解码HCoV-19 S蛋白的聚糖谱。所有这些研究都证实了HCoV-19 S蛋白是高度糖基化的[35，36]。S蛋白中的N-聚糖是显著异质的，可以极大地扩展构象灵活性和表位多样性，S蛋白的活性尽管在S蛋白中发现了一小部分复合和杂合N-聚糖，但大多数位点被寡聚甘露糖聚糖占据，这与先前关于SARS-CoV糖基化谱的报道一致[37许多病毒蛋白质的标志是高水平的寡甘露糖聚糖，可能是由于高糖基密度导致空间位阻而导致聚糖不完全成熟的标志[40]。有趣的是，N343，最接近结合表面的糖位点，被最多样化的N-聚糖修饰，主要是杂合和复合形式。此外，与SARS-CoV和马尔堡病毒蛋白的情况一样[41，42]，我们发现SARS-CoV S蛋白聚糖中的唾液酸掺入可以忽略不计。在全球正在进行的疫苗生产工作中，主要靶向S蛋白作为候选抗原，疫苗开发人员应考虑装饰大面积S三聚体表面的不同聚糖形式，因为聚糖可显著调节蛋白免疫原性。有趣的是，当我们将我们的数据与其他聚糖谱研究进行比较时，发现不同的表达系统可以显著影响聚糖形式[35，36]。特别是，与昆虫细胞相比，哺乳动物细胞因此，我们还应该预期，基于具有不同糖基化状态的不同S蛋白形式产生的疫苗可以显示出针对未来感染的不同功效冠状病毒S蛋白与其各自受体的结合已经证明Tors由病毒寡甘露糖介导Z. 孙，K.Ren，X.Zhang等人工程7（2021）14411448图二、HCoV-19 S蛋白和hACE 2中N-糖肽调查的总结（a）在任一蛋白质中鉴定的四种主要N-聚糖类别的总体百分比(b) 与任一蛋白质中的功能结构域相关的每个位点中最主要的N-聚糖形式的示意图。(c)每个位点中鉴别的四种主要N-聚糖类别的相对LC-MS强度以热图形式呈现，以及鉴别的聚糖总数以条形图总结N-聚糖[19，20，23]。SARS-CoV S蛋白含有三个RBD相关糖位点（N318，N330和N357），而HCoV-19只有两个（N331和N343）围绕结合口袋。与我们假设的这两个位点的N-聚糖可能对受体结合产生极性相互作用相反，BLI结合试验证明去糖基化并不改变SARS-CoV S蛋白与hACE 2的然而，这种阴性BLI结合结果并不排除糖基化可能影响其他病毒进入步骤的可能性，包括蛋白酶裂解和聚糖介导的与树突状细胞/肝脏/淋巴结特异性ICAM-3-抓取非整联蛋白的相互作用，据报道，这些作用可增强SARS-CoV进入[25，26]。需要进一步研究以确定糖基化在HCoV-19感染性中的作用。抗原糖基化在很大程度上决定了宿主的免疫应答。糖基化的一个突出后果是通过屏蔽病毒包膜或表面蛋白中的免疫原性表位而进行免疫逃避[17，43，44]。在HCoV-19 S蛋白的大多数糖位点中聚糖的完全占据表明病毒能够以隐形方式入侵宿主HCoV-19在感染早期成功的先天免疫逃逸可能解释了产生可传播病毒体的长时间无症状潜伏期[4，6]。还报告了HCoV-19再感染病例，表明病毒能够逃避抗体介导的中和作用[45]。另一方面，蛋白质糖基化也可以通过传感器分子或抗-对聚糖识别有特异性的抗体。N-聚糖是半乳糖凝集素的已知配体，并且可以触发炎症事件，例如细胞因子释放和免疫细胞浸润[46，47]-这可能有助于HCoV-19发病机制并与疾病严重程度相关。此外，流行病学研究表明，ABO多态性与HCoV-19和SARS-CoV感染的不同易感性相关[48，49]。由于ABH碳水化合物表位和病毒蛋白聚糖可能由相同的ER-驻留糖基化酶合成，因此抗A或抗B抗体可以部分阻断S蛋白的