红酵母生物合成纳米银的抗菌活性研究

埃及基础与应用科学杂志5（2018）228完整文章红酵母生物合成纳米银的抗菌活性研究。菌株ATL 72HodaSoliman，Ashraf Elsayed，Amira Dyaa埃及曼苏拉大学理学院植物学系阿提奇莱因福奥文章历史记录：2018年2月1日收到收到修订版，2018年4月12日接受，2018年2018年5月26日在线发布关键词：抗菌生物合成红酵母AgNPsA B S T R A C T本研究从埃及地中海盐沼中分离到一株红色酵母菌株ATL 72。系统进化树分析表明，该菌株与布氏红酵母（ Rhodotorula bloemfonteinensis ） EU075187 的 亲 缘 关 系 最 近 ， 相 似 性 为 40% 。 利 用 海 洋 粉 红 酵 母Rhodotorulasp.菌株ATL 72。 TEM分析不仅证实了AgNPs的合成，而且还描述了球形和椭圆形的纳米颗粒，除了尺寸测量范围为8.8至21.4 nm。生物合成的AgNPs通过引起广泛的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及具有低MIC值的真菌的生长的完全抑制而显示出强的抗微生物活性。总之，粉红酵母Rhodotorulasp.，从埃及分离的菌株ATL 72是用于合成银纳米颗粒的有希望的新生物来源，所述银纳米颗粒具有针对广泛的病原性细菌和真菌的有效抗微生物活性。©2018 曼 苏 拉 大 学 。 由 爱 思 唯 尔 公 司 制 作 和 主 持 这 是 一 篇 基 于 CC BY-NC-ND 许 可 证 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍红酵母是单细胞酵母，其特征在于高生长速率。它有一个黄色，橙色或红色，并被称为护理酵母或粉红色酵母，由于其生产的类胡萝卜素[1]。它广泛分布，并从土壤，淡水，花卉，海水和食物等几个来源中分离[2]。大量研究表明，红酵母属在生物技术领域中的重要性及其在未来工业中的重要应用，否定了将红酵母属视为嗜盐菌的观点[3]。金属纳米颗粒如银纳米颗粒（AgNPs）由于其特殊的化学、光学、电子和磁性特性而具有多种技术应用，这些特性与块体金属的特性完全不同[4]。AgNP的合成技术之一是生物合成[5]。这是一种高产、低成本、无毒和生态友好的方法，可以在纳米颗粒的合成中使用不同的生物资源，如植物、细菌、 真菌 、酵母 、藻类 和病 毒[6] 。最 近的 研究证 实了红 酵母 属（Rhodotorula）如微小红酵母（Rhodotorula minuta）[7]和红酵母属（Rhodotorula gravis）[8]合成金属纳米颗粒的能力。*通讯作者。电子邮件地址：hodasoliman博士_1964@yahoo.com（H. Soliman）。金属纳米颗粒，特别是银纳米颗粒在医学领域的最重要应用之一是将这些纳米颗粒用作抗菌剂。纳米颗粒对广谱革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的致死活性已得到批准[9]。本研究的目的是除了监测微生物生化变化和评价不同离心速度下分离的银纳米颗粒的抗菌活性外，为银纳米颗粒的合成增加一种新的生物来源。2. 材料和方法2.1. 海洋粉红酵母的分离纯化从地中海附近的盐场采集水样，采用连续稀释法进行稀释。从稀释液10- 5、10- 6和10- 7中，将100mL接种到50 ml液体富集培养基（酵母提取物5 g/l，葡萄糖10 g/l，1升海水）[10]。在接种过程之前立即加入推荐浓度的抗菌抗生素以控制细菌生长。将烧瓶在30 °C和180 rpm下在培养箱振荡器上孵育。每周，使用化合物划线法将各稀释液的样品置于琼脂富集培养基平板上，直至出现纯粉红色菌落。https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2018.05.0052314- 808 X/©2018曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbasH. Soliman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）228-2332292.2. 分离酵母的分子鉴定使 用 Fast DNA ® Spin Kit 提 取 菌 株 ATL 72 的 总 基 因 组 DNA（gDNA），然后使用通用正向和反向引物通过PCR反应扩增18 SrRNA基因; 18 S rRNA-F：5 0-TACCTGGTTGATCCTGCCAG-3 0和18 S rRNA-R：50-CCTTCCGCAG GTTCACC TAC-30[11]。的测序使用ABIPRISM® BigDyeTM终止子循环测序试剂盒进行PCR产物通过Finch TV版本1.4.0检查所获得序列的质量和数量。用CAP3软件进行基因连续序列的拼接。将分离株ATL 72的18S rRNA基因序列以登录号MG 021304提交至基因库，并用于使用Sea view软件和自动化BLAST搜索构建系统发育树，以检测与分离株ATL 72最接近的类型菌株。2.3. AgNP的制备向100 ml液体优化培养基（1 g/l酵母提取物、3.7 g/l麦芽提取物、35 g/l NaCl、7.7 g/l果糖和9 g/l尿素）中接种粉红色酵母，并在28°C下以150 rpm在振荡培养箱中孵育72 h。 之后，将液体培养物离心，并用无菌蒸馏水将沉淀物充分洗涤三次，以从培养基中除去任何残留物。为了得到无细胞的水提取物，将沉淀物在27.5 °C下以150 rpm加入到振荡培养箱中的100 ml无菌去离子水中过夜，然后离心以通过倾析-离心除去生物质。将AgNO3（1 mM）加入到水提取物中，并在黑暗条件下保持24 h[8]。对照烧瓶含有去离子水和AgNO3，不含细胞滤液。24小时后，对显示任何颜色变化的样品进行进一步分析。2.4. UV–Visible spectral analysis of使用颜色的视觉观察和光谱仪UV 2，美国）。注意到滤液在与硝酸银孵育之前是无色的，然后在银离子完全还原之后颜色变成深棕色使用分光光度计在200至800 nm的波长下扫描银纳米颗粒[12]。不含硝酸银的滤液用作空白样品。2.5. AgNP的透射电子显微镜（TEM）分析为了确定AgNP的尺寸和形状，使用透射电子显微镜（JEOL JEM-2100 ，美 国） 。通过 将AgNP 涂覆 到碳 涂覆的 网格 （G 200 型，3.05mm直径，TAAP，美国）上来进行该过程[13]。2.6. AgNP的选区衍射图案（SADP）分析SADP是一种使用透射电子显微镜完成的晶体学技术，需要约100nm和约100-400 KeV的能量电子伏的非常薄的切片样本2.7. 纳米银的抗菌活性及MIC测定以三种不同的速度4000、8000和14000 rpm离心AgNP，以研究它们在每种速度下的活性。将纳米颗粒的沉淀物干燥，称重并悬浮在1ml的THF并进行超声处理以获得均质化的悬浮液[15]。链球菌属，芽孢杆菌属、葡萄球菌属，志贺氏菌属，大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌属和假丝酵母属由埃及曼苏拉大学科学学院遗传工程和生物技术部提供，以研究生物合成的AgNP的抗微生物活性[16]。通过在10 ml LB培养基（10 g/l Pepton，10 g/l NaCl，5g/l酵母提取物）中培养100 mL每种病原体来活化这些病原体，并在37°C下以150 rpm振荡孵育24 h[17]。在10ml LB肉汤中，加入100mL来自每种速度（4000、8000和14，000rpm）的AgNP和100mL通过测量600 nm处的光密度（OD）监测微生物生长[18]。对于生物合成的AgNP的MIC测定[19]，将来自不同浓度（50、25、10、5、1、0.5和0.25）的100mLmg/ml）和100 mL来自每种测试生物体（E. 和芽孢杆菌属）。加入到5mlLB肉汤培养基中，在37 °C下振荡孵育24小时。将在肉汤培养基中具有接种物的AgNP用作阳性对照。通过测量600 nm处的平均OD监测结果[20]。2.8. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）采用SDS-PAGE研究了不同离心速度（4000和14，000 rpm）下收集的AgNPs对所选病原体E.大肠杆菌、假丝酵母属和芽孢杆菌属。在pH 7的IOOmM磷酸盐缓冲液中提取来自经处理的微生物的沉淀的总蛋白质。为了在丙烯酰胺凝胶上加载蛋白质，将来自每个样品的10 mg蛋白质浓度在2X样品缓冲液（2.5 ml Tris-HCl pH 6.8，10ml去离子水，4 ml 10%SDS，2 ml甘油和1 mlb-巯基乙醇）中煮沸2分钟。丙烯酰胺凝胶制备为两层;在12%分离凝胶上的4%堆积凝胶[21]。在100 V下进行电泳2小时，然后将凝胶在考马斯亮蓝R250中染色过夜，然后在振荡器上脱色几小时。使用凝胶分析仪3程序，分析凝胶。3. 结果3.1. 海洋粉红酵母的分离纯化在光镜下，分离的酵母菌株的染色细胞呈圆形，菌落光滑、柔软，颜色呈橙色（图1）。①的人。3.2. 分子鉴定通过系统发育树分析，将菌株ATL 72与红酵母属的近缘种进行了系 统 发 育 位 置 比 较 。 菌 株 ATL 72 。 结 果 表 明 ， 与 红 酵 母（Rhodotorula bloemfonteinensis）EU 075187的亲缘关系最近，相似性为40%。 二、3.3. AgNPs的生物合成无细胞水提取物与ImM硝酸银孵育后，颜色从橙色变为深棕色，这表明形成了纳米银，如图1B所示。3.第三章。230H. Soliman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）228-233Fig. 1. 在光学显微镜下（A）和平板上（B）通过简单染色法染色的红酵母属菌株ATL 72的显微图像图二、基于18S rRNA基因序列的系统发育树，分析显示了酵母分离株ATL 72与该属最接近物种的位置红酵母H. Soliman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）228-233231图三. 红酵母属菌株ATL 72的无细胞水提取物（A）和银纳米颗粒的胶体溶液（B）。3.4. UV–Visible spectral analysis of图4中所示的深棕色AgNP悬浮液的吸收光谱显示出具有450 nm处的峰的表面等离子体吸收带，这表明形成了纳米尺寸的颗粒和另一个峰~350。3.5. AgNP的TEM分析AgNP的TEM分析显示，纳米颗粒具有球形或椭圆形的可变形状，并且尺寸在8.8和21.4nm之间，如图5所示。3.6. AgNP的SADP分析在暗场上显示为亮斑的纳米银颗粒的衍射图案（图6）也反映了银纳米颗粒的晶体结构和衍射环。3.7. 银纳米粒子的抗菌活性及其MIC测定在OD600，所有病原体的生长，包括革兰氏阳性细菌（链球菌属，芽孢杆菌属、葡萄球菌（Staphylococcus sp.））和革兰氏阴性菌（志贺氏菌属，大肠杆菌、铜绿假单胞菌和克雷伯氏菌）以及一种真菌假丝酵母菌在处理后被收集的所有AgNPs完全抑制见图4。 UV–Vis spectra of AgNPs colloidal solution synthesized by the yeast红酵母ATL 72在500 nm处有一个平均峰。图五. TEM观察表明，纳米胶体呈球形或椭圆形，平均粒径为（8.8见图6。AgNP的选区电子衍射图。衍射环中含有银原子，呈光点状。在三种不同的离心速度4000、8000和14，000rpm下（表1）。通过任何速度沉淀的AgNP的浓度为1μ g/ml是完全抑制三种所选病原体芽孢杆菌属的生长的MIC浓度，E.大肠杆菌和念珠菌属（表2）。232H. Soliman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）228-233表1由粉红酵母合成的AgNPs对微生物生长的影响4. 讨论纳米生物技术是在纳米尺度上操纵材料的性质和行为以服务于人类的众多应用的科学分支[5]。在本研究中，ATL 72是一株产类胡萝卜素酵母菌，分离自埃及地中海形态学和分子生物学工具被用于菌株的鉴定18S rRNA 基因的树状图分析表明，该菌株与布氏红酵母（Rhodotorula bloemfonteinensis）EU075187的同源性这一结果表明，分离的红酵母菌株ATL 72可能是一个新的菌株。从分离菌株中生物合成纳米银3.8.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）从念珠菌属提取的蛋白质的SDS-PAGE分析，E.大肠杆菌和芽孢杆菌属对照并以两种分离速度用AgNP处理的蛋白质显示出蛋白质模式的可变变化（图7）。这些变化在高速分离下用AgNP处理时非常明显，而在低速分离下变化很小。一般来说，新的蛋白质条带的存在和增加的带强度与银纳米粒子处理的样品比未处理的样品。在大肠在4000 rpm速度下分离的处理和未处理样品中，蛋白质谱或条带强度没有变化。使用无细胞水提取物方法进行红酵母属ATL 72。由于酵母[22]和其他微生物[23]的水提取物中的还原蛋白质对AgNO3进行生物还原，上清液的深棕色升高。应用了一种基于样品差异冷冻和解冻的新技术，用于从酵母MKY3培养物中分离金属纳米颗粒[24]。除了合成多种酶和使用简单营养素快速生长外，由于在实验室环境中易于控制酵母，酵母菌株在NP的大规模生产中具有比细菌更多的益处[25]。银纳米颗粒通过表2粉红酵母合成的AgNPs对大肠杆菌生长的MIC（OD 600）。大 肠 杆菌、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）和念珠菌属（Candidasp.）沉淀速度4000 rpm8000 rpm14，000rpm生物体E. 杆菌芽孢杆菌念珠菌属物种E. 杆菌芽孢杆菌念珠菌属物种E. 杆菌芽孢杆菌念珠菌属物种浓1微克/毫升外径6000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.5mg/ml0.000.200.300.100.010.300.300.020.020.25微克/毫升0.200.000.170.300.200.120.300.200.30见图7。 念珠菌属蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，E.大肠杆菌和芽孢杆菌在2种分离速度下用AgNPs处理前后的分离结果。生物体速度4000 rpm8000 rpm14，000rpmOD600链球菌属0.000.000.00芽孢杆菌0.000.000.00葡萄球菌0.000.000.00志贺氏菌0.000.000.00大肠杆菌0.000.000.00红假单胞菌0.000.000.00克雷伯氏菌0.000.000.00念珠菌属物种0.000.000.00H. Soliman等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）228-233233~对于各种金属纳米颗粒[26]已经有文献记载，而另一个峰350可能归因于样品中污染蛋白质的存在。银纳米颗粒的TEM分析显示出不规则的椭圆形或圆形形状，显示出8.8至21.4 nm的尺寸，如在几个出版物中所明显的[7，8，24]。AgNPs对不同革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌的抗菌活性的结果表明，AgNPs对这些生物体的生长具有这些结果已被以前对白色念珠菌、肠道沙门氏菌、大肠埃希氏菌的广泛研究所证实.大肠杆菌和副溶血性弧菌[27]。此外，AgNPs可以肯定地用作有效的抗生素，E.大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌[28]。AgNPs作为抗微生物剂的效果取决于纳米颗粒的形状，如监测不同形状的AgNPs（球形、棒状和三角形）对E.大肠杆菌，并发现三角形纳米颗粒是最有效的形状[29]。所得AgNP的MIC结果（lmg/ml）在任何分离速度下都是相同的。该结果或多或少类似于用MIC值为2 μ g/ml AgNP处理的白色念珠菌的报道[30]，以及与两种E.大肠杆菌和芽孢杆菌处理的MIC值为1 μ g/ml AgNP [16]。另一方面，高对E. coli[31，20]。SDS-PAGE分析表明，念珠菌处理后蛋白质谱发生了定性和定量变化。和芽孢杆菌属（Bacillussp.）新条带的出现和条带强度的增加可能归因于AgNP诱导新蛋白质作为应激反应的能力[32]。而如果E.用AgNPs处理的大肠杆菌的蛋白质谱保持不变，尽管条带强度相对小于对照的那些。这意味着AgNP对蛋白质的巯基的亲和力导致蛋白质链的解折叠可能导致蛋白质的降解此外，先前的研究报道，AgNP可能通过抑制许多翻译因子而参与阻止蛋白质的合成[33，34]。总之，粉红酵母Rhodotorulasp.，菌株ATL 72是一种很有前途的新生物来源，可用于合成对多种病原细菌和真菌具有有效抗微生物活性的银纳米颗粒。致谢非常感谢曼苏拉大学科学学院机器人系前主任Samia Ali Haroun教授的持续支持和宝贵讨论。相互竞争的利益提交人声明，他们之间没有利益冲突。这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体的资助。引用[1] Marova I，Certik M，Breierova E.利用产胡萝卜素酵母生产富集生物质-全细胞酵母生物质在色素和其它脂类化合物生产中的应用。见：编辑达科·马托维奇博士。生物量的检测、生产和使用。InTech; 2011. 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