糖尿病和高胆固醇血症对肢体缺血胎儿骨细胞影响的研究

埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）第12卷主办方：完整文章糖尿病和高胆固醇血症对哈桑El-Sayyada，*，Heba A.穆罕默德·加韦特Al-Haggarb，伊曼·H Bakra，*a埃及曼苏拉曼苏拉大学理学院动物学系b埃及曼苏拉曼苏拉大学医学院儿科和遗传学系A R T I C L E I N F O文章历史记录：收到日期：2014年10月11日收到日期：2014年2014年12月16日接受2014年12月31日可在线查阅保留字：糖尿病高胆固醇血症成骨细胞胎仔TEM同工酶凋亡AB S T R A C T患有糖尿病或高胆固醇血症的患者发展为动脉粥样硬化并损害骨愈合。在目前的工作中，我们阐明了他们的作用，在肢体缺血的骨细胞分化的Wistar大鼠胎儿。将妊娠Wistar大鼠（每组n1/420）分为三组：对照组、糖尿病组或高胆固醇血症组。糖尿病是在妊娠第五天使用链脲佐菌素诱导的，高胆固醇血症是通过在受孕前6周喂食含有3%胆固醇的饲料来进行的。在产前13、15、17和19 d，处死孕鼠，解剖，取出胎鼠。分离后肢，进行组织学和透射电镜检查、骨化、胎儿总钙含量、同工酶碱性和酸性磷酸酶和乳酸脱氢酶电泳以及DNA损伤。糖尿病或高胆固醇血症母亲的胎儿表现出软骨细胞的组织细胞学分化延迟，骨膜骨化减少。碱性和酸性磷酸酶以及乳酸脱氢酶同功酶表现出改变的扩散速率和强度，反映了他们的活动在这两种疾病与对照相比，他们的带。骨钙含量的评估显示显着减少。发现糖尿病或高胆固醇血症母亲的胎儿软骨和骨细胞中梯状化程度（总DNA片段化）或单细胞凝胶电泳的基因组表达增加。作者得出结论，在该模型中，这两种疾病通过延缓四肢骨生长期间的组织学和细胞学分化，对胎儿发育具有选择性显著影响。这两种疾病增加了骨骼元素和血管中的平均细胞死亡，这是根据DNA损伤改变碱性和酸性磷酸酶和乳酸脱氢酶同工酶的结果。版权所有2014年，曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。*通讯作者。埃及&曼苏拉曼苏拉大学理学院实验胚胎学营养科学。联系电话：传真：20 0502246254。电子邮件地址：elsayyad@mans.edu.eg（H.I.H. El-Sayyad）。由曼苏拉大学负责进行同行审查。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2014.12.0032314- 808 X/版权所有2014年，曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持 这是一篇CC BY- NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp2埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）1e121.介绍高胆固醇血症是骨疾病的常见致病因素[1，2]。研究人员仍在弄清楚糖尿病如何改变胆固醇水平，以及如何导致动脉粥样硬化等血管并发症[3]。糖尿病[4]或高胆固醇血症[5]相互关联，并增加氧化应激和细胞损伤。最近，我们报道了患有糖尿病或高胆固醇血症的母亲表现出胎儿血管和心肌纤维的大量损伤[6]，并诱导明显的肝细胞损伤[7]，这可能与糖尿病或高胆固醇血症有关。在骨缺损中进行手术。极少数研究报告称，1型糖尿病通过减少新骨的形成改变了骨重塑，导致人类和动物骨质减少[8，9]。发现1型糖尿病导致骨折愈合的显著延迟[10]（Lu等人，2003）通过腰椎和股骨近端骨矿物质密度的降低[11]以及与正常个体相比骨形成的减少[8]。对糖尿病小鼠和大鼠的实验研究表明，该疾病与骨形成减少、骨钙素表达、胶原类型和骨愈合减少有关[10]，以及骨衬里细胞凋亡增加[11]。Kayal等人[12]观察到CD-1小鼠糖尿病发作16天后软骨组织和新骨面积减少Won等人[13]检查了6个月和12个月大的OLETF（糖尿病）大鼠的椎间盘，发现脊索细胞凋亡指数的发生率增加，导致早期椎间盘退变。与此同时，他们之间也有着千丝万缕的联系[1]。骨折风险增加是累积损伤的最终结果[14]。破骨细胞的形成和功能受到动脉粥样硬化形成中介导的许多炎症因子的影响，例如激活破骨细胞形成的肿瘤坏死因子-a[15]。在实验大鼠中，Funaba等人。[16]报道了10周龄高胆固醇血症大鼠的骨形成减少，表明存在骨生长抑制因子从文献中，没有报告说明对骨骼细胞分化的直接影响。本研究旨在阐明糖尿病或高胆固醇血症对Wistar大鼠出生前生长期骨元素的组织发生和细胞学结构、骨同工酶乳酸脱氢酶电泳以及后肢DNA损伤模式的确切作用。2.材料和方法2.1.诱导糖尿病在妊娠第5天，通过单次腹腔注射溶于柠檬酸盐缓冲液（pH 4.5）的链脲佐菌素（60 mg/kg）诱导实验性糖尿病[17]。对照动物接受生理盐水作为溶媒。通过测量约350 mg/dL的血糖来验证高血糖症。2.2.诱导高胆固醇血症根据Enkhmaa等人[18]，实验组喂食高胆固醇血症饮食。饮食的组成如表1所示。高胆固醇血症饮食由3%胆固醇和15%可可脂组成，符合标准饮食配方。大鼠在妊娠开始前喂养6周。对照组提供不含致动脉粥样硬化成分的标准饮食。2.3.实验动物工作本研究和所有程序均由埃及委员会的动物护理和生物伦理学批准，并且动物工作在Mansoura大学科学学院进行。从埃及卫生部Hellwan育种场获得80只体重约125 g的Wistar品系（Rattus norvegicus）可生育雄性和未交配雌性大鼠（1只雄性：3只雌性），用于实验。将它们圈养在通风良好的笼中，光照和黑暗周期为12小时将雌性动物交配过夜（1将妊娠大鼠分为三组（每组n=20），如下所示：C，对照组; D，糖尿病组;H，高胆固醇血症组。 动物保持在表1所述的自由过量饮食和自由饮水中。处理结束后，用乙醚麻醉处死，分别于出生后13、15、17、19 d解剖。立即从13、15、17和19 d龄胚胎中分离后肢胫骨区域，并进行如下研究：2.4.光学显微镜检查在13- 15日龄时切开对照和实验处理胎仔的后肢，并在10%磷酸盐缓冲福尔马林（pH 7.4）中固定，在递增等级的乙醇中脱水，在二甲苯中清洁，表1e对照组、糖尿病组和高胆固醇血症组中饮食成分百分比的描述成分（%）控制糖尿病高胆固醇血症粗蛋白16 16 14奶油脂肪，4 4 10无水胆碱酒石酸氢盐1 1 1胆固醇e e3胆酸e e2硫脲嘧啶e e2纤维素13 13 13酪蛋白10 10 15大豆油5 5 15维生素2.5 2.5 2.5矿物2.5 2.5 2.5水分7 7 7灰4 4 3蔗糖10 10 5碳水化合10 10 5玉米淀粉15 15 53埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）第12卷固定在58- 62摄氏度的熔融塑料切割连续5-mm组织切片，用苏木精和伊红染色，并在明视野光学显微镜下检查。2.5.透射电子显微镜检查将对照组和实验组的15日龄胎儿胫骨标本分离并立即固定在2%戊二醛的0.1 M二甲胂酸盐缓冲液（pH 7.4）中，12小时清洗后，将标本在4℃的1%四氧化锇缓冲溶液中后固定1.5 h，在递增等级的乙醇中脱水，并包埋在环氧树脂中。用LKB Ultratome IV（LKB Instruments，Bromma，Sweden）上的金刚石刀切割超薄切片，并固定在网格上，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并在Joel100CX 透 射 电 子 显 微 镜 （ Musashino 3-chome AkishimaTokyo 196- 8558，Japan）下检查。2.6.股骨、胫骨和腓骨用茜素红“S”法对所观察的胎鼠后肢骨化中心进行细致染色测量所有组中每个发育阶段10只胎仔的骨化股骨、胫骨和腓骨长度。2.7.胎儿钙的测定在产前15、17和19天，对对照组和实验组的新鲜胎儿（n1/410）进行钙含量测定。解剖胎仔，取出所有内脏器官，在60℃的烘箱中干燥6小时。通过使用氯仿甲基混合物2：1进行脂质提取。对胎仔骨骼进行称重，并在1 mL最高纯度硝酸中消化，然后用4 mL重蒸馏水稀释，并通过原子吸收光谱法测量钙[19]。2.8.乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶同工酶电泳为了测定乳酸脱氢酶（LDH;3.1.1.27），将组织匀浆并在4℃ 下以 3000×g 离心 5 min。加 入1 mL 蛋白 质染 料（0.001%溴酚蓝）和20 mL 2%蔗糖，并在酶电泳中将30mL利用LDH同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，并进行凝胶扫描的软件分析。电泳基本上根据Lehnert和Berlet[20]进行。根据Shaw和Prasad[21]的程序，在存在L-乳酸盐作为底物的情况下，对LDH酶带进行染色和可视化。然后使用α-磷酸萘酯作为底物和六氮化副玫瑰苯胺作为偶合剂，在pH 5.0下进行酸性磷酸酶（E.C.3.1.3.2），在电泳中运行，并进行可视化处理和拍照[23]。2.9.DNA片段分析DNA片段化通过Duke和Sellins的修改进行测定[24]。将新鲜分离的标本用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并悬浮于100 mL裂解缓冲液（10 mM Tris HCl/10 mMEDTA/0.5% Triton X-100，pH 8.0）中，涡旋混合，超声处理，并在冰上孵育20 min。在4 ℃（14，000× g）下离心后，将含有片段化（可溶性）DNA的上清液与裂解缓冲液（1 mL）混合。将两种样品在37° C下用RNA酶 A （ 0.5mg/mL ） 处 理 1 小 时 ， 然 后 用 蛋 白 酶 - K（0.4mg/mL; Sigma，St.Louis，MO，USA）在37° C下搅拌1小时加入20 mL 5 M NaCl和120 mL异丙醇后，将样品在220℃下孵育过夜，测定DNA浓度，并在琼脂糖凝胶电泳上电泳和可视化。2.10.单细胞凝胶电泳（彗星试验）将对照组和实验患病组的标本在含有75 mM NaCl和24mM Na2 EDTA（pH 13）的冷冻匀浆器缓冲液（pH7.5）中匀浆，以获得10%的组织溶液。将6mL匀浆悬浮在0.5%低熔点琼脂糖上，并夹在完全磨砂的载玻片上的0.6%正常熔点琼脂糖层和0.5%琼脂糖顶层在每个凝胶层的聚合期间，将载玻片保持在冰上。固化后，将载玻片在4 ℃下浸入裂解溶液（1%肌氨酸钠、2.5mM NaCl、100 mM Na2 EDTA、10 mm Trise HCl、1%Triton X-100和10% DMSO）中1 h，然后置于电泳缓冲液中以使DNA解旋。在300 mA和1 V/cm下进行电泳10min。用Tris HCL缓冲液（pH 7.5）中和载玻片，并用20 mg/mL 溴 化 乙 锭 染 色 。 使 用 Leitz Orthoplan（Wetzlar，Germany）落射荧光显微镜分析每个载玻片。使用Comet assay II自动数字分析系统[25]分析每个载玻片上的100个细胞。2.10.1. 统计分析对照组和各实验组之间以及各发育阶段之间进行统计分析。计算每个结果的平均值和标准差。采用Studentt检验，认为与对照组相比差异具有统计学显著性，P 0.05。<将染色的凝胶固定在7%乙酸（v/v）中并记录通过在HP Deskjet F370一体机上进行扫描。根据[22]，通过碱性缓冲液（pH 9.1）电泳分离肢体ALP。在18e20℃下，以2.5 mA/凝胶柱的恒定电流进行电泳。以萘酚-AS-MX-磷酸盐为底物，以坚牢红紫LB盐为偶合剂，对碱性磷酸酶（E.C.3.1.3.1）进行孵育。孵3.结果3.1.光和超微结构观察在光镜水平上，对照组13日龄胚胎的股骨和胫骨骨干中心均存在骨化中心额外的部分4埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）1e12图图1 13日龄胚胎后肢组织切片的显微照片。 每个图像（1e3）中的插图B表示相应图像中A的放大率。1.对照组，A.胫骨有初级骨化中心，指骨有肥大的软骨细胞。二、母体糖尿病胎儿A.显示胫骨和趾骨的骨化3.第三章。母体高胆固醇血症胎仔，A和C。显示胫骨和趾骨骨折缩略语：F：足部; OC：骨化中心; Pch：软骨膜; Ph：趾骨; POS：骨膜骨化; T：胫骨。上述区域以及跗骨、跖骨和趾骨显示出明显的骨化。股骨和胫骨干被软骨膜鞘包裹，除骨化中心外，有数层细胞厚，成骨祖细胞的芽侵入。中跗骨、Meta跗骨和趾骨具有肥大的软骨细胞（图1）。 11A &B）。相反，与对照组相比，糖尿病或高胆固醇血症母亲的13 d龄胚胎的股骨、胫骨和远端跗骨、跖骨和趾骨均出现延迟骨化股骨和胫骨骨膜骨化中心明显减少（图22A和2C）。图图2 15日龄胚胎后肢组织切片的显微照片1.一、对照组，A.胫骨和趾骨骨膜骨化B. 骨膜和骨侵犯。C. 指骨软骨膜细胞增多二、母体糖尿病胎儿A.胫骨显示钙化胫骨矿化减少B. 骨膜骨侵犯。C. 趾骨萎缩减少D. 软骨膜鞘和软骨细胞发育迟缓3.第三章。胎仔母体高胆固醇血症，表现为胫骨骨化减少（A和C）和指骨骨化（B）。缩略语：BM：骨髓; BT：骨小梁。5埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）第12卷在对照组15日龄胚胎中，在后肢区域的不同部位进行骨化，在肢体区域内具有特征性的规则排列的软骨区。骨化中心进行了显著的深棕色矿化钙盐沉积物的进展（图2，1A和 C）。相比之下，无论是糖尿病或高胆固醇血症母亲的15天龄胚胎表现出相对减少的骨化中心，图3e对照组15日龄胚胎胫骨的透射电镜照片。A.骨膜鞘形成。B.骨祖细胞与退化的软骨细胞非常接近。C和D.退变软骨细胞周围表面有丰富的钙沉积。E和F的大量的成骨细胞在退变的软骨细胞之间。G和H。骨膜鞘内的正常血管，具有正常的内皮衬里细胞。缩略语：CB：成软骨细胞;抄送：软骨细胞; DC：软骨细胞变性; DCC：软骨细胞变性;伦理委员会：内皮细胞;福：成纤维细胞;编号：核; OsB：成骨细胞;POS：骨膜骨化6埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）1e12与对照比较。检测到远端指骨的软骨化，但与对照不匹配（图2，2A-D和2，3A和 C）。在超微结构水平上，15日龄胎儿的对照胫骨在骨膜内和肥大的软骨细胞之间具有电子致密的矿化钙盐。骨膜鞘可见密集的成纤维细胞群和特征性的胶原纤维束。巨噬细胞和成骨细胞（代表骨祖细胞）的巢与分解的软骨细胞的钙化基质紧密相邻。成骨细胞的特征是存在发育良好的粗面内质网，具有扩张的池和包含多个堆叠的大型环状高尔基复合体（图3A和H）。与此相反，糖尿病或高胆固醇血症母亲的胚胎表现出畸形的软骨膜鞘，特别是存在缺乏细胞质树突形成的成纤维细胞。软骨细胞胞浆空泡化，胶原纤维存在 许多软骨细胞达到相当大的肥大，其细胞质区室和细胞核大量分解，核染色质聚集（凋亡）（图1A和1B）。 4 A e F和5 A e H）。3.2.股骨、胫骨和腓骨从图 6和7，15个19日龄糖尿病和高胆固醇血症母亲胎儿的股骨、胫骨和腓骨骨化长度与对照组相比显著降低。3.3.胎儿钙含量从图8可见，糖尿病和高胆固醇血症母亲的胎儿显示钙含量显著降低。3.4.碱性和酸性磷酸酶及乳酸脱氢酶活性的15、17和19日龄胎儿骨标本中碱性磷酸酶同工酶有三条带。糖尿病和高胆固醇血症母亲的胎儿扩散率显着增加同工酶组分III在19 d龄糖尿病和高胆固醇血症胎儿中出现缺失。另一方面，酸性磷酸酶同工酶的强度明显降低。同工酶的分离和双带的形成，图图4 15日龄母体糖尿病胚胎胫骨的透射电子显微照片A和B损伤的成纤维细胞形成软骨膜。C. 软骨细胞具有特征性的细胞核和薄的细胞质。D. 受损的成软骨细胞，细胞质中有囊泡状粗面内质网和电子致密线粒体。E和F的肿胀的血管，内皮内层有丰富的异染色质。缩略语：Fi：成纤维细胞; M：线粒体; RBC：红细胞; VRER：囊泡化粗面内质网。7埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）第12卷在糖尿病或高胆固醇血症组的19日龄胎儿中检测到（图11）。 9）。软骨和骨成分乳酸脱氢酶表达五种同工酶（LDH 1-LDH 5）（图11）。10 A）。糖尿病组和高胆固醇血症组在15 d龄胚胎中均无同工酶带表达或同工酶带强度降低。病组17、19日龄胚胎胫骨中同工酶表达显著然而，在高胆固醇组中清楚地检测到同工酶IV的双带以及组分V表达的3.5.基因组DNA片段化在母体糖尿病或高胆固醇血症胎儿的软骨和骨细胞中，梯形化程度（总DNA片段化）的基因组表达增加。在糖尿病母亲的骨骼细胞中，基因组DNA片段化的最高发生率显著增加（图1）。 10 B）。此外，在应用彗星试验（单细胞凝胶电泳）后，糖尿病或高胆固醇血症母亲的胎儿的单链核苷酸/每个骨骼细胞都被拉伸，尾长和DNA增加。图5e母体高胆固醇血症15日龄胚胎胫骨的透射电镜照片。A和B矿化钙沉积在骨细胞周围并被巨噬细胞包围C和D.软骨细胞之间的巨噬细胞胞质内可见丰富的线粒体和胶原纤维束。E和F的肥大的软骨细胞，细胞质中富含线粒体和胶原纤维。G和H。退化的内皮衬里细胞内的异常血管缩略语：CF：胶原纤维; DEC：变性内皮细胞; M：线粒体; Ma：巨噬细胞; MCS：矿化钙盐; N：细胞核; Os：成骨细胞; V：血管。8埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）1e12图6e糖尿病和高胆固醇血症母亲的15、17和19天胎儿的茜素红S制备物后肢的侧视照片。A，A1&，A2。对照组15，17&，19日龄，B，B1&，B2。15、17例&19日龄胎儿母体糖尿病。C，C1&C2。15、17&例19 d胎仔母体高胆固醇血症。注意实验组中骨化&的股骨胫腓骨的复位。图 8 e母体糖尿病或高胆固醇血症的15、17和19 d龄胎儿骨骼的钙含量。胎仔数量/组（n¼ 10）。* 表示P显著P<0.05学生t检验。浓度，与正常模式结构相比，表现出细胞死亡（图11）。 11）。4.讨论骨骼完整性的维持涉及破骨细胞诱导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间的动态生物平衡。在整个软骨内发育期间，肢体的骨化都在进行[26]。根据PolancoPonce et al.[27]，发现大鼠的母体糖尿病以与人类非常相似的方式改变胎儿发育观察结果是第一次揭示，无论是糖尿病或高胆固醇血症的母亲在13日龄产前发育的大鼠胎儿矿物质钙盐和软骨-骨形成均出现质的减少。在超微结构上，成软骨细胞和成骨细胞的分化明显延迟，图7e糖尿病和高胆固醇血症母亲的15、17和19天胎儿的茜素红S制备的股骨、胫骨和腓骨的骨化长度胎仔数量/组（n¼ 10）。*.表示PP0.05学生t检验时显著<9埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）第12卷图9e母体患有糖尿病或高胆固醇血症的15、-17和19日龄胎儿胫骨的碱性（A）和酸性（B）同工酶电泳显示，高胆固醇血症胎儿的强度增加，糖尿病胎儿的流速和活动强度降低骨膜鞘内的骨祖细胞，预测原始骨样骨形成。观察到的细胞学结果得到了证实，即患糖尿病或高胆固醇血症母亲的15、17和19天胎仔的四肢骨骨化长度显著减少，骨骼中矿化钙盐减少目前的研究结果支持Eidem等人的工作[28]和El-Sayyad等人[29]，他们研究了糖尿病或高胆固醇血症对孕妇及其后代的影响。我们的研究结果表明，成骨减少是由于胚胎骨组织钙含量减少所致.骨化缺陷可归因于Ca2供应或骨成熟本身的破坏[30]，或胎盘运输能力降低[31]。胎儿本身的骨化过程是有缺陷的，如骨钙素水平降低所示[32]。骨生长[33，34]以及骨髓成骨祖细胞[35]的迟缓是糖尿病的主要后果。此外，上述作者提到，糖尿病导致去卵巢糖尿病大鼠椎骨中硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素水平显著降低硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素都是软骨和骨形成的主要来源[36]。高葡萄糖浓度破坏氧化剂/抗氧化剂平衡可导致大量细胞损伤、凋亡事件增加和胚胎发育缺陷[37，38]。Viccica等人[39]报告说，胆固醇由肝脏合成并作为循环脂蛋白分泌，在成骨细胞分化中起作用。此外，骨生长缺陷可能归因于高胆固醇血症诱导的非酒精性脂肪性肝炎的发病机制[7]，如Nakano等人所述[40]. 肝脏是胆钙化醇（维生素D3）转化为25-羟基维生素D3以及25-羟基维生素D2的主要靶点[41]，其调节血流中钙和磷酸盐的浓度并促进骨重塑[42]。肝损伤可能通过减少维生素D的合成而破坏骨从我们的研究结果，糖尿病或高胆固醇血症表现出的乳酸脱氢酶同工酶III在15日龄胚胎表达缺失。然而，在高胆固醇血症组中可清楚地检测到同工酶IV的双带以及组分V表达强度的增加。这些同工酶的改变反映了其代谢活性的改变，并可能参与了骨细胞的损伤。乳酸脱氢酶（LDH）已被广泛用作体外和体内细胞死亡的标志物[43]。它在骨细胞中更活跃[44]。在5日龄大鼠下颌骨的骨细胞、成骨细胞和破骨细胞中均检测到除谷氨酸脱氢酶外的其他酶。骨细胞具有功能齐全的柠檬酸循环、戊糖循环以及代谢脂肪酸和碳水化合物的能力[45]。实验性糖尿病与氧化和糖酵解酶（包括乳酸脱氢酶）的改变有关[46]。骨碱性和酸性磷酸酶同工酶也有明显改变。碱性磷酸酶的同工酶组分III在19日龄的胎儿中表现出扩散速率增加和缺失。酸性磷酸酶同工酶显示其强度显着降低和增加扩散速率。骨碱性磷酸酶是监测骨形成变化的有用参数[47]。在大鼠胫骨骨内膜再吸收表面的Howship陷窝中，在破骨细胞和细胞外相邻骨细胞中发现了酸性和碱性磷酸酶活性的差异[48]。此外，喂养高胆固醇水平的饮食显示胎儿组织对其的利用减少，损害生长，从而增加发育缺陷的发生率，包括骨骼的形态和延迟骨化。高胆固醇血症母亲的胎儿后肢骨化长度估计值胎儿生长缺陷可能与心肌损伤和血管中动脉粥样硬化的发展有关，动脉粥样硬化减少了营养物质和氧气向组织的运输，以及高胆固醇血症的细胞毒性[6]。糖尿病[49]或高胆固醇血症[50]与维生素D合成的破坏之间存在密切关系，通过降低血清中25-羟基胆钙化醇的浓度来破坏维生素D合成，从而在体内损害骨细胞分化。此外，在高胆固醇血症或糖尿病母亲的胎儿骨组织中检测到DNA片段增加慢性糖尿病是活性氧物质形成的原因之一[51]，其中细胞对活性氧物质的反应导致10埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）1e12图 10 e A. 13、15、17和19天龄母体糖尿病或高胆固醇血症胎儿胫骨乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱显示，高胆固醇血症胎儿胫骨乳酸脱氢酶同工酶电泳强度增加，糖尿病胎儿胫骨乳酸脱氢酶同工酶电泳B.糖尿病或高胆固醇血症母亲胎儿中表达DNA片段的DNA梯状化程度。缩略语：C：对照; D：糖尿病; H：高胆固醇血症。图11e 13、15、17和19日龄胎儿后肢的彗星试验。A、A1、A2、A3为对照。B、B1、B2、B3为母体糖尿病胎儿。C、C1、C2、C3是母体高胆固醇血症的胎儿。糖尿病或高胆固醇血症母亲的胎儿表现出DNA损伤的骨细胞拉伸（*）。11埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）第12卷严重的代谢功能障碍、膜脂质过氧化、氧化蛋白损伤、细胞质和细胞核信号转导改变以及DNA损伤[52]。Takasu等人[53]指出，DNA片段化可能是由超氧化物或羟基自由基积累引起的。此外，我们的研究结果表明，糖尿病或高胆固醇血症母亲的15 d龄胚胎胫骨软骨膜和骨膜鞘发育过程中血管形成的缺陷可能会减少骨骼元素的营养和氧气需求，降低其分化和矿化。众所周知，糖尿病和高胆固醇血症患者发生外周血管疾病的风险增加。内皮功能障碍、血管平滑肌细胞功能障碍、炎症和高凝状态是外周血管疾病的关键因素[6，54]。这些并发症可能导致骨分化过程中的缺血，从而阻碍细胞的生长和发育。最后，我们得出结论，母体糖尿病和高胆固醇血症在胎儿发育过程中具有选择性的显著影响另一方面，母体糖尿病和高胆固醇血症增加了骨骼和血管中的细胞死亡率，这是由于氧化应激增加和细胞损伤的乳酸脱氢酶标志物与DNA损伤一致。[7] El-SayyadHIH，Al-Haggar MMS，El-Ghawet HA，BakrIHM. 母体糖尿病和高胆固醇血症对白化Wistar大鼠胎肝的影响。营养2014;30：326E 36.[8] Krakauer JC，McKenna MJ，Buderer NF，RaoDS，Whitehouse FW，Parfitt AM.糖尿病的骨丢失和骨转换。糖尿病1995;44：775e 82.[9] Horcajada-Molteni MN，Chanteranne B，Lebecque P，Davicco MJ，Coxam V，Young A，et al. Amylin andbonemetabolism in streptozotocin-induced diabetic rats. JBoneMin Res 2001;16：958e 65.[10] LuH，Kraut D，Gerstenfeld LC，Graves DT. 糖尿病通过影响调控成骨细胞分化的转录因子的表达来干扰骨形成。内分泌学2003;144：346e 52.[11] He H，Liu R，Desta T，Leone C，Gerstenfeld LC，Graves DT. 糖尿病导致破骨细胞生成减少，骨形成减少，细菌刺激的骨丢失中成骨细胞凋亡增加。内分泌学2004;145：447e 52.[12] Kayal RA，Tsatsas D，Bauer MA，Allen B，Al-SebaeiMO，Kakar S，et al.糖尿病骨折愈合期间骨形成减少与破骨细胞活性增加相关的软骨过早吸收有关。JBoneMin Res 2007;22：560e 8.[13] WonHY，Park JB，Park EY，Riew KD. 高血糖对糖尿病大鼠脊索细胞凋亡及椎间盘退变的影响。 J NeurosurgSpine 2009;11：741e 8.[14] Jepsen KJ.老化的皮质：开裂还是不开裂。《国际骨质疏松症》2003年;14（5）：S57e62。[15] Fuller K，Murphy C，Kirstein B，Fox SW，Chambers TJ.TNF α通过独立于RANKL的直接作用和与RANKL的强烈协同作用有效激活破骨细胞。内分泌学2002;143：1108e 18.[16] Funaba M，Murata T，Murata E，Abe M，Takahashi M，ToriiK.相互竞争的利益作者声明他们没有利益冲突。资金没有资金来源可供申报。雷弗伦 CES[1] Majima T，Shimatsu A，Komatsu Y，Satoh N，NinomiyaK，et al. Increased bone turnover in patientswithhypercholesterolemia. EndocrJ 2008;5（1）：143e51。[2] Isidro ML，Ruano B.糖尿病中的骨骼疾病。CurrDiabetesRev 2010;6（3）：144e 55.[3] 奥布莱恩T1，阮TT，齐默尔曼BR.高血压和糖尿病。Mayo Clin Proc1998;73（10）：969e 76.[4] Hwang SM，KimJS，LeeYJ， YoonJJ， Lee SM，KangDG，et al. 夏枯草抗2型糖尿病db/ db小鼠动脉粥样硬化作用的研究。美国中国医学杂志2012;40：937e 51。[5] PrasadK，McNair ED，Qureshi AM，Casper-Bell G. 维生素E减缓心脏、肝脏和肾脏中高胆固醇血症诱导的氧化应激的进展。Mol Cell Biochem2012;368：181e 7.[6] El-Sayyad HI，Al-Haggar MS，El-Ghawet HA，BakrIH. 糖尿病和高胆固醇血症母亲的Wistar大鼠胎儿的心肌病和血管生成缺陷。营养2012;28：33E 43.自发性高胆固醇血症大鼠软骨和骨形成增加。 生命科学1997;61：645e 52.[17] PovoskiSP，McCullough PJ，Zhou W，Bell Jr RH. 使用链脲佐菌素的储存平衡溶液诱导叙利亚金黄仓鼠糖尿病。实验动物科学1993;43：310e 4.[18] Enkhmaa B，Shiwaku K，Anuurad E，Nogi A，Kitajima K，Yamasaki M，et al.使用国家胆固醇教育计划专家小组关于成人高血胆固醇检测、评估和治疗的第三份报告（ATP III）和日本人和蒙古人修改的ATP III定义的代谢综合征患病率。临床化学学报2005;352：105e 13.[19] 杨伟杰，王伟杰，王伟杰. 原子吸收光谱法测定人髂嵴骨中微量元素和钙。临床学报2000;293（1e 2）：187e 92。[20] Lehnert T，Berlet HH.脱氧胆酸钠对大鼠组织乳酸脱氢酶的选择性失活。 BiochemJ 1979;177：813e8.[21] Shaw CR，Prasad R.淀粉凝胶电泳酶的食谱汇编。生物化学遗传学1970;4：297e 320.[22] 孙德布拉德L，Wallin-Nilsson M，Brohult J.血清碱性磷酸酶同工酶的琼脂凝胶电泳表征。临床化学学报1973;45（3）：219e 23.[23] 作者声明：A.猴牙髓碱性和酸性磷酸酶同工酶的电泳分离。《牙科学报》1978;36（6）：371e 5.[24] Duke RC，Sellins CB.免疫调节的细胞基础。In：Kaplan JG，Green DR，Bleackley RC，editors.第19届国际白细胞培养会议。New York：ARLiss; 1989. p. 311e4.[25] SasakiYF，Saga A，Akasaka M，Yoshida K，NishidateE，Su YQ，etal. 邻苯基苯酚、联苯、12埃及生物多样性和生物多样性科学杂志2（2015）1e12通过碱性单细胞凝胶电泳分析在多个小鼠器官中检测到噻苯咪唑。Mutat Res1997;395：189e 98.[26] 希尼角骨重建瞬时：对骨量变化临床研究解释的影响。JBone Min Res 1994;9：1515e 23.[27] PolancoPonce AC，Revilla Monsalve MC，PalominoGaribay MA，Islas Andrade S.母体糖尿病对人类和大鼠胎儿发育的影响。Ginecol Obstet Mex2005;73：544e 52.[28] Eidem I，Stene LC，Henriksen T，Hanssen KF，VangenS，Vollset SE，et al. 1型糖尿病女性新生儿的先天性异常：挪威全国人群研究，1999e 2004。妇产科学报2010;89：1403e 11。[29] El-Sayyad HI，Abou-El-Naga AM，Gadallah AA，BakrIH. 大蒜对孕鼠及其子代高胆固醇血症的保护作用。国际临床实验医学杂志2010;3：152e 63。[30] Garland HO，Forshaw AG，Sibley CP.糖尿病孕鼠膳食补充必需脂肪酸、尿钙排泄及生殖性能。JEndocrinol1997;153：357e 63.[31] HusainSM，Birdsey TJ，Glazier JD，Mughal MZ，Garland HO，Sibley CP.糖尿病对大鼠胎盘钙、镁及钙结合蛋白9K mRNA表达的影响儿科研究1994;35：376e 81.[32] 放大图片作者：J.脐带骨钙素在正常妊娠和妊娠合并胎儿生长迟缓或糖尿病。新生儿生物学1995;68：377e 83.[33] Funk JR，Hale JE，Carmines D，Gooch HL，Hurwitz SR. 正常和糖尿病大鼠骨折早期愈合的生物力学评价。J OrthopRes 2000;18：126e 32.[34] Dost A，Rohrer T，Fussenegger J，Vogel C，SchenkB，Wabitsch M，et al. 1788例1型糖尿病儿童和青少年的骨成熟。儿科内分泌代谢杂志2010;23：891e 8.[35] Tolosa MJ，Chuguransky SR，Sedlinsky C，SchurmanL，McCarthy AD，Molinuevo MS，et al.胰岛素缺乏型糖尿病诱导的骨微结构改变与骨髓祖细胞的成骨潜力降低相关：二甲双胍的预防作用。第86章：你是我的女人[36] Gopalakrishnan V，Arunakaran J，AruldhasMM，斯里尼瓦桑湾链脲佐菌素诱导的糖尿病对卵巢完整和卵巢切除成年大鼠椎骨中某些骨转换标志物的影响。Biochem CellBiol 2006;84（5）：728e 36.[37] [10]张文辉，张文辉. 活性氧在糖尿病诱发的Cohen糖尿病大鼠胚胎异常中的作用。国际实验糖尿病研究杂志2002;3：247e 55.[38] Eriksson JG，Yliharsila H，Forsen T，Osmond C，BarkerDJ. 运动可以防止出生时体型较小的个体发生葡萄糖耐受不良。Prev Med2004;39：164e 7.[39] 杨伟，王伟，王伟. 胆固醇生物合成途径在成骨细胞分化中的作用。JEndocrinol Invest 2007;30：8e 12.[40] 作者：Nakano A，Kanda T，Abe H.实验性肝硬化大鼠骨改变及矿物质代谢紊乱。胃肠病学和肝病学杂志1996;11（12）：1143e 54.[41] Hollis BW.维生素D营养和激素状态的评估：测量什么和如何做。CalcifTissue Int 1996;58（1）：4e 5。[42] 奈尔湾维生素D缺乏症与肝脏疾病胃肠病学和肝病学2010;6（8）：491e3。[43] [10]李晓，李晓.乳酸脱氢酶活性作为体外细胞数量定量的快速和灵敏的测试。Clin Mater1994;16（4）：189e 94.[44] 黄SYP，邓斯坦CR，埃文斯RA，希尔斯E。骨活力的测定：人骨新鲜钙化和脱钙切片中骨细胞乳酸脱氢酶活性的组织化学方法。病理学1982;14（4）：430e 42.[45] Fullmer HM.大鼠骨发育中的脱氢酶。组织化学和细胞化学杂志1964;12（3）：210e 4.[46] 杨文，李文. 链脲佐菌素诱导的糖尿病对骨骼肌代谢标志物和单羧酸转运蛋白1至单羧酸转运蛋白4转运蛋白的影响。 代谢2002;51：807e 13.[47] [11]杨文，李文.纵向骨生长的内分泌调节。《儿科学报》，1993年;（补编）391）：33e 40.[48] Wergedal JE，Baylink DJ.大鼠胫骨干未矿化切片中酸性和碱性磷酸酶活性的分布。J Histochem Cytochem 1969;17（12）：799e 806.[49] TsurA，Feldman BS，Feldhammer I，Hoshen MB，Leibowitz G，Balicer RD.血清25-羟基胆钙化醇浓度降低与进展为空腹血糖受损和糖尿病的风险增加相关。糖尿病护理2013;36（5）：1361e 7.[50] Gupta GK，Agrawal T，DelCore MG，Mohiuddin SM，Agrawal DK.维生素D缺乏诱导高胆固醇血症猪的心脏肥大和心外膜脂肪组织炎症。Exp Mol Pathol2012;93（1）：82e 90.[51] Lodovici M，Giovannelli L，Pitozzi V，Bigagli E，BardiniG，Rotella CM.血糖控制良好和较差的2型糖尿病患者的DNA氧化损伤和血浆抗氧化能力Mutat