犬新孢子虫SAG1蛋白免疫原性表位的计算机模拟研究

医学信息学解锁27（2021）100785阐明了生物化学特征和潜在的免疫原性犬新孢子虫SAG1抗原表位的计算机模拟研究Morteza Shamsa，Sasan Khazaei b，Naser Nazaric，Hamidreza Majidiani c， *，Bahareh Kordid，**a伊朗伊拉姆医学院人畜共患疾病研究中心b伊朗德黑兰Tarbiat Modares大学医学院寄生虫学系c伊朗克尔曼沙阿医科大学医学院寄生虫学和真菌学系d伊朗Neyshabur Neyshabur医科大学基础医学系A R T I C L EI N FO保留字：N.犬SAG1生物信息学免疫原性表位A B S T R A C T接种疫苗是适当预防犬新孢子虫感染的唯一可行方法。进行本计算机模拟研究以评价其理化性质并确定其免疫原性表位。N.犬SAG1蛋白作为可能的疫苗候选物。基于网络的工具被用来预测物理化学性质，抗原性，过敏性，溶解性，翻译后修饰（PTM）位点，跨膜结构域和信号肽，二级和三级结构，以及固有的无序区域，然后识别和筛选潜在的线性和构象的B细胞表位和那些与小鼠主要组织相容性复合物（MHC）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）结合的肽。该蛋白在试管中稳定，含有319个残基，分子量为33.07 kDa，脂肪指数为76.68（耐热性）和0.031（疏水性）的GRAVY评分。该序列有42个PTM位点和一个位于N端的信号肽。二级结构主要由无规卷曲组成，其次是股和螺旋。改进模型的Ramachandran图显示，在有利区域、额外允许区域、宽松允许区域和不允许区域中的残基分别为71.7%、24.9%、3.0%和0.4%。此外，预测了各种潜在的B细胞（线性和构象），CTL和MHC结合表位，N.犬SAG1. 本计算机模拟研究的结果是针对新孢子虫病的疫苗接种策略的前提。1. 介绍犬新孢子虫（N. caninum）是作为新孢子虫病病原体的细胞内顶复门寄生虫[1]，其严重影响家畜物种，特别是奶牛，导致繁殖失败[2]。关于寄生虫的生命周期，狗（ Canis familiaris ）[3]，野狗（Canis dingo）[4]，郊狼（Canis latrans）[5]和灰狼（Canis lupus）[6]是终宿主，牛科动物包括牛和水牛是中间宿主[7]。受感染的犬科动物通过对犬科动物和食草动物都具有传染性的卵囊脱落污染环境[8]。流产的偶发、地方性和/或流行性情景是N.奶牛的犬感染，以及间接损失，如替换淘汰的动物和兽医护理的额外费用[9]。值得注意的是，大多数来自血清反应阳性奶牛的小牛出生时看起来很健康，没有临床表现，但它们实际上是无症状的携带者，可能能够随后感染其后代[10，11]。几个风险因素对牛感染很重要，包括牛的年龄[12]、农场管理和饲养密度[13]以及与牛饲料接触的犬科动物数量[14]。一方面缺乏有效、安全的药物，另一方面长期治疗会在食用动物中留下药物残留，这使得血清反应阳性牛的治疗在经济上存在问题[15，16]。因此，接种疫苗似乎更有经济意义，以防止感染[17]。几个问题可以在一个理想的免疫后得到解决，N.犬：（i）大大减少最终犬科动物宿主排出的卵囊;（ii）消除怀孕母牛体内的速殖子复制，以减低母婴传播的机会;及（iii）抑制食用动物体内的组织囊形成，以避免经由食肉传播 [18]. 这一目标 是可以实现 通过采用 几种疫苗* 通讯作者。 伊朗伊拉姆医科大学人畜共患疾病研究中心** 通讯作者。电子邮件地址：Hamidreza. gmail.com（H. Majidiani），Baharehkordi673@gmail.com（B.Kordi）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100785接收日期：2021年8月16日;接收日期：2021年11月2日;接受日期：2021年11月2日2021年11月3日网上发售2352-9148/© 2021由Elsevier Ltd.发布这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuM. Shams等人医学信息学解锁27（2021）1007852在不同阶段表达的候选物在粘膜和全身水平有效刺激细胞和抗体依赖性免疫组分[19]。到目前为止，已经在牛和小鼠模型中应用了许多疫苗接种平台来对抗感染，使用减毒菌株或天然毒性较低的分离株，显示出一些优点（有希望的疗效）和缺点（安全性问题，生产成本）[20]。亚单位蛋白或DNA疫苗代表了几个好处，例如除了更高的稳定性和保质期外，生产，加工和储存成本降低[21]。因此，他们正在进行广泛的研究，以寻求一种可靠的疫苗，N.使用许多众所周知的分子靶标，包括表面抗原（SAG）、微线体（MIC）和棒状体（ROP）蛋白、致密颗粒（GRA）组分以及寄生虫空泡膜（PVM）中的靶标，对犬进行了免疫细胞化学研究[22]。N.犬SAG1（NcSAG1）是速殖子的糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接蛋白，其功能可能与刚地弓形虫（TgSAG1）中的对应物相似[23]。以前的研究表明，TgSAG1或p30是一种高度免疫原性的分子，在三种主要的寄生虫株中具有保守序列，参与信号转导、物质转运和更重要的宿主细胞粘附。因此，SAG 1非常优选用于疫苗接种或诊断目的[24为了深入研究NcSAG1蛋白的生物化学特征，更好地识别NcSAG1蛋白的抗原结构和免疫原性表位，为合理设计抗N. 犬的2. 方法2.1. NcSAG1的蛋白质序列检索通过UniProt知识库（UniProtKB）[ 28 ]检索NcSAG1的氨基酸序列，可在https：//www. uniprot.org/，登录号为Q9UB 12。2.2. 抗原性、致敏性、溶解性和理化性质使用两种网络工具进行抗原性预测：VaxiJen v2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/）和ANTIGENpro（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）。可免费访问的服务器VaxiJen v2.0强调蛋白质的物理化学性质，并通过自动交叉协方差（ACC）方法将序列转换为统一向量[29]。ANTIGENpro使用分析的微阵列数据，而不依赖于病原体和比对，来预测抗原性[30]。此外，使用AllergenFP v1.0（https://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/）、Aller-TOPv2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP）和AlgPred（http://crdd.osdd.net/raghava/algpred/）网络服务器预测所检查蛋白的变应原性。在 AllergenFP v1.0 [31]中，使用基于免疫原的指纹平台来区分抗原与过敏原，而AllerTOP v2.0[32]采用了几种机器学习方法。AlgPred服务器提供了几种预测方法，如IgE表位定位、MEME（用于基序激发的多个Em）/MAST（基序对齐和搜索工具）过敏原基序、过敏原代表性肽（ARP）的Blast搜索和混合方法[33]。在这里，我们使用了两种最初的方法（IgE和MEME/MAST）来使蛋白质成为非过敏原。还使用Protein-Sol网络服务器预测蛋白质溶解度，具有0.45阈值得分作为实验数据集的总体平均值（https://protein-sol.manchester.ac.uk/ ） [34] 。 此 外， 使 用EX PASyProtParam 服 务 器 （ https://web.expasy.org/protparam/ ） 预 测 了NcSAG1的几个物理化学特征，包括分子量（MW）、带负电荷和带正电荷的残基数量、脂肪族和不稳定性指数、等电点（pI）、半衰期和亲水性总平均值（GRAVY）[35]。2.3. 翻译后修饰（PTM）位点利用NetPhos 3.1（www.example.com）预测了NcSAG1蛋白的几个PTM 位 点 ， 包 括 丝 氨 酸 、 苏 氨 酸 和 酪 氨 酸 磷 酸 化 位 点https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? NetPhos-3.1 ） ， CSS-Palm的棕榈酰化或酰化位点（http://csspalm.biocuckoo. org/）以及通过NetNGlyc的N-连接和O-连接糖基化位点1.0（ https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? NetNGlyc-1.0 ） 和NetOGlyc4.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0）Web服务器。“所有Asn残基“选项用于NetN-Glyc 1.0预测，而默认参数应用于NetOGlyc4.0服务器。2.4. 信号肽和跨膜结构域预测对 于 跨 膜 结 构 域 分 析 ， 采 用 TMHMM 2.0 服 务 器 ， 可 在https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0。在下文中，使用三个网络服务器进行信号肽预测，包括Signal-3L 3.0（http ： //www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Signal-3L/）、 TargetP-2.0（ https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TargetP-2.0 ） [36]和PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）上提供。2.5. 二级结构和内在无序预测用 NetSurfP-2.0 （ https://services.healthtech.dtu.dk/service.php ？NetSurfP-2.0）Web服务器。该服务器预测表面可接近性、二级结构、无序区域以及phi和psi角[37]。2.6. 三维（3D）模型的预测、细化和验证采 用迭 代 Treading ASSEmbly Refinement （ I-TASSER ） 模 式对NcSAG 1 蛋 白 进 行 微 调 的 自 动 同 源 性 建 模 ， 可 在https://zhanglab.dcmb.med.umich.edu/I-TASSER/ 上 获 得 。 在 下 文中，通过DeepRefiner服务器（http://watson.cse.eng.auburn.edu/DeepRefiner/）上提供。细化过程使用“残差神经网络（ResNet）“作为深度学习模型和使用非累积约束的“冒险“细化模式来执行。Rosetta Energy、GOAP、OPSUS-PSP、DFIRE、MolProbity和RWPlus的较高预测全局质量分数和较低值呈现高质量模型。最后，使用SAVES 6.0服务器（saves.mbi.ucla.edu/）的ERRAT（质量因子）和PROSIDE（Ramachandran图）工具对初始模型和改进模型的质量进行了比较评估[38]。2.7. 连续和构象B细胞表位利用多步骤方法进行NcSAGl中 为此目的，在BCPREDS服务器（www.example.com）中应用具有80%特异性http://ailab.ist.psu。edu/bcpred/predict.html），它使用后续的内核（SSK）和支持向量机（SVM）技术[39]。随后，使用两个不同的网络服务器，包括ABCpred（ https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_method.html ）[40]和SVMTriP（http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/prediction.php）[41] Web服务器。 然后分别使用 VaxiJenv2.0、AllerTOP v2.0和PepCalc网络服务器在抗原性、变应原性和水溶性方面筛选共享的连续B细胞表位。值得注意的是，线性B细胞表位也由Bcepred服务器基于不同的物理化学参数如疏水性、柔性、可及性、转角 、 暴 露 表 面 、 极 性 预 测 。和抗 原倾 向（http://crdd.osdd.net/raghava/bcepM. Shams等人医学信息学解锁27（2021）1007853+[42] 。 此 外 ， 使 用 免 疫 表 位 数 据 库 （ IEDB ） 网 络 服 务 器（http://tools.iedb.org/ellipro/）的ElliPro工具预测构象B细胞表位[43]。2.8. 小鼠主要组织相容性抗原结合表位所有表位预测均使用MHC-I（http://tools.iedb. org/mhci/）和MHC-II（http://tools.immuneepitope.org/mhcii）结合IEDB服务器的表位预测工具[44]。关于MHC-I结合表位，使用8种小鼠等位基因（H2-Db、H2-Dd、H2-Kb、H2-Kd、H2-Kk、H2-Ld、H-2-Qa 1和H-2-Qa 2 ） ， 随 后 通 过 VaxiJenv2.0 、 AllerTOP v2.0 和 ToX inPred（https://webs.iiitd.edu.in在抗原性、变应原性和ToX性/raghava/到Xinpred/index.html）服务器。给定MHC-II结合表位，采用3种小鼠等位基因（H2-IAb、H2-IAd、H2-IEd）进行表位预测，然后使用VaxiJenv2.0、AllerTOPv2.0、IFN表位（ https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ifnepitope/application.php ） 和IL-4-pred （ https://webs.iiitd.edu.in/raghavaope/application.php ）筛选抗抗原性、变应原性、IFN-γ/il4pred/design.php）web服务器。2.9. 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位的预测与筛选使用CTL pred网络服务器（www.example.com ml）预测NcSAG1蛋白的前10个CTL表位https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ctlpred/help.ht[45]，然后使用VaxiJenv2.0、AllerTOP v2.0和肽2（www.example.com ml）筛选抗原性、变应原性和疏水性https://www.peptide2.com/N_peptide_hydrophobicity_hydrophilicity 。php）服务器。3. 结果3.1. NcSAG1的抗原性、致敏性、溶解性和理化特性基于对的评分获得从VaxiJen（0.6278）ANTIGENpro（0.938481）在线工具，NcSAG1表现出良好的抗原能力。此外，它是一种不含IgE表位和MEME/MAST基序的非过敏原分子，分别基于AllergenFP、AllerTOP和AlgPred服务器。 高溶解度（超过0.45）也是由Protein-Sol服务器预测的，溶解度评分为0.620（图11）。 ①的人）。该蛋白具有319个残基，MW为33.07 kDa，理论pI为7.89.总共有31个带正电荷的残基（Arg Lys）和29个带负电荷的残基存在于序列中。哺乳动物网织红细胞（体外）、酵母（体内）和E. 大肠杆菌（体内）分别为30小时，> 20小时和> 10小时。NcSAG1是一个稳定的蛋白质（不稳定指数：32.72），高度耐热（脂肪指数：76.68）和相对疏水（GRAVY评分：0.031）。3.2. NcSAG1蛋白序列根据NetPhos 3.1服务器预测，该序列中有38个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点23个，酪氨酸磷酸化位点13个，苏氨酸磷酸化位点2个。此外，存在2个N-糖基化位点和2个棕榈酰化区域，而没有O-糖基化位点的预测。3.3. 跨膜结构域和信号肽预测TMHMM服务器预测蛋白质序列中没有跨膜结构域，而信号肽的存在被所有三个使用的网络服务器（Signal-3L 3.0、TargetP-2.0和PSIPRED）预测。TargetP服务器的信号肽的可能性为0.8903，而Signal-3L 3.0预测该信号肽的可靠性评分为1.0，表明其位置在1至30个残基之间。3.4. 二级结构和内在无序预测与NetSurfP-2.0服务器输出相关，序列的相当一部分属于无规卷曲，其次是股和螺旋。 此外，还表明，相对表面可及性（阈值25%）方面，大部分序列都已暴露（图2）。此外，本发明还提供了一种方法，图1.一、 使用Protein-Sol网络服务器计算溶解度，显示Nc SA G 1 的 溶 解 度 高于平均值（0.620）。M. Shams等人医学信息学解锁27（2021）1007854±±--图二、 使用NetSurfP-2.0服务器的 二级 结 构 预测 表明随机卷曲占优势，其次是股和螺旋。1-40和287 - 319之间的残基可能是固有无序的。3.5. 3D结构建模、建模和验证I-tasser 服务器 是 使用 为 同源性 建模 关于NcSAG1蛋白质， 屈服 五 预测 模型 与 C分数 范围从1.21到2.79选择具有较高C-分数（1.21）、估计TM-分数为0.56 ±0.15和估计RMSD为9.1 ± 4.6 μ m的模型1用于进一步的细化过程（图1）。 3 A）。在将原始3D模型提交给DeepRefiner后，服务器提供了五个具有不同资格参数的加密模型。其中，型号图三. 使用Ramachandran分析的NcSAG1蛋白同源性建模和细化验证。(A)I-TASSER Web服务器提供的NcSAG 1最终三级模型，如彩虹丝带所示。(B)使用PROTEINS对粗模型的Ramachandran图分析表明，61.5%、31.7%、5.3%和1.5%的残基分别位于最有利的、额外允许的、慷慨允许的和不允许的区域。(C)经调整后，分别有71.7%、24.9%、3.0%和0.4%分配给各区域。M. Shams等人医学信息学解锁27（2021）1007855-选择了四个，预测的全球质量得分为0.150，Rosetta能量得分为-149.340，MolProbity得分为2.273，GOAP得分为-35559.300，OPSUS-PSP评分为-3738.088，DFIRE评分为-473.396表2特异性B细胞线性抗原表位。犬SAG1基于不同的物理化学参数预测的Bcepred网络服务器。RWPlus评分为57973.279.然后，使用两个网络服务器确认了精炼过程的质量。基于ERRAT工具，理化参数b细胞表位总品质因子由粗模型的74.92提高到精模型的82.45。值得注意的是，Ramachandran图分析原油模型结果表明，在163个（61.5%）、84个（31.7%）、14个（5.3%）和4个亲水性VTCDNEEKSSVA，KCPDNSTA，CPAESGGQTCTGKE，VSSDASKSC、SYGANET、SEGGSSTM、CGTDGKP、SGTTVKDCKAKP、QGKPDTKDGAK、KSVSSPE、EAERASA、分别位于最受欢迎、额外允许、慷慨允许和不允许的地区。而对照组分别 为 190 例 （ 71.7% ） 、 66 例 （ 24.9% ） 、 8 例 （ 3.0% ） 和 1 例（0.4%）。灵活性KSSAENVGGTMASEK、VTCDNEEKS、CPAESGG、ASFPTTSKS、GCVSSDAS、PITLSEGGSS、LVCGTDG、DWWQGKPDTKDG、GAFPPKE、TLGCKSVSS、AGIKSSA相应地（图3B C）。&3.6. 连续和构象B细胞表位预测使用BCPREDS、ABCpred和SVMTriP网络服务器，使用多步方法进行线性B细胞表位预测，然后无障碍通道FPRAVRRA，TMASEKSP，TCDNEEKSSVA，KCPDNST，LGYPTNRTV、QTCTGKEIPLES、SFPTTSKSFD、SSDASKS、TDGKPVPPDPKQV、VKDCKAKPFTD、DWWQGKPDTKDGAKLTIKKGAFPPKEEKFTL、KSVSSPE、QVEAERA将KCPDNSTAE-定态曲面DNEEKSS，VPPDPKQV，VKDCKAKP，QGKPDTKDG，根据抗原性、变应原性和水溶性进行筛选。因此，三个表位具有最高的抗原潜力，具有良好的水溶性并且没有变应原性，包括：“GKEI-PLESLL” 、 “GVDIKTGVKLTIP” 和 “KDCKAKPFTDVFPK” （ 表1 ） 。 还有，基于物理-化学特性预测的连续B细胞表位列于表2中。四个构象B细胞表位是极性抗原性倾向FPPKEEKFTLFPRAVRRAV、TCDNEEKSSVA、KEIPLES、VKDCKAKP、GKPDTKDGAK、AFPPKEEKFTL、VQVEAERASA EKSPLLVNQVVTCDN、VLLSPKL、HITLKCP、IPLESLLP、SFDVGCVSSD、KSCMVTVVPP、SSLVNGV、STMTLVCGTD、PDPKQVCSGTTV、TLGCKSVSSPEVYCTVQVE、VGRVSLF、VTIGLVGSI预测NcSAG1蛋白具有80个残基（评分：0.711）、72个残基（评分：0.679）、23个残基（评分：0.61）和5个残基（评分：0.521）（图 4）.3.7. 小鼠MHC结合表位和CTL表位我们的结果证明了NcSAG 1蛋白中几个潜在的MHC-I结合表位，具有高抗原性评分，并且没有过敏性和致XIC性状（表3）。此外，在蛋白质中预测了多个高抗原性、非过敏原性MHC-II结合表位，其中大多数是IFN-γ诱导剂，而只有两个表位是IL-4诱导剂（表4）。关于CTL表位，仅“VTIGLVGSI“肽被证明是高度抗原性的（1.2482）和非过敏性的，具有良好的疏水性（55.66%）（表5）。4. 讨论对顶复门N.大约20年前[ 46 ]发现了牛和狗中的犬毒素，这引发了目标物种牛[47]以及小鼠模型[48]的首次免疫研究。到目前为止，已经发表了许多针对N.犬，主要在小型实验室动物中，并使用各种表达系统，包括病毒（牛痘病毒）[49]，细菌（流产布鲁氏菌）[50]平台。最近，蚕已被用来生产N。在杆状病毒表达平台中使用Mory核型多角体病毒的犬重组蛋白（NcSAG1和NCRS2），表1最后筛选出N. 犬SAG1.多抗原展示病毒样颗粒（VLP）[51]。在这个意义上，Xu et al.（2019）表达的Rous肉瘤VLP显示出双重N. 犬抗原（NcSAG 1和NCRS 2）在蚕和接种沙鼠使用初免-加强方案。在接种VLP-SAG 1/SRS 2的动物和仅接受PBS、VLP或VLP-SRS 2的动物中观察到动物体重和脑寄生虫负荷的统计学显著差异[52]。此前，Nishikawa et al.Bengoa-Luoni等人（2001）证明，与NcSAG 1（均由牛痘病毒表达）相比，NcSRS 2在接种BALB/c小鼠的免疫诱导和保护中具有更高的功效[49]，而Bengoa-Luoni等人（2019）表明，接种NcSAG 1和拟南芥热休克蛋白81.2可显著增加BALB/c小鼠的总IgG、特异性IgG 1和IgG 2a水平，提高子代存活率，降低垂直传播率[53]。这些发现强调了NcSAG1在针对N.犬，而在计算机分析和潜在的免疫原性表位的鉴定是缺乏的。本研究针对速殖子主要表面粘附抗原NcSAG1，深入探索和筛选其免疫原性抗原表位，并通过综合生物信息学手段 接近。 的 注意， 一个 理想 疫苗接种 方法 对N.应指导犬在牛中进行试验;然而，只有少数实验室能够在实验条件下维持牛。因此，小鼠模型更优选用于此类实验[54]。计算机模拟分析表明，NcSAG 1是一种潜在的抗原性（VaxiJen评分：0.6278; ANTIGENpro评分：0.938481）、非过敏性和可溶性蛋白，与其对应物TgSAG 1相似。在这个意义上，Majidiani等人显示TgSAG 1的抗原性相对较高（VaxiJen评分：0.7874; ANTIGENpro评分：0.962041）[55]。基于共有B细胞表位VaxiJen抗原性评分AllerTOP变应原性预测PepCalc水溶性预测使用EX PASy ProtParam webNcSAG1具有319个氨基酸残基，分子量为33.07 kDa，含有31个带正电荷的残基和29个带负电荷的残基。EASFPTTSKSFD-0.2256是良好TLKCPDNS 0.9256是好DNSTAVPAA 0.9018是良好GKEIPLESLL* 1.1686不好VQVEAERASA 0.9122是好GVDIKTGVKLTIP* 0.5407不合格QTCTGKEIPLE 0.5852是良好KDCKAKPFTDVFPK* 1.6998不好RASSLVNGVAM 0.9662无不良（*）表示有效合格和免疫原性。不稳定指数超过40使蛋白质不稳定，而NcSAG1显示为稳定蛋白质，不稳定指数为32.72。此外，它被证明具有相对较高的脂肪族指数（76.68），突出了蛋白质作为一个良好的耐热分子。最后，计算出NcSAG1的GRAVY评分为0.031，表明其具有相对疏水性。所有估计的物理化学因子均接近TgSAG1的预测值[55]。NcSAG1的PTM位点大多属于磷酸化位点M. Shams等人医学信息学解锁27（2021）1007856-见图4。使用IEDB服务器的ElliPro工具预测构象B细胞表位。每个表位的长度和评分如下：（1）80个残基，评分：0.711，（2）72个残基，评分：0.679，（3）23个残基，评分：0.61，和（4）5个残基，评分：0.521。TgSAG1的磷酸化位点主要是丝氨酸磷酸化（23个位点），而苏氨酸磷酸化在TgSAG1中更为普遍（24个位点）[55]。虽然预测NcSAG1有2个酰化位点，但TgSAG1蛋白中没有这样的位点[55]。两个N-糖基化位点，也预测NcSAG 1。信号肽的存在表明，合成的蛋白质可能被指定为几种途径，包括排泄分泌、毒力因子或表面蛋白[56]。因此，基于来自三个网络服务器的结果，在NcSAG1的前30个氨基酸中检测到潜在的信号肽。NcSAG1的二级结构具有相似的组分，主要由无规卷曲、链和α螺旋组成。值得注意的是，它表明，1-40和287-319残基可能是内在无序的。无序蛋白质是高度丰富的，主要致力于调节功能和分子信号传导。因此，这些区域可能是抗体的免疫学靶点，因此它们在疫苗接种研究中似乎很重要[57]。先前，已经表明“在NcSAG1（先前为Ncp29）中存在12个保守的半胱氨酸残基，并且还描述了SAG蛋白的串联重复基序，这表明相似的二级和三级构象对于它们的功能非常重要“[ 23 ]。使用I-TASSER服务器和最佳拟合模型（C-评分：1.21）被选中进行进一步的改进和验证。 基于ERRAT质量因子和Ramachandran图分析表明，与粗模型相比，改进后的模型得到了增强。在N.犬感染，抗体依赖性和细胞免疫都被召回。关于B细胞应答在保护中的可能作用知之甚少[54]。抗原特异性抗体而非多克隆抗体抑制速殖子侵入宿主细胞似乎是合理的[58]。在前2周，脾脏B细胞会显著增加，随后会消退[59]。还发现B细胞耗尽的小鼠在感染后29天死于感染[60]第一章。针对速殖子增殖和缓殖子再活化的免疫的其他突出特征是CTL（T CD8+）应答以及T CD4+和T CD8+细胞产生IFN-γ[61，62]。然而，并非给定蛋白质的整个序列显示对这些免疫细胞的亲和力。在此基础上，采用了多个Web服务器本研究旨在准确预测和筛选NcSAG1的潜在免疫原性表位。使用三个网络服务器预测线性B细胞表位，并就抗原性、过敏性和水溶性进行筛选。在 这 个 意 义 上 ， 只 有 三 个 B 细 胞 表 位 “GKEIPLESLL” ，“GVDIKTGVKLTIP“和“KDCKAKPFTDVFPK“是合格此外，在NcSAG 1蛋白中确定了含有80个残基（评分：0.711）、72个残基（评分：0.679）、23个残基（评分：0.61）和5个残基（评分：0.521）的四种构象B细胞表位，其在抗原-抗体相互作用中具有特别显著性。由于抗原呈递对于T细胞引发非常重要，因此使用IEDB服务器预测那些与小鼠MHC分子具有特异性亲和力的表位。在该蛋白中预测了几个抗原性指数高、无致敏性、无毒性的MHC-I结合表位（12-mer），其中“KDCKAKPFTDVF“抗原性指数最高，为1.8180。在MHC-II结合表位（15-mer）中，“VSVGVFAAPALVAFF“显示最高的抗原性（0.9157），具有潜在的IFN- γ诱导。 此外，只有一个“ VT I G L V GS I “ CT L 预 测 表 位 使 用CT Lp r e d 网 络 服 务 器 具 有 足 够 的 抗 原 性 （ 1. 24 8 2 ） ， 没 有 过敏原 。值得注意的是，新孢子虫感染可通过CD4+ Th 1应答和IFN-γ与平衡的Th2反应一起生产。 然而，无论A潜在的疫苗方案应该引起Th1或Th2 CD4+应答仍然是有争议的，因为在牛和小鼠作为靶种属[54，63]。需要更多的标准化疫苗试验来提高我们对不同T细胞亚群在抗N. 犬感染5. 结论犬新孢子虫感染通过造成繁殖失败和地方性/流行性流产对养牛业构成全球性威胁。因此，越来越需要认识到在前所未有的免疫平台的背景下使用的新的疫苗载体。生物信息学是一门跨学科的科学分支，它帮助我们描述蛋白质的物理化学特征，发现高度免疫显性的表位区域，并设计出更合理的疫苗设计。目前的计算机模拟研究强调了M. Shams等人表3医学信息学解锁27（2021）1007857使用IEDB网络服务器预测NcSAG 1的小鼠MHC-I结合表位，并随后根据抗原性、变应原性和毒性进行筛选小鼠MHC-I等位基因位置T细胞肽百分位数秩VaxiJen抗原性评分AllerTOP过敏性预测H2-Db 163444115H2-Dd 3529-13342H2-Kb 35421510ToXinPredtoXicityprediction Non-ToX in非ToX在非ToX 在 非ToX 在 非ToX 在 非TOX 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非TOx 在 非TO X 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非ToH2-Kd11-22 ASFPTTSKSFDV 8.9 -0.2939是15331-1613x in x in xin x inXINXin xH2-Kk 314336115H2-Ld 11574239H-2-Qa 1 423551339H-2-Qa 2 3120439-39非ToX在非ToX 在 非ToX 在 非ToX 在 非TOX 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非ToX 在 非TO x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非To x 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO X 在 非TO表4小鼠MHC-II结合表位的预测以及随后的抗原性、变应原性和IFN-γ/IL-4诱导方面的筛选小鼠MHC-II等位基因位置T细胞肽百分位秩VaxiJen抗原性评分AllerTOP变应原性预测M. Shams等人表3医学信息学解锁27（2021）1007858IFN-γ诱导IL-4诱导结果评分结果评分H2-IAb 9-23 AVSVGVFAAPALVAF 0.41 0.7783无阳性0.2477阴性-0.4710-8-11-H2-吲哚乙酸H2-IED7-21 RRAVSVGVFAAPALV 0.91 0.8113无阳性0.3860阴性-1.401-3-4-2-5-1-2-44-43-14-28 VPAALGYPTNRTVCP 25.57 0.3750无阴性-0.0372阴性0.17重要的生物物理特性和新的B细胞，MHC结合和CTL表位的NcSAG1蛋白使用一套免疫信息学服务器。这些表位可进一步用于开发使用其他抗原的表位的多表位疫苗构建体，并且其保护效力需要在靶动物中评估资金这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体的竞合利益作者声明，他们没有已知的竞争性金融M. Shams等人医学信息学解锁27（2021）1007859表5N.犬SAG1的抗原性、过敏性和疏水性筛选。排序起始位置肽序列评分（ANN/SVM）VaxiJen抗原性评分AllerTOP变应原性预测疏水性（%）1 299 GRVSLFAVT 1.00/-0.23718777-0.2549是55.662 306 VTIGLVGSI* 1.00/-0.23718777 1.2482否55.663 301 VSLI FAVTIG 0.99/-0.23718777-0.1040否66.674 233 FSADWWQGK 0.99/-0.23718777 1.5301是44.445 283 EAERASAGI 0.99/-0.23718777 0.8956是44.446 43 TCDNEEKSS 0.99/-0.23718777 1.3723是0.07 66 KCPDNSTAV 0.98/-0.23718777 0.7517是33.338 144 CVSSDASKS 0.98/-0.23718777 1.2543是22.229 168 NGVAMCSYG 0.98/-0.23718777 1.4363是33.3310 67 CPDNSTAVP 0.97/-0.23718777 0.4468是44.44可能会影响本文所报告工作确认作者感谢伊朗伊拉姆医科大学人畜共患疾病研究中心的工作人员在撰写本稿过程中给予的热情帮助。引用[1] 埃利斯J，卢顿K，巴弗斯托克公关，布林德利PJ，尼莫KA，约翰逊AM。犬新孢子虫的发生。分子和生物化学寄生虫学1994;64（2）：303-11.[2] [10]杨文辉，李文辉.新孢子虫犬，一个潜在的原因，繁殖失败的奶牛从希腊北部。 兽医寄生虫学：区域研究和报告2020;19：100365。[3] McAllisterMM，Dubey JP，Lindsay DS，Jolley WR，Wills RA，McGuire AM.犬是新孢子虫的最终宿主。IntJ Parasitol 1998;28：1473-8.[4] KingJS，SJuplapetaJ，JenkinsDJ，Al-Qassab SE，Ellis JT，WindsorPA. 澳大利亚野狗是新孢子虫的最终宿主。国际寄生虫学杂志2010;40（8）：945-50。[5] Gondim LF，McAllister MM，Pitt WC，Zemlicka DE.狼（Canis latrans）是新孢子虫的最终宿主。国际寄生虫学杂志2004;34（2）：159-61.[6] DubeyJ，Jenkins M，Rajendran C，Miska K，Ferreira L