以红Jania rubens和Sargassum dentifolium为载体的银纳米粒子的生物医学应用

--埃及基础与应用科学杂志4（2017）249完整文章以红Jania rubens和Sargassum dentifoliummacroalgae为载体的银纳米粒子的功效;表征和生物医学应用Hani Sabera，Eman A.Alwaleeda，K.A.Ebnalwaledb，c，Asmaa Sayeda，Wesam Salema，a埃及Qena 83523，南谷大学科学系植物学系b电子纳米器件实验室，物理系，科学学院，南谷大学，Qena 83523，埃及c埃及纳米技术中心（EGNC），开罗大学谢赫扎耶德校区，12588吉萨，埃及阿提奇莱因福奥文章历史记录：2017年8月5日收到2017年10月7日收到修订版2017年10月17日接受2017年10月31日在线提供关键词：抗生物被膜病原菌齿叶马尾藻银纳米粒A B S T R A C T以红Jania rubens和Sargassum dentifolium水提液为还原剂合成了银纳米粒子。所制备的银纳米粒子在440 nm和420 nm处具有两个等离子体吸收带，对于Ag-NPs/J. rubens和Ag-NPs/ S，直接带隙为2.25 eV和2.38 eV。齿叶。从FTIR结果来看，还原主要是通过存在于J.rubens和S.齿叶，分别。TEM图像显示，大多数颗粒的形状是球形的，没有检测到聚集体或碎片S. dentifolium/NPs比J. Rubens/NPs（470和240×103 NPs/ml）和平均粒径分别为113和155 nm。每个纳米颗粒之间的高排斥力和吸引力被证实与 J 的 平均zeta电位为24.7和28.2 mV。Rubens/NP和S. dentifolium/NP。另一方面，104通常，两种NP均显示出可重复的有效抗菌活性，两种NP对测试病原体的MIC和/或MBC值之间没有显著差异。关于生物膜形成的结果暗示在所测试的各种浓度的Ag-NP下在粘附阶段开始时的显著抑制因此，银纳米颗粒可以是一种有效的抗菌剂，即使在长期使用后也不会引起微生物耐药性。©2017曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇开放获取的文章，CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍纳米生物技术是一个不断发展的领域，已与人类生活的所有领域联系在一起[1已经说明了几种物理化学方法用于合成金属纳米颗粒[6由于这些方法大多数价格低廉、无毒、环境友好且生产工艺简单，因此需要多种绿色方法来合成纳米粒子从天然来源如植物[13，14]和藻类[15-17]合成绿色纳米颗粒的新方法由于它们容易获得、天然存在、无毒，大型藻类在银纳米颗粒的生物合成中具有几种潜力，例如生态友好、容易的生产技术和低成本[18]。El-Rafie等人[1]通过使用海洋大型藻类还原硝酸银溶液，证明了一种快速、廉价、绿色且易于操作的银纳米颗粒生物合成方法*通讯作者。电子邮件地址：wesam. svu.edu.eg（W。Salem）。提取物几种大型藻类已用于Ag-NP的生物合成，特别是不同的马尾藻属（Sargassum spp.）[19，20]和Jania Rubens [1]。相信银纳米颗粒生物合成在环境和生态上是安全的，以及增强其抗菌性能似乎是非常明智的[14]。对于金属纳米颗粒，银纳米颗粒（Ag-NP）作为理想的抗微生物剂具有很高的效率[21]。由于其抗菌性能，银纳米颗粒广泛用于医疗保健领域和工业应用[22另一方面，环境中的微生物活动是饮用水和食品腐败的主要来源，它往往是导致严重疾病的原因，包括食源性疾病。在这些致病菌中，产气肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是对传统抗生素具有高度多重耐药性的生物膜形成生物体[26针对细菌生物膜的抗微生物剂已经使用绿色银纳米颗粒进行了大量的工作[13]。虽然，在检测生物膜形成https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2017.10.0062314- 808 X/©2017曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbas250H. Saber等人 /埃及基础与应用科学杂 志 4（2017）249-255≤生物合成的纳米银颗粒对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很强的抗菌活性。这使得银金属成为医学和生物技术领域中不同目的的理想替代品，并且可能导致针对致病微生物的重要结果，并降低由这些细菌菌株引起的疾病的患病率[13]。Ag-NP的杀伤机制是由于自由基的形成，自由基促进膜损伤分子的诱导[32]。Ag-NP的抗微生物活性主要是用人类病原菌研究的，主要是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌[33]、肠杆菌性大肠杆菌（ETEC）和霍乱弧菌[13]。因此，进行本研究以了解通过（完全表征的）生物合成的银纳米颗粒（Ag-NP）对一些人类病原菌的抗生物膜活性，所述银纳米颗粒使用两种大型藻类的水提取物，红贾尼亚藻（Jania rubens）和齿叶马尾藻（Sargas-sum dentifolium），它们分别是存在于埃及红海海岸的最常见的红色和棕色海藻类型。2. 材料和方法2.1. 大型藻类的选择、收集和提取物的制备在2015年5月期间，通过手工采摘从埃及赫尔格达的红海中收集了红贾尼亚和齿叶马尾藻将健康藻类样品从附生植物中清除，去除外来物质和坏死物。将样品用海水然后用无菌蒸馏水彻底洗涤，风干，切成小块，然后在组织研磨机（IKAA 10，德国）中研磨直至达到细粉末形状。将干燥的海藻粉末（Ig）与IOOml蒸馏水混合并加热至100°C，然后通过Rotilabo® Tyb 601 P滤纸过滤2.2. 银纳米粒子的绿色合成基本上如先前所述合成Ag-NP[19]。将50 ml体积的1 mM AgNO3溶液与50 ml两种藻类提取物的水提取物在45 ℃下在连续搅拌下反应。溶液在1小时内改变颜色（棕黄色至浅紫色），表明形成了Ag-NP。为了使反应完全，将所得溶液再搅拌Ag-NPs/J. rubens和/或S.通过在6000 rpm/min离心10分钟后收集沉淀，将形成的齿叶与残留海藻分离。将粒料再次悬浮于双蒸水中，并通过加入0.1 ml磷酸盐缓冲液至生理pH的总体积。2.3. 纳米银纳米粒子银离子的植物还原通过用计算机化的双光束UV-2300分光光度计以5 nm步长记录在室温下，在石英池中，使用硝酸银（ImM）作为空白，在200-1100 nm波长范围内的法向入射下进行测量。通过测量几个样品来检查数据的再现性。在70 kV 下使用配备有数字“Kodak Megaplus ® 1.6i照相机”的“JEOL-2010，Japan”透射电子显微镜（TEM）和图像分析和处理软件（AMT，USA）观察银纳米颗粒的尺寸和形状如Salem等人先前所述，通过将一滴每种溶液置于碳涂覆的铜网格上并在室温下干燥来制备样品[14]第10段。下-在Magna-FTIR 560（USA）仪器上记录大型藻类粉末和绿色合成的Ag-NP的红色光谱，分辨率为2cm-1，范围为4000 - 400 cm-1 ，在KBr颗粒中，使用漫反射模式，由NicoletOmnic软件按照制造商的指示操作使用Zetasizer Nano系列紧凑型散射光谱仪（MalvernInstruments Ltd.; Malvern 6.32，UK）。2.4. 细菌菌株、培养条件和补充剂人类致病菌包括革兰氏阴性鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、产气肠杆菌（ATCC 13048）、铜绿假单胞菌（ATCC 278223）、大肠杆菌（ATCC 25922）和革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，ATCC 43300）。将细菌菌株保持在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）斜面上，并在37 ℃下孵育24每种微生物重复三次，建立了将接种物涂布在TSA平板上（10- 7 CFU）。2.5. 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）将各菌株的过夜（ON）培养物在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中生长至595 nm处的光密度（OD595）为1. 以1：1000in（TSB）进行传代培养。将100μl细菌培养物的样品置于96孔板（F底，Sterilin）中，并将10μl细菌培养物的样品置于96孔板（F底，Sterilin）中。加入适当的Ag-NP系列稀释液（NP/ml）。在37 °C的潮湿室中孵育24小时后，使用“SPECTRONIC ® GENESYS TM 2 PC”分光光度计，Spectronic Instruments，USA测量光密度（OD 595）。为了确认细菌生长抑制并确定代谢活性的缺乏，将40 mL对碘硝基四唑紫（INT，0.2 mg/ml，Sigma-AldrichINT测定中的MIC定义为如前所述防止颜色变化的NP的最低浓度[36]。生长定义为OD595与阴性对照（仅TSA）相比至少增加2倍。接下来，进行MBC测试，确定杀菌效果在24小时孵育期间，起始接种物中CFU减少99.9%（3 log）。通过从过夜MIC板的每个孔中转移50 mL至无菌（TSA）新鲜板中来测定MBC。在37 °C下24小时后计数活菌落。该测定的检测限为101 CFU/mL。2.6. 静态生物膜测定静态生物膜在微量滴定板中通过结晶紫染色进行，基本上如Seper等人[37]先前发表的那样，进行了一些修改。简单地说，将相应的菌株在（TSA）平板上生长过夜，悬浮于（TSB）中，调节OD595为0.02 。 将 130μl 该 稀 释 液 置 于 96 孔 微 量 滴 定 板 （ U 形 底 ，Sterilin）中，在37 ℃下保持24小时。24小时后，加入10μl浓度约为105NPs/ml的Ag-NPs 胶体溶液。 加入10μl两种大型藻类水提取物作为对照。生物膜用0.1%溶 解 于 96% 乙 醇 中 的 结 晶 紫 ， 并 使 用 Infinite® F50 Robotic（Ostrich）酶标仪测量OD595以定量生物膜的量。2.7. 统计分析使用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验分析数据，然后进行事后Dunn多重比较。在P值为0.05时，差异被认为是显著的。对于所有统计分析，使用GraphPad Prism版本5。H. Saber等人 /埃及基础与应用科学杂 志 4（2017）249-255251-3. 结果和讨论3.1. 纳米颗粒的表征3.1.1. UV–Vis银纳米颗粒（Ag-NPs）根据建立的方案[19]使用来自Jania rubens和Sargassum dentifoliummacroalgae的干燥海藻粉末合成。导致两种不同来源的纳米颗粒Ag-NPs/J。rubens和/或S.齿叶在整个研究过程中，制备了几次NP，而产率或质量没有显著变化，表明NP的生产是可重现的。反应在60分钟内完成，这通过添加两种藻类的水提取物后硝酸银溶液的颜色变化来指示。相比之下，不含浸提液的硝酸银溶液（对照品）颜色无变化颜色的强度随着潜伏期的推移而稳步增加。最后，Ag-NPs/J. rubens和/或S. 石斛溶液分别呈现棕黄色至浅紫色。硝酸银的还原和表面等离子体共振的激发可能是颜色反应变化的 原 因 [38] 。 UV–Vis spectrometer is spectral techniques arewidely 紫外-可见光谱UV-Vis光谱中的波长扫描对于Ag-NP/J，k= 440。 鲁本斯（Fig. 1 A）。此外，Ag-NPs/S.窝，窝如先前公开的[19，41]，三叶草在约λk= 420 nm处显示出特征吸收峰。Ag-NP的光学吸收光谱明显地由表面等离子体主导，在向红端和/或蓝端的移位内取决于分子量。粒度、形态、聚集状态和涂层介电介质[42]。有趣的是，所制备的银纳米颗粒具有两个等离子体吸收带，一个在295 nm处对于两种提取物，第二个在440 nm和420 nm处对于由J. Rubens和S.齿叶提取物。等离子体激元吸收带是Ag纳米颗粒的特征带[42，43]，这证实我们获得了Ag纳米颗粒。Ag-NP提取物的表面等离子体吸收带出现在420 nm和440nm处，表明存在球形或大致球形的银纳米颗粒[44]。如图1B所示，Ag-NP的透射率随着波长的增加而降低，直到440 nm，在该波长之后，透射率增加，这些结果表明Ag-NP是透明的。从吸收光谱可以看出光学带隙的大小和性质，它对应于电子从价态到导电态的激发乐队.吸收系数（a）和入射光子能量（hm）之间的关系可以写为（ahm）1/n=A（h其中A是常数，Eg是材料的带隙，指数n取决于跃迁的类型。对于直接允许n = 1/2，间接允许跃迁n = 2，以及直接禁用，n = 3/2。图1C描绘了（ahm）2和光子能量之间的关系，以确定直接允许带隙。这些结果清楚地表明，直接带隙是2.25eV和2.38 eV。 Rubens和Ag-NPs/S. 齿叶分别3.1.2. FTIR研究FTIR光谱用于鉴定负责还原Ag+离子和封端大型藻类形成的Ag-NP的可能的功能性生物分子 图图2显示了J. rubens（图2A）和/或S.齿叶（图2B）水提取物及其生物合成的Ag-NP。在FTIR光谱中，J. Rubens提取物中，1635 cm-1处的信号对应于C@ N的不对称伸缩振动，2834和/或2920 cm-1处的谱带归因于与脂族基团[46]或CA OH相关的对称CH-脂族振动，其在Ag-NP合成这说明了在Ag-NP的还原过程中涉及C@ N或羟基此外，在3420 cm-1 处还检测到了OH伸缩峰。AgNO3还原后，3397 cm-1处的强度降低，表明OH基团参与了还原过程。这通过反应期间溶液PH的降低进一步证实。硫酸化多糖峰指出硫酸根基团参与银纳米颗粒的生物合成[19]。与此一致，Mahdavi等人[47]和Venkatpurwar和Pokharkar [48]指出，海藻S.Muticum和Porphyravietna-mensis合成NPs的能力较强。对于FTIR光谱，S. 在1426 cm-1处的峰指示C @ C图二、傅里叶变换红外光谱（FTIR）生物合成银纳米颗粒的光谱(A)Ag-NPs/Janiarubens（黑线）及其藻类提取物（红线）（B）Ag-NPs/Sargassum dentifolium（黑线）及其藻类提取物（红线）显示生物活性官能团。图1.一、生物合成银纳米颗粒（Ag-NPs）的光谱分析示出了（A）Ag-NP/红贾尼亚菌（绿线）和Ag-NP/齿叶马尾藻（棕色线）的(C)（ahm）2和光子能量之间的关系，以确定两种合成的Ag-NP的直接允许的带隙。252H. Saber等人 /埃及基础与应用科学杂 志 4（2017）249-255×--衍生自存在于S中的芳环的基团。石斛水提物在1634 cm-1处的另一个峰归因于（NH）C@ O基团的伸缩振动，该伸缩振动是蛋白质的特征，在Ag- NPs合成后发生位移并变得更短，证实了（NH）C@ O基团的成员在封端纳米颗粒合成中有贡献。因此，FTIR结果表明，通过使用绿色方法，成功合成了Ag-NP并用两种藻类提取物中存在的生物化合物包覆。3.1.3. TEM和粒度分布分析合成的纳米颗粒的TEM测量给出了由J. Rubens和S.齿叶提取物如图3所示，大多数颗粒是球形的。也可以注意到一些椭圆形和不规则的银纳米颗粒。通过Zetasizer Nano系列紧凑型散射光谱仪测定整个研究中测定所用制剂中NP的确切粒度分布和浓度（图3）。一般而言，S. denti-folium/NPs 制 剂 显 示 出 比 J.Rubens/NPs 。(470 和 240 × 10 ~3NPs/ml），平均粒径为113-155 nm。通过观察TEM图像中的纳米颗粒未检测到聚集体或碎片（图3），这表明纳米颗粒胶体溶液的纯度和均匀性。 控制所得纳米颗粒的尺寸和结构的变化可能与生物化合物如多糖、蛋白质、多酚和酚类化合物与金属原子之间的相互作用有关[49]。3.1.4. Zeta电位（ZP）图图3示出了生物合成的Ag-NP的ZP。Ag-NP/红茉莉（图3A）和Ag-NP/S的平均ZP为24.7和28.2mV。齿叶（Fig. （3）分别。从平均ZP值可以看出，生物合成的银纳米粒子是稳定的，被阴离子化合物包裹，并负责电化学反应。静态稳定这可以通过纳米颗粒之间的高排斥力和吸引力来实现[50]。纳米颗粒表面上的负电荷导致纳米颗粒之间的排斥，从而导致纳米颗粒在细胞培养介质中的稳定性[51]。3.2. 银纳米粒子对某些人类致病菌的效力以J.rubens和S.研究了齿叶提取物对人类最主要的细菌病原体的作用。对该目标的最小抑菌浓度（MIC）和/或最小杀菌浓度（MBC）测定进行统计学分析（图4）。对于MIC，评估了一种比色INT-甲瓒测定法，该测定法允许通过呼吸活性检测活菌[52，53]。有趣的是，两种NP针对测试的病原体的MIC和/或MBC值之间没有显著差异（图1B）。 4）。详细地，10 4 - 10 5 /ml的Ag-NP浓度足以杀死所有测试的革兰氏阴性和阳性细菌（图1B）。 4 A和B）。银纳米颗粒可通过各种机制引起生长抑制或细胞溶解[32，54]。银对细菌的致死作用也可以通过抑制酶的巯基反应来阐明[55，56]。此外，Steuber等人[57]提出了溶藻弧菌中Ag+作用的机制，涉及从全酶Na+-NQR直接置换FAD，导致酶活性丧失此外，银处理抑制DNA复制、核糖体分子和细胞外蛋白的表达，此外，它可能干扰微生物的呼吸链[56，58，59]。3.2.1. 大型藻类提取物和银纳米颗粒对生物膜形成具有相反的影响病原菌生物膜的形成一直是大量实验研究的重点.由于生物膜通常已知会促进对几种抗菌剂的耐药性，我们图三.生物合成的银纳米颗粒的TEM图像以及相应的尺寸分布和zeta电位。(A)Ag-NPs/红贾尼亚菌和（B）Ag-NPs/齿叶马尾藻。H. Saber等人 /埃及基础与应用科学杂 志 4（2017）249-255253见图4。Ag-NP的功效表示为MIC和MBC测定减少。Ag-NPs对某些病原菌的MIC90测定（A）Ag-NPs/Jania rubens(B)通过四唑还原测定（灰色）测量MIC的OD600 nm来确定Ag-NP/齿叶马尾藻，并通过菌落计数（白色）确认为MBC。显示的是来自至少八次独立测量的中值。误差条表示四分位数范围。分析了纳米银对人类致病菌如沙门氏菌的影响。鼠伤寒沙门氏菌E.产气假单胞菌（P.aeruginosa）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、大肠杆菌（E.大肠杆菌和革兰氏阳性耐甲氧西林S.金黄色。因此，我们允许五种测试的病原体形成静态生物膜24 h，然后Ag-添加了NP。J. Rubens和S.齿叶提取物分别作为阳性对照。最后，在24小时的额外孵育期后，通过结晶紫染色定量生物膜量（图5）。在五种测试的细菌菌株中，与对照相比，Ag-NPs的添加显著降低了生物膜量，但S.在Ag-NP/ S的情况下为金黄色葡萄球菌。齿叶有趣的是，两种Ag-NP与原始大型藻类提取物，除了铜绿假单胞菌（图5）。值得注意的是，与对照（原始生物膜）相比，两种大型藻类提取物显示所有五种测试病原体的生物膜形成没有变化，E.大肠杆菌和S.鼠伤寒沙门氏菌与J. 鲁本斯提取物。尽管两种纳米颗粒在INT测定和MBC的MIC中表现出稳健的抗细菌活性，但Ag-NPs/J. 与Ag-NP/ S相比，Rubens通常显示出对所有病原体略高的功效。dentifolium，只影响革兰氏阴性菌。培养24 h后，Ag-NPs显示试验菌株的生物膜粘附能力较弱，生物膜解体，而对照菌株的生物膜粘附能力较强，在96微孔板上形成了致密的生物膜。因此，Ag-NP在清除细菌生物膜的建立中具有积极的活性[60]。此外，用聚己内酰胺（聚合物）包被的稳定化的Ag-NP的蛋白质生物合成被证明是针对病原菌的良好的抗生物膜剂。[61]。先前采用相同的技术来测量对链球菌的生物膜抑制和粘附 化脓 [62]，葡萄球菌金黄色 [63，64]，和E. 杆菌[65]使用不同的细菌提取物。 所述包覆纳米粒子在表面上，表面活性剂和酶抑制了细菌生物膜的形成[66]。使用由Calotropisprocera合成的Ag-NP，针对霍乱弧菌和肠毒素大肠杆菌，也记录了相同的结果[13]。值得注意的是，细菌生物膜会导致慢性感染，因为它们对抗生素、化学品和吞噬作用的抗性增加[67]。因此，细菌生物膜基质内抗生素渗透的失败导致细菌生物膜对这些抗生素产生耐药性[68]。细菌生物膜的上述属性使它们与目前医学面临挑战的最危险的问题一起结果表明，生物膜的形成可能是抑制在粘附阶段的开始在不同浓度的银纳米粒子测试。与我们的结果一致，最近已经显示Ag-NP抑制和减少几种细菌物种的生物膜形成[69]。4. 结论银纳米颗粒提供了一种廉价的替代方法，以减少最常见的食源性病原体的感染剂量。 纳米颗粒的快速和现成的合成不需要专门训练的人员或昂贵的工具，并且很可能是可行的。图五.用Ag-NP处理的静态生物膜形成的改变。与大型藻类提取物相比，在用Ag-NPs/ Jania rubens（JNPs）和Ag-NPs/ Sargassum dentifolium（SNPs）接种后24小时后定量一些病原性细菌的生物膜形成能力; rubens（J）或S. 在静态条件下，通过结晶紫染色和随后测定OD 595来测定齿叶（S）。显示的是来自至少八次独立测量的中值误差条表示四分位数范围。254H. Saber等人 /埃及基础与应用科学杂 志 4（2017）249-255n在流行地区进行有趣的是，迄今为止，细菌长时间暴露于Ag-NPs会抑制耐药细菌的发展引用[1] El-Rafie HM ， El-Rafie MH ， Zaeli MK. 利 用 海 藻 多 糖 绿 色 合 成 纳 米 银CarbohydrPolym2013;96：403-10.doi：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2013.03.071网站。[2] Goudarzi M，Bazarganipour M，Salavati-Niasari M.新型双核配合物前驱体制备 的 Co3 O4 纳 米 粒 子 的 合 成 、 RSC Adv 2014;4 ： 46517-20 。 doi ：https://doi.org/10.1039/C4RA09653C。[3] Goudarzi M，Mir N，Mousavi-Kamazani M，Bagheri S，Salavati-Niasari M.以两种天然前驱物为原料以简易热分解法制备纳米银粒子之生物合成与表征。SciRep2016;6：32539.[4] [10]杨文辉，陈文辉，陈文辉. 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