基于液滴微流控技术的多级反蛋白石多孔支架的三维细胞共培养

工程7（2021）1778研究医学工程-文章基于液滴微流控技术的多级反蛋白石多孔支架仿生三维细胞共培养邵昌民a，b，c，刘玉晓d，迟俊杰d，叶芳夫b，c，e，赵元进a，b，d，赵a南京大学医学院附属鼓楼医院转化医学研究所风湿免疫科，南京210008b瓯江实验室（浙江省再生医学、视觉与脑健康实验室），温州325038c中国科学院大学温州研究所，中国d东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室，南京210096e中国科学院物理研究所北京凝聚态物理国家实验室，北京100190阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2020年3月9日修订2020年6月8日接受在线预订2021年关键词：微流控反蛋白石细胞培养液滴生物材料A B S T R A C T三维细胞培养具有更好地模拟天然组织特异性的优点，在药物开发、毒性测试和组织工程中发挥着重要作用。然而，现有的用于3D细胞培养的支架或微载体通常在尺寸上受到限制，并且在模拟活生物体的血管复合体方面表现出次优的性能。因此，我们提出了一种新的分层反蛋白石多孔支架，通过一个简单的微流控方法，促进三维细胞共培养技术。所设计的支架使用涉及乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的组合概念来构建。该工作表明，所得到的scaf-折叠确保在细胞培养期间提供足够的营养，从而实现大体积细胞培养。此外，通过在支架上连续种植不同的细胞，可以开发内皮细胞包裹的肝细胞的三维共培养系统，用于构建某些功能组织。还证明了将所提出的支架用于共培养系统有助于肝细胞维持特异性体内功能。这些层次化的反蛋白石支架为三维细胞培养甚至仿生组织的构建奠定了基础。©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍三维（3D）细胞培养是一种有效的技术，其在培养期间为细胞提供更接近其体内生活条件的微环境[1三维培养中的细胞可以通过紧密连接或间隙连接在细胞之间以及细胞与细胞外基质之间建立连接，形成三维结构，这与体内细胞生长相似[6因此，3D细胞培养既能保存体内细胞微环境的物质结构基础，又能体现细胞培养的直观性和条件可控性这些优点导致了3D细胞培养的快速发展及其在各个领域的广泛应用，如组织工程，生物制药加工，毒性测试等[10目前，3D细胞培养最大的局限性是，在前培养过程中，内部的细胞容易坏死*通讯作者。电子邮件地址：fye@iphy.ac.cn（F. Ye），yjzhao@seu.edu.cn（Y. Zhao）.由于过度的培养面积和营养供应不足，导致堆积的停止，而由于丰富的微血管和微循环，这种细胞的3D生长在体内是正常的。受此现象的启发，许多多孔材料或微通道已被构建用于3D细胞培养[17然而，大多数多孔材料通常尺寸太小，无法防止由于缺乏有效的营养运输通道而导致的细胞坏死[23此外，常规多孔材料不能有效地模拟活生物体中血管复合体的3D结构。因此，仍预期开发具有更复杂结构的新型多孔材料以实现3D细胞培养。在这项研究中，我们提出了一种新的分层反蛋白石多孔支架，其具有使用简单液滴微流体方法制备的细胞培养所需的特征，如图1所示。反蛋白石支架由于其可控的孔径和它们从模板继承的均匀孔而受到相当大的关注，模板由紧密堆积的单分散微球或液滴晶格组成[26https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.06.0312095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engC.邵，Y. Liu，J. Chi等人工程7（2021）17781779图1.一、（ a）制造分层反蛋白石多孔支架和（b）3D细胞共培养的示意图。GelMA：甲基丙烯酸明胶;PEO：聚（环氧乙烷）; HUVEC：人脐静脉内皮细胞; HepG 2：人肝癌。巧合的是，由于其优异的流动控制能力，微流体能够形成用于不同应用的高度单分散乳液，例如反蛋白石支架的微球或液滴晶格的模板[30基于其3D结构特征，反蛋白石支架已经被广泛应用于光学材料、生物传感器、细胞支架等[37然而，由于其简单的空隙填充结构和单一的组成的支架，目前的研究使用反蛋白石支架的三维血管化仍然很少。因此，通过涉及乳液液滴模板和惰性聚合物聚合的组合概念，我们在此构建了用于实现3D血管整合的分级反蛋白石支架在本文中，我们证明了所得到的支架在细胞培养过程中确保了充足的营养供应，从而实现了大体积的细胞培养。此外，通过在支架上连续种植不同的细胞，可以开发出内皮细胞包裹肝细胞的三维共培养这种共培养系统促进了更高水平的白蛋白和细胞色素P450（CYP 450）的分泌，这表明支架中的共培养系统有助于维持肝细胞的活性和功能。这些特性使得这里描述的分级逆蛋白石支架对于组织工程和其他生物学应用是理想的。2. 材料和方法2.1. 材料明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）是根据报道的方法在实验室自行合成的[40]。明胶（猪皮）、甲基丙烯酸酐、聚（环氧乙烷）（PEO;平 均 分 子 量 为 900 000 ） 、 光 引 发 剂 2- 羟 基 -2- 甲 基 苯 丙 酮（HMPP）、疏水试剂十八烷基三氯硅烷（OTS）、聚（乙二醇）-嵌段-聚（丙二醇）-嵌段-聚（乙二醇）（F108）和十二烷基硫酸钠（SDS）均购自美国Sigma-Aldrich从Milli-Q纯水机获得去离子水其他试剂为分析级。2.2. 分级反蛋白石支架的制备通过去除由微流体产生的液滴模板来制造分级反蛋白石支架。简单地说，通过将内管和外管组装在方形管中获得微流体装置。通过微电极拉 拔 器 （ P-97 ， Sutter ， USA ） 生 产 具 有 尖 端 的 内 管 （ 内 径 ：80μm），并用OTS处理以进行疏水处理。该微流控装置在组装后用环氧树脂AB胶加固和密封。内、外相分别为甲基硅油和GelMA/PEO溶液。典型流程内、外相流速分别为0.4和2 mL·h-1。通过混合GelMA(20%）和PEO（1.5%）水溶液以4：1的体积比混合。同时，还将SDS（2%，表面活性剂）、F108（2%，表面活性剂）和HMPP（1%，光引发剂）加入到外相溶液中然后通过微蠕动泵（HarvardPHD 2000，Harvard Apparatus，USA）将相应的液体引入装置中，并且甲基硅油在内管的孔口处被GelMA/PEO水溶液剪切成液滴在紫外光照射下，液滴自组装成六方密排结构，外层相聚合。通过用正己烷和乙醇超声去除油滴至少五次，最终产生分级反蛋白石GelMA/PEO支架的第一分级为了获得第二层次结构，将产生的GelMA/PEO scaf- 折 叠 物 浸 入磷 酸 盐 缓 冲 盐 水 （ PBS; Gibco ，USA）中超过48小时，以从光交联的GelMA水凝胶中除去PEO相。为了观察PEO在水凝胶中的渗出，通过将PEO分子与异硫氰酸荧光素（FITC）分子缀合来进行PEO浸出试验。简言之，将FITC（10mmol·L-1）和将1.5%PEO溶液透析一周，然后冻干。根据上述方法获得聚合的GelMA/PEO水凝胶，然后置于PBS中使用酶标仪（Synergy HT，BioTek，USA）测定从水凝胶释放的PEO的吸光度最后，当PEO从支架中渗出后，形成了多孔结构.C.邵，Y. Liu，J. Chi等人工程7（2021）17781780×××2.3. 细胞培养人肝癌（HepG 2）细胞（Cell Bank，China）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC; Tongpai Biologi cal Technology Co.，有限公司、中 国 ） 在 含 有 10% 胎 牛 血 清 （ Gibco ） 和 1% 青 霉 素 和 链 霉 素（Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; Gibco）中孵育在37°C下，在具有5%CO2的二氧化碳（CO2）培养箱（Hera-cell 150，Thermo，USA）中培养细胞。接下来，将GelMA/PEO scaf-folds浸入75%乙醇中，并在UV灭菌的情况下放置在洁净工作台中超过4小时。然后将支架用PBS洗涤三次并转移到六孔板（Corning，USA）中。将50 μ l浓度为6 × 105细胞/mL的HUVEC悬液然后缓慢加入2mL培养基。一毫升的cul-真 正 的 媒 体 每 天 都 在 更 新 。 通 过 用 5μmol/L 的 钙 黄 绿 素 -AM（Molecular Probes，USA）染色细胞来观察细胞生长。在细胞共培养实验中，先将HUVECs（6 × 105cells·mL-1）接种于支架上，然后将HepG 2细胞（5 × 105cells·mL-1）接种于支架上进行共培养。为了检查细胞在支架中的分布，分别用5lmol·L-1 的钙黄绿素-AM 和 5lmol·L-1 的 DiD （ Molecular Probes ） 对 HepG 2 细 胞 和HUVEC进行染色。细胞增殖率通过3-（4，5-二甲基硫代-唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）测定。 简单地说，将培养的支架置于24孔板中，并加入含有10%MTT的培养基。在孵育器中孵育4h后，小心吸出溶液;然后加入500μL二甲基亚砜以溶解孔中的晶体。使用酶标仪测定光密度（OD）值。通过大鼠白蛋白酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Abcam，UK）测量白蛋白含量。使用人CYP4503A4 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）检测CYP450活性。2.4. 表征通过显微镜（AE 2000，Motic，中国）和照相机（S-PRI F1，AOSTechnologies AG，瑞士）记录微流体液滴的产生。通过光学显微镜（Olympus BX 51，日本）和场发射扫描电子显微镜（SEM; S-300N，Hitachi，日本）表征所产生的支架的结构。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM; Olympus FV 10 i）拍摄细胞的荧光图像和3D重建图像。3. 结果和讨论在一个典型的实验中，由微流体产生的水包油（O/W）单乳液液滴被用作用于制造分级反蛋白石支架的模板，如图1B所示。1.一、选择GelMA和PEO的混合物作为分级反蛋白石支架的骨架材料。GelMA是一种生物相容性水凝胶，在3D细胞培养和组织工程领域有着广泛的应用[41类似地，由于其生物相容性、惰性和易于修饰，PEO通常在水凝胶支架的制备中用作致孔剂[44，45]。基于这些背景，我们在微流控装置中采用GelMA和PEO的混合物，然后去除PEO组分，制备出分级多孔结构的反蛋白石支架。在我们的实验中，通过在单个载玻片上同轴组装玻璃管来制造玻璃微流控装置。 内毛细管用于引入分散相（例如，甲基硅油），外毛细管用于引入连续相（例如，GelMA和PEO溶液的混合物），最外侧的方形毛细管用于记录液滴的在线生成过程。 如图2（a）所示，甲基硅油在内管出口处被GelMA/PEO溶液所产生的液滴尺寸和支架的相应孔径可以通过调节两相溶液的流速来控制发现液滴的直径明显地随着分散相的速率的增加而增加，而在连续相的速率和液滴直径之间发现相反的关系（图1）。 2（b））。如图如图2（c）和（d）所示，所产生的液滴具有均匀的尺寸、良好的球形度和高的单分散性，使它们成为反蛋白石支架的理想模板。在液滴组装成六边形密堆积排列并且随后聚合GelMA预凝胶溶液之后，形成第一分层结构（即，通过用正己烷和乙醇洗去油相，最终产生分级反蛋白石支架的均匀使用光学显微镜和SEM观察所得的GelMA/PEO支架，如图3所述。观察到GelMA/PEO支架具有均匀且互连的大孔结构（图3（a））。此外，相邻的孔通过多个均匀的窗口相互连接，这有利于长期的细胞培养，因为它可以增强营养物质或废物通过整个支架结构的运输（图1）。3（b））。在通过上述方法获得反蛋白石骨架折叠的第一层次结构之后，通过将所产生的GelMA/PEO支架浸入PBS中超过48小时以从固化的GelMA水凝胶中去除PEO来形成第二层次结构为了观察PEO在水凝胶中的渗出，通过将PEO分子与FITC分子缀合来进行PEO浸出试验发现PEO随时间逐渐渗出，并且吸光度的变化在48小时后趋于平缓（图1B）。附录A中的S1）。通过SEM和CLSM的3D重建观察所得的多孔微观结构。结果表明，PEO渗出后，形成了二次微孔结构（图1和图2）。3（c）和（d））。多孔网络结构能够将孔的相对表面之间的距离从几百微米减小到几十微米，以匹配拉伸的细胞的横向尺寸，这将确保大面积和长期的氧气和营养物质的充分输送。细胞培养为了模拟体内血管网络的结构，将所得支架用于培养HUVEC。首先，我们研究了材料的生物相容性，这是需要考虑的一个基本因素更具体地，分别将HUVEC与GelMA水凝胶和GelMA/PEO复合膜共培养1、3、5和7天，然后使用CLSM通过用钙黄绿素-AM染色来观察。如附录A中的图S2所示，我们发现HUVEC能够在GelMA水凝胶和GelMA/PEO复合膜中良好地生长和用MTT法进行了相应的定量实验，结果也一致这些发现表明我们的预支架材料具有理想的细胞生物相容性随后，为了证明支架在3D细胞培养中的性能，在第1、3、5、7和15天，通过CLSM定性观察衍生自上述两种类型材料的支架中的HUVEC增殖，并通过MTT测定定量评估（图4）。很明显，细胞在前三天在两种支架中增殖良好。然而，三天后，GelMA支架中的细胞增殖显著小于GelMA/PEO支架中的细胞增殖。这种现象可以归因于这样一个事实，即细胞中的C.邵，Y. Liu，J. Chi等人工程7（2021）17781781图二、 通过微流体技术生成的液滴模板。（a）在线生成具有不同内相流速的液滴的图像（比例尺：500μ m）。(b)液滴直径和流速之间的关系（n= 3）（F1：外相流速，黑色方块;F2：内相流速，红色三角形）。(c)自组装液滴模板（比例尺：200μ m）。（d）液滴的大小分布（变异系数为4.35%）。传统支架在长期使用过程中容易发生坏死，在体外培养中，由于缺乏氧气和营养物质的scaf-折叠，而我们的分层反蛋白石支架能够克服这一限制。此外，在两种支架上生长的细胞的形态也明显不同。如附录A中图S3所示，与在GelMA支架中生长的细胞相比，在GelMA/PEO支架中生长的细胞更容易粘附在支架壁上并呈现纺锤形形态。这些结果表明，与普通的无孔GelMA支架相比，GelMA/PEO支架有效地促进了细胞的生长、粘附、增殖和迁移，因为分级多孔的微结构更有利于细胞所需的氧气和营养物质的运输。基于GelMA/PEO多层支架在三维细胞培养中的优异性能，构建了一种新型仿生三维血管网络，对研究大面积细胞培养中复杂的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用具有重要意义。为此，将HUVEC均匀接种到GelMA/PEO支架中，并使用CLSM通过钙黄绿素-AM染色和SEM进行观察（附录A中的图5和图S4观察到细胞均匀地接种到支架的孔中。如图5所示，细胞均匀地分布在整个scaf表面区域。在接种后的第一天折叠，并主要拉伸到支架的骨架上。在培养时间的持续时间内，细胞占据了孔的大部分空隙空间并形成3D细胞网络。此外，细胞的活力使用CLSM在不同的Z平面中观察孔中心（附录A中的图S5）。结果表明，支架孔隙内生长的细胞在不同深度、不同部位均具有较高的存活率，这与传统支架中细胞大面积培养时，由于缺氧和缺乏营养，内部细胞容易坏死的情况不同。因此，改善支架的微观结构设计允许细胞均匀地分布在整个分级GelMA/PEO支架中，同时防止支架内的细胞坏死并促进为了进一步开发所设计的分级GelMA/PEO支架的功能，通过将不同的细胞依次接种到支架中，实现了内皮细胞包封的肝细胞的前所未有的3D多层共培养系统（图1）。 6）。更具体地，将HUVEC和HepG2细胞为了检查细胞在支架中的生长状态，HUVEC和HepG 2细胞分别用DiD细胞标记溶液（红色）和钙黄绿素-AM（绿色）染色通 过CLSM 获得在支架中共培养后的细胞的图像（图 1B ） 。 6（a））。结果C.邵，Y. Liu，J. Chi等人工程7（2021）17781782图3.第三章。 分级反蛋白石多孔支架的结构。（a）支架的第一级结构的光学显微镜照片（b）支架的第一层次结构的SEM图像（c）GelMA/PEO水凝胶的第二级结构的3D重建荧光图像（d）GelMA/PEO水凝胶的第二层次结构的SEM图像部分（a）-（d）中的比例尺见图4。（（e）在GelMA和GelMA/PEO支架中培养的HUVEC的增殖概况，如通过MTT测定所确定的（*p 0.001，n= 3）。表明接种到支架中的两种细胞类型在共培养期间均表现出良好的活性。细胞共培养系统的侧视图也表明两个细胞分层。然后在与HUVEC共培养后的肝细胞上检测肝相关酶的分泌水平，白蛋白和CYP 450是肝细胞培养中细胞生理学的关键参数。这些结果表明，肝细胞和HUVECs的共培养在GelMA/PEO支架中分泌的白蛋白和CYP 450水平高于在明胶/聚氧化乙烯支架中。常见的GelMA支架（图1A和1B）。6（b）和（c），附录A中的图S6）。具体而言，在GelMA/PEO支架中共培养的肝细胞的白蛋白分泌和CYP 450表达比在普通GelMA支架中共培养7天的肝细胞高约1.36倍和1.17倍。这些结果表明，GelMA/PEO支架中的共培养肝细胞能够在培养过程中保持酶活性，并且表现出比GelMA支架中的肝细胞更高的酶活性。所设计的GelMA/PEO支架具有良好的应用前景C.邵，Y. Liu，J. Chi等人工程7（2021）17781783图五、 在（a）第1天、（b）第3天和（c）第7天在GelMA/PEO支架中培养的HUVEC的CLSM图像：（i）荧光图像;（ii）明视野图像;和（iii）合并图像（比例尺：200 μ m）。图六、（ a）培养7天后，含有HUVEC（红色）和HepG 2细胞（绿色）的GelMA/PEO支架中的细胞共培养系统的CLSM图像：（i）HUVEC;(ii)HepG 2细胞;（iii）合并的图像;和（iv）侧视图（比例尺：100μ m）。（b）在GelMA和GelMA/PEO支架中与HUVEC共培养的HepG 2细胞的白蛋白分泌和（c）CYP 450表达（*p 0.05，**p 0.01，n= 3）。C.邵，Y. Liu，J. Chi等人工程7（2021）17781784在体外组织生成领域，这将有利于组织工程。4. 结论总之，我们提出了一种通过简单的微流控方法促进三维细胞培养的分层反蛋白石支架使用复合概念构建支架，该复合概念涉及乳液液滴模板和惰性聚合物聚合。结果表明，所设计的支架确保了细胞增殖过程中营养物质的充足供应，从而实现了大体积细胞培养。此外，通过在支架上连续接种不同的细胞，建立了内皮细胞包裹肝细胞的三维共培养体系，这种共培养系统促进了更高水平的白蛋白和CYP450的分泌，这表明支架中的共培养系统可以帮助维持肝细胞活性和功能。我们期望这些设计的支架将为体外构建类器官提供新的思路，并最终有利于组织工程。致谢本工作得到了国家重点研究发展计划（2020YFA0908200）、国家自然科学基金（52073060、32101159、61927805）、深圳市基础研究计划（JCYJ 20190813152616459）和中国科学院大学温州研究所（WIUCAS）启动基金（WIUCASQD 2019007）的支持。遵守道德操守准则邵昌民、刘宇晓、迟俊杰、叶方富和赵元进声明，他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.06.031上找到。引用[1] SutherlandRM. 肿 瘤 微 区 中 细 胞 与 环 境 的 相 互 作 用 ： 多 细 胞 球 体 模 型 。Science1988;240（4849）：177-84.[2] Kelm JM，Timmins NE，Brown CJ，Fussenegger M，Nielsen LK.用于产生适用于多种细胞类型的同质多细胞肿瘤球状体的 方 法 。生 物 技术与生 物 工程2003;83（2）：173-80.[3] O'Brien LE，Zegers MMP，Mostov KE.建立上皮结构：从三维培养模型的见解。Nat Rev Mol CellBiol 2002;3（7）：531-7.[4] 杨文，李文.三维细胞培养系统及其在药物开发和细胞生物传感器中的应用。药物开发技术测定2014;12（4）：207-18。[5] 王军，邹敏，孙玲，程英，尚玲，付芳，等.微流控技术制备细胞培养用的佛珠状微载体。Sci China Mater 2017;60（9）：857-65.[6] Schmeichel KL，Bissell MJ.组织特异性信号传导和器官功能三维建模。 J Cell Sci2003;116（12）：2377-88.[7] Liu W ， Zhong Z ， Hu N ， Zhou Y ， Maggio L ， Miri AK ， et al. Coaxialextrusionbioprintingof3Dmicrofibrillateconstructswithcell-favorablegelatinmethacryloyl microenvironments.生物制药2018;10（2）：024102。[8] 刘毅，黄强，王军，傅芳，任军，赵毅。用于三维细胞培养和药物递送的卵源蛋白微载体的微流体生成。Sci Bull2017;62（18）：1283-90。[9] 阿伯特生物学 Nature 2003;424（6951）：870-2.[10] WangN，Peng Y，Zheng W，Tang L，Cheng S，Yang J，et al. 一种快速构建具有复杂细胞排列的血管样结构的策略。Macromol Biosci 2018;18（5）：1700408。[11] YingGL，Jiang N，Maharjan S，Yin YX，Chai RR，Cao X，et al. 水性两相乳液生物墨水使能多孔水凝胶的3D生物打印。Adv Mater2018;30（50）：1805460.[12] Qi S ， Zhang P ， Ma M ， Yao M ， Wu J ， Mäkilä E ， et al. Cellularinternalization-inducedaggregationofporoussiliconnanoparticlesforultrasoundimaging and protein-mediated protection of stem cells.小2019;15（1）：1804332。[13] Zhang H ， Liu D ， Wang L ， Liu Z ， Wu R ， Janoniene A ， et al.Microfluidicencapsulation of pickly zinc-doped copper oxide nanoparticles withVD1142modifiedspermine acetalateddextran for efficient cancer therapy.AdvHealthc Mater 2017;6（11）：1601406。[14] Nam S，Stowers R，Lou J，Xia Y，Chaudhuri O.改变PEG密度以控制藻酸盐-PEG水凝胶中的应力松弛用于3D细胞培养研究。生物材料2019;200：15-24.[15] WaddellSJ，de Andrés MC，Tsimbouri PM，Alakpa EV，Cusack M，Dalby MJ等人，仿生牡蛎壳复制的地形改变了人类骨骼干细胞的行为。组织工程杂志2018;9：2041731418794007。[16] FengC，Zhang W，Deng C，Li G，Chang J，Zhang Z，et al. 3D打印类莲藕仿生材料用于细胞输送和组织再生。Adv Sci2017;4（12）：1700401。[17] RieuC，Parisi C，Mosser G，Haye B，Coradin T，Fernandes FM，et al. 用于3D细胞培养的冷冻铸造微脊胶原支架的局部定向原纤维形成。ACS Appl MaterInterfaces 2019;11（16）：14672-83.[18] Liu Z ， Li Y ， Li W ， Lian W ， Kemell M ， Hietala S ， et al. Close-loopdynamicnanohydrodes on collagen-ark with in situ gelating transformationcapability forbiomimetic stage-specific diabetic wound healing. Mater Horiz2019;6（2）：385-93.[19] Zhang YS，Yao J.生物材料-组织相互作用成像。Trends Biotechnol2018;36（4）：403-14.[20] 郑伟，蒋翔. 利用微流体技术合成活体组织 Acc Chem Res2018;51（12）：3166-73。[21] 董 瑞 ， 刘 毅 ， 牟 丽 ， 邓 建 ， 蒋 翔 . 基 于 微 流 体 的 生 物 材 料 和 生 物 装 置 。 AdvMater2019;31（45）：1805033.[22] HipplerM ，Lemma ED ，Bertels S，Blasco E，Barner-Kowollik C，WegenerM，et al. 研究基本细胞生物学的3D支架。 Adv Mater 2019;31（26）：1808110.[23] Cai Y，Wu F，Yu Y，Liu Y，Shao C，Gu H，et al.用于预防子宫内粘连的液滴微流体多孔支架。Acta Biomater2019;84：222-30.[24] Nguyen L，Bang S，Noh I.人骨髓间充质干细胞在多孔明胶微载体上长期动态体外培养的组织再生。组织工程再生医学2019;16（1）：19-28。[25] Zhu K，Yu Y，Cheng Y，Tian C，Zhao G，Zhao Y. 用 于 细胞包封的全水相微流体技术。ACS Appl Mater Interfaces 2019;11（5）：4826-32.[26] 傅飞，尚丽，陈智，余勇，赵勇。生物灵感的生活结构彩色水凝胶。机器人科学2018;3（16）：eaar 8580.[27] 王X，郭Y，南X，石S，王X，张X.以水溶性胶体晶体模板制备反蛋白石吸附剂，以获得对水溶液中水杨酸的吸附容量。 J HazardMater 2019;371：362-9.[28] 崔世文，谢杰，夏毅。壳聚糖基反蛋白石：用于细胞培养的具有均匀孔结构的三维支架。Adv Mater 2009;21（29）：2997-3001.[29] 张荣，张瑞，张瑞，朱新，姚勇，马诺哈拉，等.反蛋白石结构场致发射体.北京：科学出版社，2001. 高级功能材料2019;29（16）：1808571。[30] 尚丽，程英，赵英. 新兴液滴微流体技术。 Chem Rev 2017;117（12）：7964-8040。[31] GuoD ， XiaoJ ， ChenJ ， LiuY ， YuC ， CaoM ， etal.Superhydrophobic“aspirator”： towardsdispersionandmanipulationofmicro/nanoliter droplets. Small2015;11（35）：4491-6.[32] 余英，付飞，尚丽，程英，顾忠，赵英。来自微流体的生物启发螺旋微纤维。AdvMater2017;29（18）：1605765.[33] Lee SS，Kim SH.利用乳胶模板控制封装液晶。Macromol Res2018;26（12）：1054-65。[34] Song Y，Michaels TCT，Ma Q，Liu Z，Yuan H，Takayama S，et al.蛋白质纳米纤维网络调制的全水乳液液滴的Budding-like分裂。Nat Commun2018;9（1）：2110.[35] Chang CB ， Wilking JN ， Kim SH ， Shum HC ， Weitz DA. Monodisperseemulsiondrop microenvironments for bacterial biofilm growth. Small 2015;11（32）：3954-61.[36] Kim B，Lee S，Kim SH.用于pH触发释放的双乳液模板各向异性微胶囊。 AdvMater Interfaces 2018;5（4）：1701472.[37] Kim M，Choe YE，Kim GH.可注射分级微/纳米纤维胶原基支架。Chem Eng J2019;365：220-30.[38] 黄勇，宋霞，邓军，查春，黄伟，吴勇，等。分级碳质支架上的超分散磷化钼和硫化磷纳米粒子用于析氢电催化。Appl Catal B2019;245：656-61.[39] 吴勇，张凯，杨斌. 有序混合微/纳米结构及其光学应用。Adv Opt Mater2019;7（7）：1800980.[40] [10]杨文，杨文.明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶的合成，性能和生物医学应用。生物材料2015;73：254-71.[41] Klotz BJ，Gawlitta D，Rosenberg AJWP，Malda J，Melchels FPW.明胶-甲基丙烯酰水凝胶：面向基于生物制造的组织修复。TrendsBiotechnol 2016;34（5）：394-407.C.邵，Y. Liu，J. Chi等人工程7（2021）17781785[42] Kessler L，Gehrke S，Winnefeld M，Huber B，Hoch E，Walter T等人，用于软组 织 工 程 的 甲 基 丙 烯 酸 化 明 胶 / 透 明 质 酸 基 水 凝 胶 。 组 织 工 程 杂 志 2017;8 ：2041731417744157。[43] Lee BH，Shirahama H，Kim MH，Lee JH，Cho NJ，Tan LP. 高度有序的胶体模板明胶甲基丙烯酰基基用于三维组织类似物的水凝胶平台。NPG Asia Mater2017;9（7）：e412.[44] Peters EB，Christoforou N，Leong KW，Truskey GA，West JL.含有细胞粘附肽和蛋白酶敏感肽的聚乙二醇水凝胶支架支持内皮祖细胞形成微血管。CellMolBioeng 2016;9（1）：38-54.[45] ShimK，Kim SH，Lee D，Kim B，Kim TH，Jung Y，等. 用于三维细胞培养的微米级多孔明胶支架的制备。J Ind Eng Chem2017;50：183-9.