i本文的最新情况见最后INRMATICINLOCKED12（2018）6来自Omptin家族的伤寒沙门氏菌外膜蛋白酶（PgtE）的底物特异性-一种计算机蛋白质组学方法Gopinath Samykannua，Gopinath Samykannu a，Gopinath Vijayababua，Jeyakumar Natarajanb，a印度泰米尔纳德邦哥印拜陀Bharathiar大学生物信息学系结构生物学实验室b印度泰米尔纳德邦哥印拜陀Bharathiar大学生物信息学系数据挖掘和文本挖掘实验室A R T I C L E I N F O保留字：天冬氨酸蛋白酶Omptin外膜蛋白酶和催化活性A B S T R A C T伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性病原体，可引起人类严重的全身性感染，如伤寒和胃肠道疾病。PgtE属于Omptin家族，在宿主-病原体界面起着重要作用。 在本研究中，S.检索伤寒PgtE序列并预测切割位点。由于不存在S的晶体结构.typhi PgtE的理论三维结构模型预测，这有助于理解蛋白酶抑制机制。与已知蛋白酶抑制剂的分子相互作用研究表明，天冬氨酸蛋白酶抑制剂茚地那韦与S.伤寒PgtE.从金属离子对接研究来看，Mg2+与Zn2+、Cu2+相比，具有更好的相互作用。多病原菌Omptin蛋白酶家族的序列比对表明，Omptin蛋白酶家族中相互作用的残基是保守的。这些结果将为开发抗S. 伤寒PgtE和Omptin家族蛋白酶。1. 介绍伤寒沙门氏菌是人类特有的病原体，可引起严重的全身感染，如伤寒。据估计，每年有多达13亿例急性胃肠炎病例，导致300万人死亡。然而，非常需要有效的药物开发策略来对抗伤寒[1-4 ]。Omptin家族蛋白酶的外膜蛋白（OMP）已被认为是提供抗伤寒保护的潜在候选物[5然而，S.伤寒PgtE（外膜蛋白酶）可能作为抗伤寒和其它系统性疾病的潜在药物靶点。通常，细菌蛋白酶是在宿主-病原体边界处起核心作用的威胁生命的毒力因子。蛋白酶分泌并附着于细胞表面或嵌入细菌外膜中，并切割多种底物，包括纤溶酶原和抗菌肽[8]。Omptins组织了一组独特的外膜（OM）蛋白酶，其与致病性有关并存在于许多革兰氏阴性病原体中，包括大肠杆菌（OmpT和OmpP）、鼠疫耶尔森氏菌（Pla）、鼠伤寒沙门氏菌（PgtE）、志贺氏菌（SopA）和伤寒沙门氏菌（PgtE）。Omptin蛋白酶结构首次从E. coli OmpT [9]。Omptin家族蛋白通常属于蛋白酶如丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的催化基团[10]。Omp-tin首先根据Asp的存在被分类为丝氨酸蛋白酶和他的。此外，令人想起的是，丝氨酸蛋白酶具有Asp-His-Ser三联体的存在[11]。然而，最近的实验研究得出结论，Omptin家族具有丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶的组合特征，并且它们构成了蛋白酶的独特家族[12-17 ]。此外，蛋白酶家族特异性是S.伤寒PgtE作为一个新的治疗目标，在现代时代。蛋白酶的经典抑制剂对Omptins无效，因为它们独特的催化机制[18，19]。然而，目前还没有常见的特异性和有效的Omptin抑制剂;因此，PgtE的研究是Omptin病原体药物开发策略的一个范围。在目前的研究中，我们集中在理论模型的结构，S。 typhi PgtE，从而解释了蛋白酶抑制机制和来自序列分析的切割特异性。研究了FDA批准的蛋白酶抑制剂与常见金属离子（Zn2+、Cu2+和Mg2+）的相互作用。最后，对Omptin家族成员进行多序列分析，以确定其功能特征。这反过来将为开发针对这组Omptin病原体的新型治疗策略提供新的知识。*通讯作者。电子邮件地址：thundergopi@gmail.com（G. Samykannu），n. yahoo.co.in（J. Natarajan）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2018.05.005接收日期：2018年4月10日;接收日期：2018年5月21日;接受日期：2018年5月21日2018年1月2日至4日，2352-9148/©2018PublisheddbyElsevierLtd.这是一个不可避免的问题，因为CCBY-NC-NDLicense（http：//creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4。0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学杂志主页：www.elsevier.com/locate/imuINRMATICINLOCKED12（2018）6G. Samykannu等人72. 材料和方法2.1. Omptin家族-一级序列分析S.由312个氨基酸组成的伤寒PgtE序列已从UniProtKB（Q8Z4Y4）[ 20 ]中检索并提交给InterPro服务器以预测PgtE的结构域结构[21]。使用Pro-Gene 1. 0 [22]计算分子量和理论等电点（pI）以及PROTTER [23]去除的信号肽。PSIPRED [24]工具用于预测氨基酸序列中二级结构元件2.2. 蛋白酶切割位点鉴定PROSPER（PROtease Specificity Prediction servER），一个基于特征的集成服务器，用于从一级序列预测24个不同蛋白酶家族的新型底物及其切割位点。PROSPER服务器利用支持向量回归和双轮廓贝叶斯特征提取方法，使用推断的主要序列和结构特征进行预测。该综合服务器能够使用机器学习技术预测单个底物序列内的多个蛋白酶的底物切割位点。它预计将成为鉴定蛋白酶切割位点的有价值的工具[25]。2.3. 建模与验证找到类似于S的模板。 typhiPgtE，BLAST（基本局部比对搜索工具）针对PDB数据库用default参数进行[26]。I-TASSER是一种基于二级结构增强的Profile-Profile线程对齐（PPA）[ 27，28 ]的分层蛋白质结构建模方法，用于构建PgtE的理论结构。根据C评分（置信评分）选择最佳 模 型 。 能 量 最 小 化 和 自 动 细 化 由 Modrefiner 进 行 ， 并 通 过PROPERTIES进行验证[29]。将改进的理论结构保存到蛋白质模型数据库（PMDB）[30]。2.4. 蛋白质-配体结合位点预测COACH，一个在线的元服务器被用来预测蛋白质-配体结合位点。它通过两种比较方法TM-SITE和S-SITE生成互补配体结合位点预测，通过结合特异性亚结构和序列特征比较从BioLiP蛋白质功能数据库中识别配体结合模板[31]。2.5. 蛋白质制备和受体网格形成滑翔（薛定谔），蛋白制备向导应用程序执行校正，如分配键级，添加氢，处理金属，找到重叠和删除水分子与5倍的建模结构。除此之外，最大限度地减少RMSD，0.30用OPLS_2005进行了验证。基于受体网格的分子对接辅助配体结合可实现的构象。比例因子1.0μ m和部分电荷切割的范德华半径比例是0.25- 是的加入预测的配体结合位点残基构建受体Grid。其他参数用作Glide（薛定谔套件）的默认设置[32，33]。通过文献整理蛋白酶抑制剂，并从PubChem数据库中检索2D结构[34]，并通过Glide（Schrodinger）的Ligprep向导应用程序对这些抑制剂进行配体制备。Ligprep执行许多校正，如氢的添加、2D到3D转换、校正的键长和键角、低能结构、立体化学和环构象[35]，然后在优化的液体模拟势（OPLS 2005）力场中进行最小化和优化[36]。2.6. 与蛋白酶抑制剂的分子对接使用Glide模块进行受体-配体对接。将所制备和优化的配体可选择性地对接在蛋白质的网格框中。最佳滑动评分（G-评分）和H-键形成用于基于配体的相对结合亲和力对配体进行分级。GLIDE模块中的XP可视化工具可分析特定配体-蛋白质相互作用。使用LIGPLOT+ [ 37 ]进行对接结果的示意性二维表示。2.7. 金属离子MIB（Metal Ion-Binding Site Prediction and Docking Server，金属离子结合位点预测与对接服务器）是一个利用片段转换法提供准确、完整的金属离子结合位点残基搜索方法的服务器。支持与12种金属离子结合的残留物的预测查询蛋白质结构应与数据库中的每个金属结合模板进行比较，以定位金属结合残基。查询蛋白的每个残基都被分配了一个结合评分[38]。2.8. 多病原体分析革 兰 氏 阴 性 细 菌 病 原 体 的 外 膜 蛋 白 酶 包 括 大 肠 杆 菌 的 OmpT（P09169）和OmpP。coli（P34210）、S.鼠伤寒沙门氏菌（P06185）、Y. pestis（E5GAD 2）和SopA。从UniProtKB检索来自Omptin家族序列的Escherichia exneri（033641）。通过BlastAlign比对多个序列，并通过ESPript查看[39]。开展S. 伤寒PgtE的表达情况见图1A。 1.Fig. 1. S.伤寒PgtE底物特异性。S.从UniProtKB检索伤寒PgtE一级序列，从PubChem检索蛋白酶抑制剂的2D结构。 箭头标记表示S的管线。 伤寒PgtE-底物特异性。INRMATICINLOCKED12（2018）6G. Samykannu等人8图2. S. 伤寒PgtE. 将N-末端至C-末端的氨基酸序列红色圆圈表示信号肽（1标记每10个残基编号（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本3. 结果和讨论3.1. PgtE的Omptin域架构师普罗特透露，S。 typhi PgtE的特性和架构如图2所示。去除信号肽（1-20）并进行InterPro分析结构域区域，这揭示了PgtE属于外膜粘附素/肽酶Omptin（IPR 020080）的同源超家族（5-292 aa），如补充图S1所示。用ProGene 1.0进行的一级序列分析表明，PgtE由292个氨基酸组成（不含信号肽），相对分子量为32861.06 Da，理论等电点（PI）为5.18. 这些理化因子在体外培养中更占优势实验3.2. 蛋白酶切割位点鉴定进行了全面的分析，以揭示表征蛋白酶底物特异性的重要结构决定因素;某些蛋白酶更可能在不稳定、溶剂暴露、无序和二级结构耗尽区域内切割底物。溶剂可及表面上的切割位点向蛋白酶的适当呈递是决定底物是否可被酶接近和切割的关键因素。预测的蛋白酶切割位点显示在图3中。分析的天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶切割位点显示在补充表S1和S2中。3.3. 建模和结构验证由于晶体结构的不存在，S. typhi PgtE理论三维模型的建立。BLAST结果显示，PDB（Protein Data Bank）ID 1I78与E. coliOmpT.使用I-TASSER服务器对PgtE进行建模，其C-Score为-0.71。C-score是用于估计I-TASSER预测模型质量的置信度评分[40-43 ]。它是根据螺纹模板对齐的重要性和结构装配模拟的收敛参数计算的。Ramachandran图计算是通过精细结构的PROPERTIES程序估计的，详情见补充表S3。最终的精制结构保存在Protein Modeled Database（PMDB ID：PM0081345）中。3.4. 蛋白酶抑制剂结合位点预测COACH服务器用于预测理论建模的S.伤寒PgtE.发现以下残基Glu29、Leu30、His 208、Phe 215、Glu 217和Ala 275占据活性位点，置信度评分（C评分）为0.15。3.5. 模型化PgtE与蛋白酶抑制剂的柔性对接本研究从文献中筛选出10个已获FDA批准的蛋白酶抑制剂，并对其进行了分子对接。与此同时，已知的蛋白酶抑制剂，如二异丙基三氟磷酸（DFP）、苯基三氟磷酸（Phenylphosphate）和苯基三氟磷酸（Phenylphosphate），图3. 预测了S. 伤寒PgtE.INRMATICINLOCKED12（2018）6G. Samykannu等人9表1蛋白酶抑制剂与S. 伤寒PgtE.PubChem ID化学名称G-Score氢键数氢键相互作用残基5362440茚地-9.126141号丝氨酸158550硫酸阿扎那韦-6.5631天冬氨酸86441243萨吉那韦-6.1783丝氨酸41，组氨酸208，天冬氨酸8654682461Tipranavir-5.845––5478883Pepstatin-5.7893Asp 33、Asp 86、Arg 21164143内尔菲纳维尔-5.2852谷氨酸29，丝氨酸41213039Darunavir-4.4543丝氨酸41，组氨酸208，谷氨酸21792727Lopinavir-4.332––65016那韦-4.0722谷氨酸29，丝氨酸41131536呋山-3.9352Glu29，Leu 40，Ser 415936氟磷酸二异丙2.467141号丝氨酸392622Ritonavir-0.9523Asp86、Arg211、Arg 1644784苯甲磺酰氟-0.167141号丝氨酸甲基磺酰氟（PMSF）和胃酶抑素对接，以确认在S.伤寒PgtE.在13种已知的抑制剂中，天冬氨酸蛋白酶特异性茚地那韦、硫酸阿扎那韦和Saguinavir被发现具有低G值和与模型PgtE的可靠氢键相互作用。简单地说，茚地那韦与PgtE的结合产生的G评分为−9.12 kcal/mol，其中茚地那韦与Ser 41表现出氢键相互作用（表1，图4 A，B）。硫酸阿扎那韦与PgtE的结合表现出G评分为−6.5 kcal/mol ， 与 Asp 86 形 成 一 个 氢 键 相 互 作 用 （ 表 1 ） 。Saguinavir与PgtE对接导致G评分为-6.1 kcal/mol，显示与His208、Ser 41和Asp 86的三种氢键相互作用（表1）。特异性经典天冬氨酸蛋白酶抑制剂如胃蛋 白 酶 抑 制 剂 与PgtE的结 合 表现出G评分为−5.78 kcal/mol（图4C），与茚地那韦相比，亲和力较低。幸运的是，众所周知的丝氨酸蛋白酶抑制剂对PgtE表现出非常低的亲和力，G值为-0.162 kcal/mol（图1）。 4D）。3.6. 接触图分析PgtE的Glu29、Asp33、Leu40、Ser41、Asp86、Arg164、His208、Arg211和Glu217残基参与与蛋白酶抑制剂形成氢键。Ser41是参与大多数相互作用的关键残基。氢键形成的接触图如图5所示。在Omptin家族的多序列分析中，保守区域存在关键残基Ser 41，揭示了第二个β-桶保守的潜力（图8）。3.7. 与金属离子（Zn2+、Cu2+和Mg2+）的金属离子可以稳定外膜蛋白结构，并有助于催化，因此，确定金属离子结合位点是理解S的生物相关性的关键。 伤寒PgtE. Zn2+、Cu2+、Mg2+等离子对外膜蛋白的催化活性有抑制作用[44]。因此，S。伤寒杆菌PgtE结合位点与Zn 2+、Cu2+和Mg2+（补充表S4）。当残基的结合评分高于特定阈值[38]时，该残基被分配到潜在的结合位点，如补充图所示。 S3.基于潜在的金属结合位点，在同一服务器（MIB）中进行分子对接。 Mg2+与Asp206和Glu207有交互作用，交互作用得分为1.738。 Zn2+和Cu2+的互作系数分别为1.699和0.847.金属离子与S.伤寒PgtE残基及其评分如图11所示。 6和补充表S5。3.8. 相互作用残基分析用文氏图分析了Zn2+、Cu2+、Mg2+与金属离子相互作用残基的相关性. Mg2+只与Ser 13相互作用Val 14、Ser 58、Val 59、Glu 60、Thr 73、Ser 74、Thr 104、Ser 105、Arg 138、Phe 139、Ile 156、Gly 157、Asp204、Asp206、Glu 207、Glu 217、Thr 236和Ser 237，同时分析Zn 2+和Cu 2+相互作用残基，并列于补充表S5中。Asp204、Asp206和Glu207是Mg2+和Zn2+共同的相互作用残基。同时，Glu207重要残基与所有三种金属离子相互作用（图7A）。相反，分析了蛋白酶切割位点、金属离子相互作用位点、活性位点和与蛋白酶抑制剂相互作用的氢键残基。共有32个位点参与蛋白酶切割（天冬氨酸和丝氨酸蛋白酶），其中Phe139、Val163、Asp206、Arg216和Glu217也是金属结合位点。理论活性位点残基Glu29、His208和Glu217与蛋白酶抑制剂具有氢键相互作用（图13）。 7 B）。3.9. 多病原体分析为了解Omptin家族其他重要外膜蛋白酶中茚地那韦（Ser41）和Mg2+（Asp206和His207）保守的相互作用残基，进行了多序列比对。从文献研究来看，革兰氏阴性菌的外膜蛋白酶主要包括大肠杆菌的OmpT和OmpP。 coli，S. typhimurium、Y. pestis和S.对Omptin家族的Escherichiacoli进行了分析。通过BlastAlign进行多序列比对随后的比对解释为几乎（50%）在保守区域中显示在图8中。Indinavir与Mg2+相互作用的丝氨酸41和天冬氨酸206在omptin家族中是保守的。Glu207是一个与Mg2+相互作用的残基，在Omptin家族中除S. SopA.4. 讨论近年来，针对蛋白酶靶点的药物开发一直是一个具有挑战性的常规，催化活性是这一困难背后的主要原因之一。丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶的组合特征S.伤寒PgtE证明在基于结构药物发现中非常有趣和普遍[9，10]。在这个问题上，我们选择S。伤寒PgtE是治疗伤寒和其他宿主致病性疾病的有效药物靶点。从序列水平分析发现丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶切割位点，并与蛋白酶抑制剂和金属相互作用残基进行了分子相互作用研究。以往的实验研究表明，丝氨酸抑制剂对鼠疫菌Pla和E. coliOmpT [44，45]。但是，在我们的分子相互作用研究中，常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂，如二异丙基氟磷酸盐（DFP）和苯甲基磺酰氟（PMSF），不能与S. 伤寒PgtE.通常，通过蛋白酶抑制剂抑制外膜蛋白酶是具有挑战性的。然而，我们将金属离子相互作用研究作为抑制S催化活性的替代方法。 伤寒INRMATICINLOCKED12（2018）6G. Samykannu等人10图4. PgtE与蛋白酶抑制剂的结合模式A）PgtE-茚地那韦复合物的3D表示，灰色和热粉色分别表示PgtE和茚地那韦。B）使用LigPlot显示PgtE与茚地那韦结合位点的2D对接位姿。虚线表示氢键相互作用，而弧形表示疏水接触。C）PgtE-胃蛋白酶抑制素复合物的3D表示和侧视图;胃蛋白酶抑制素用青色表示。D）PMSF-PgtE复合物的3D表示和侧视图; PMSF用绿色表示。(For有关本图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版。）INRMATICINLOCKED12（2018）6G. Samykannu等人11图五.氢键相互作用残基。图第六章预测潜在的金属结合位点。Zn2+（A）、Cu2+（B）和Mg2+（C）参与金属对接的预测残基分别为红色、绿色和黄色球体使用片段转换方法预测蓝色指示的不同金属结合位点图像使用Pymol创建（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本图第七章 序列相关性分析的文氏图A）三种金属相互作用残基之间的相关性。Zn2+、Cu2+和Mg2+分别代表蓝色、黄色和绿色B）金属离子相互作用残基、蛋白酶切割位点、来自理论模型的预测活性位点和来自建模的S. 伤寒PgtE分别以蓝色、黄色、绿色和红色表示。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本PgtE根据文献报道，E. coliOmpT与Zn2+的复合物显示了催化活性的抑制[44]。典型地，催化活性可被金属离子如Zn2+、Cu2+和Mg2+抑制[44-46 ]。Mg 2+与S的相互作用得分最高;伤寒杆菌Asp206和Glu207的PgtE。5. 结论根据本研究，茚地那韦（天冬氨酸蛋白酶抑制剂）具有较高的亲和力（G评分-9.126 kcal/mol），并干扰PgtE的活性，并且在omptin家族蛋白酶中保留了与Ser 41（亲水残基）的一个氢键。因此，我们分析金属INRMATICINLOCKED12（2018）6G. Samykannu等人12图第八章Omptin家族外膜蛋白酶的多序列比对图中的ESPript图显示相同和相似的残基以红色突出显示红色文本分别显示保守和半保守区域 蓝色突出显示的BOX代表PgtE与茚地那韦和Mg 2+相互作用的残基。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本S.伤寒PgtE了解催化特异性。与Zn2+（1.699）和Cu2+（0.847）相比，Mg2+（1.738）占主导地位.结果表明，茚地那韦和Mg2+对S.伤寒PgtE.这反过来将为开发针对这组Omptins细菌病原体的新型治疗策略提供新的知识。需要进一步的实验研究来证实上述发现。确认作者感谢Gracy Fathima，印度金奈Guindy国王预防医学研究所病毒学系，在手稿制作中提出了宝贵的建议INRMATICINLOCKED12（2018）6G. Samykannu等人13附录A. 补充数据与本文相关的补充数据可在http：//dx上找到。doi.org/10.1016/j.imu.2018.05.005。引用[1] MathurR，Oh H，Zhang D，Park SG，Seo J，Koblansky A，等. 伤寒沙门氏菌感染的小鼠模型。Cell2012;151：590-602.[2] CrumpJA，Mintz ED. 伤寒和副伤寒的全球趋势 临床感染与疾病2010;50：241-6.[3] KaurJ，Jain SK. 伤寒沙门氏菌抗原和毒力因子在其致病中的作用。微生物研究2012;167：199-210。[4] Crump JA，Luby SP，Mintz ED.伤寒的全球负担。世界卫生组织公牛2004;82：346-53.[5] 吴晓松，李晓松，李晓松.分子水平上完整膜蛋白质的计算和实验表征。在：RaoAR，编辑. 生物技术：生物信息学与计算生物学。USA：Stadium Press LLC;2014. p.225比58[6] Hamid N，Jain SK. 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