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文章多标志长非编码RNA图谱揭示非小细胞肺癌的脆弱性图形摘要亮点d基于CRISPR的lncRNA筛选管道促进多种癌症标志dKRAS+ NSCLC2D和3D肿瘤模型中的ASO可以靶向lncRNA漏洞作者放大图片作者:RobertaEsposito,Taisia Polidori,Dominik F.Meise,...,Adrian F.作者:Carsten Riether,RoryJohnson对应rory. ucd.ie简言之Esposito,Polidori及其同事提出了一种基于CRISPR的管道,以全面绘制KRAS+非小细胞肺癌疾病标志物中的功能性长非编码RNA。这揭示了在一系列肿瘤模型中可以被有效的反义寡核苷酸抑制剂靶向的治疗能力。埃斯波西托等人,2022,细胞基因组学2,1001712022年9月14日?2022作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100171会会开放获取文章多标志长非编码RNA图谱揭示非小细胞肺癌的脆弱性Roberta Esposito,1,2,3,16Taisia Polidori,1,2,4,16Dominik F.2000年,美国队在世界杯决赛中以10:0战胜了德国队,并以1:0战胜了德国队。赖斯,5丽娜朱,6,7,8安德烈兰兹奥的,1,2,4雨果A。吉伦-拉米雷斯,1,2,14,15朱利亚-巴西尔,1,2艾琳-卡罗佐,1,2阿德里安娜-万库拉,1,2塞巴斯蒂安-乌尔里希,9阿尔瓦罗-安德拉德斯,10,11,1,2迪伦-哈维,14佩德罗-P。麦地那,10,11,12帕特里克C。马,13西蒙·海弗利格,1,2王欣,6伊万·马丁内斯,5阿德里安·F。Ochsenbein,1,2 Carsten Riether,1,2 and Rory Johnson 1,2,14,15,17,*1Department of Medical Oncology,Inselspital,Bern University Hospital,University of Bern,Bern 3010 Switzerland2伯尔尼大学生物医学研究部,伯尔尼3008,瑞士3遗传学和生物物理学研究所6香港中文大学医学院外科学系7香港城市大学董氏生物医学中心,香港8香港城市大学深圳研究院生物技术与健康中心生物芯片技术重点实验室,深圳5180579Centre for Genomic Regulation(CRG),The Barcelona Institute for Science and Technology(BIST),Barcelona,Catalonia 08003,Spain10 GENYO,Centre for Genomics and Oncological Research,Pfizer/University of Granada/Andalusian Regional Government,Granada 18016,Spain11Instituto de Investigacio´ n Biosanitaria,Granada 18014,Spain12格拉纳达大学生物化学与分子生物学I系,格拉纳达18071,西班牙13Penn State Cancer Institute,Hershey,PA 17033,USA14都柏林大学学院生物与环境科学学院,都柏林D04 V1W8,爱尔兰15康威生物分子和生物医学研究所,都柏林大学,都柏林D04 V1W8,爱尔兰16作者贡献相等17引线触点* 通讯:rory. ucd.iehttps://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100171总结长链非编码RNA(lncRNA)在癌症中广泛失调,但它们在癌症霍尔马克中的功能作用仍不清楚。我们采用合并的CRISPR缺失来干扰在KRAS突变型非小细胞肺癌(NSCLC)中检测到的831个lncRNA对这些数据的综合分析在识别癌症基因方面优于传统的“脱落”筛选,同时优先考虑具有多效性和背景独立作用的疾病相关lncRNA。总共有80种高置信度致癌lncRNA在NSCLC中具有活性,这些lncRNA倾向于在肿瘤中扩增和过表达。后续的反义寡核苷酸(ASO)筛选入围了两个候选人,肺癌标志物LncRNA 1(CHiLL1)和GCAWKR,其敲除在二维和三维肿瘤模型中始终抑制癌症标志物分子表型分析表明,CHiLL1和GCAWKR通过不同的转录网络控制细胞水平的表型这项工作揭示了NSCLC潜在的多维功能lncRNA景观,包含潜在的治疗漏洞。介绍非小细胞肺癌(NSCLC)是全球癌症死亡的主要原因,1现有治疗面临不可治疗的突变、毒性和耐药性的挑战。2-第五、六条新 的 治 疗 靶 点 的 一 个 丰 富 来 源 是 长 链 非 编 码 RNA(lncRNA),其数量可能超过100,000,其中>98%尚未表征。7-10数百种lncRNA通过多种机制与疾病标志的进展有关,如Hanahan和Weinberg所定义的,11,12跨越癌症类型。例如SAMMSON(黑色素瘤)和lncGRS-1(神经胶质瘤)的实例由于肿瘤细胞对它们通过反义寡核苷酸(ASO)疗法的抑制的有效和特异性敏感性而作为药物靶标引起了关注。十七,十八CellGenomics 2,100171,September 14,2022 <$2022作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。会开放获取文章2Cell Genomics2,100171,2022一BDEF图1.多标志CRISPR发现促进非小细胞肺癌的lncRNA(A) 促进NSCLC标志物的(B) 库设计管道。将来自所示注释的lncRNA合并,并通过TSS接近蛋白质编码基因(排除2kb)和通过在A549中表达(排除0.1FPKM如果TSS比300 bp更近,则TSS聚类在一起,然后基于三个证据来源进行选择:CAGE、ChromHMM和DNAse I超敏反应。TSS候选物通过使用CRISPETa的10个成对的引导RNA(pgRNA)设计靶向。(C) 按目标区域分列的图书馆组成注意,一些lncRNA基因座由>1个靶向转录起始位点(TSS)表示(D) 基于蓝色荧光蛋白(BFP)标记物的表达,使用荧光激活细胞分选(FACS)来分选稳定的表达Cas9的细胞方框表示筛选中使用的分选的细胞群。(图例接下页)CCell Genomics2,100171,2022年9月14日3文章会开放获取大量证据表明lncRNA在肺癌中的中心作用。16例如,PVT1和MALAT1在肺肿瘤中反复过表达或扩增,它们的操纵改变了体外和体内的细胞生长和侵袭力,使它们成为有希望的治疗靶点。其他实例包括LINC00680,其通过结合GATA 6、21、22起作用,以及LINC00511,其通过结合染色质修饰酶EZH2并抑制肿瘤抑制基因(包括p57和LATS 2)来促进NSCLC。尽管如此,lncRNA促进NSCLC中连锁病理标志的程度和性质仍不清楚。随着CRISPR-Cas基因组编辑的出现,鉴定lncRNA治疗靶标的努力已经24CRISPR筛选已经揭示了大量lncRNA促进细胞增殖、途径激活和治疗抗性的疾病标志25-27药物发现的一个关键挑战是体外发现的临床前靶点的验证率很低。28高度集中的单一背景/单一标志筛选设计,包括上述设计,容易发现促进细胞系特异性表型的lncRNA,其不适用于所讨论的疾病。最近的CRISPR-inhibition(CRISPRi)筛选证明了对六种不同癌症类型细胞系中lncRNA的高度特异性作用。然而,这是否也影响来自相同癌症类型的细胞系的关键问题尚未得到解决。因此,为了最大化发现的命中的效用,理想的筛选应该优先考虑多效性(影响多种疾病标志)和背景独立性(有效而不管细胞模型)的lncRNA靶标。在这里,我们全面绘制了KRAS+NSCLC的功能性lncRNA图谱。我们在两种KRAS+ NSCLC模型(A549和H460)中对促进三种癌症标志(增殖,耐药性和侵袭)的lncRNA进行了8种疾病特异性CRISPR筛选我们重建了非小细胞肺癌的功能lncRNA景观,揭示了一个治疗漏洞的目录这些lncRNA通过复杂的转录网络与癌症标志物连接,并且可以被有效、低毒性和靶向的ASO靶向29结果NSCLC中lncRNA的多功能CRISPR筛选管道为了鉴定促进KRAS+ NSCLC的lncRNA,我们将双切除CRISPR敲除(DECKO)CRISPR缺失(CRISPR-del)系统调整为高通量合并形式24、30(图1A)。这种方法实现了每小时的功能丧失(LOF),通过配对的向导RNA(pgRNA)删除靶基因的转录起始位点(TSS)来干扰31我们开发了一个筛选文库来全面地查询NSCLC lncRNA转录组。为了避免可能通过非预期的脱靶发生的假阳性结果的已知问题,36我们省略了距离最近的蛋白质编码外显子2 kb的任何靶区域。我们整合并过滤了公开的10、37、38和内部基因注释39、40(图1B和S1A),用于831个表达的lncRNA的最终靶组,对应于998个高置信度TSS,此后命名为将具有双向启动子或具有重叠TSS的lncRNA候选物合并成单个TSS。考虑到这些情况,95.2%的靶区域含有一个单个lncRNA启动子,而4.5%和0.3%分别含有两个和三个启动子(图S1D)。对于这些,我们添加了靶向中性对照基因座(预期不会影响细胞表型)和阳性对照蛋白质编码基因(PCG)(在细胞生长和顺铂抗性中具有已知作用)的pgRNA(图1C)。这些靶标形成了“libDECK 0-NSCLC 1”的基础,“libDECK 0-在克隆到DECKO骨架中之后(图S1C),测序显示在序列同一性(两个间隔区之间60.8%完美匹配)和覆盖度(第90至第10百分位数计数比:4.6倍)方面的高质量41(图S1F)。为了鉴定与NSCLC一般相关的命中,我们在两种广泛使用的KRAS+ NSCLC模型A549和H460中进行了平行实验,42,43产生了稳定表达高水平Cas9蛋白的非克隆细胞系,44如蓝色荧光蛋白(BFP)所证明的(图ID和S1E)。鉴于pgRNA有效产生所需基因组事件的能力已受到质疑,45我们首先对文库pgRNA进行了广泛的验证。靶向已知的促进NSCLC的lncRNADNMBP-AS 1(候选物331)46导致其启动子区的缺失和表达的丧失(图1E、1F和S1G),支持CRISPR-del策略的有效性。为了更普遍地评估我们的pgRNA策略的影响,我们随机克隆了另外12个pgRNA,靶向12个候选者。我们在10/12例病例中观察到靶位点的预期缺失。在对靶RNA水平的影响方面,我们观察到7/12的预期下调,而对于三个靶,我们观察到没有变化,并且对于两个靶,我们观察到上调(图S3A),与Shkirava小组的先前观察结果47(E) (Top)筛选文库的一个成员DNMBP-AS 1在A549细胞中通过CRISPR缺失靶向基因座显示在上图中,包括数据S4中列出的基因分型PCR引物(F,R)、TSS靶区域(黑色)和文库pgRNA(红色条)。(下)使用指定引物与来自用非靶向pgRNA(对照)或DNMBP-AS 1TSS pgRNA_9(KO)转染的细胞的模板基因组DNA(gDNA)的PCR指出了野生型和缺失扩增子的预期长度(F) CRISPR-del后DNMBP-AS 1RNA的定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)测量4Cell Genomics2,100171,2022会开放获取文章EFA B CD我G H图2.使CRISPR筛查适应癌症标志(A) 增殖:该策略采用互补阴性(缺失)(生长促进lncRNA(B) 顺铂敏感性:采用另一种补充策略在阴性(脱落)“存活"筛选中抗性促进lncRNA的pgRNA将在存活细胞中耗尽。在阳性“死亡"筛选中(C) 迁移:分别收集在给定时间内能够/不能通过多孔膜迁移的细胞促进迁移的lncRNA通过其pgRNA在迁移受损细胞中的富集来鉴定(D) A549中脱落检测的读数计数相关性读取计数的Log 2(T3:3周; T0:时间点0)。Z评分转换的log2值。统计学显著性:Pearson相关性。(E) lncRNA候选物(黑色)在A549细胞中脱落筛选的生物学重复之间的相关性数据表示为Z评分转换的log 2FC值(T3/T0)。统计学显著性:Pearson相关性。(F) lncRNA候选物以及中性和阳性对照在A549缺失筛选中的P值分布。使用靶向ORF和TSS的pgRNA分别分析用作阳性对照的蛋白质编码基因。统计学显著性:Wilcoxon检验(成对比较)和Kruskal-Wallis(总体差异)。(图例接下页)Cell Genomics2,100171,2022年9月14日5文章会开放获取NSCLC lncRNA癌症通过各种表型标志或肿瘤进展期间细胞获得的生物学能力而茁壮成长11先前的CRISPR筛选已限于单一标志,增殖或耐药性,17,25,27,48,49并且通常集中于阴性对于NSCLC lncRNA的更全面和生物医学相关的展望,我们调整了合并筛选以鉴定癌症进展的多个标志(即增殖、化疗抗性和侵袭)中的致病基因(图2A-2C)。为了提高灵敏度,我们实施了复杂的“阳性"筛选,其中富集了感兴趣的pgRNA。因此,为了鉴定促进细胞适应性和增殖的lncRNA,我们将(1)经典的阴性选择筛选,其中靶50例补充筛查在准确性方面比纯脱落筛查产生了适度但一致的获益(受试者-操作者曲线下面积值:A549增殖分别为0.7 vs 0.67,A549顺铂分别为0.77 vs 0.73);因此,我们决定将其纳入后续分析。我们在多个数据整合水平下观察到生物学独立重复之间的高度相关性,从原始pgRNA读数计数(图2D)到pgRNA倍数变化和靶水平倍数变化(图2E和S2即使在单独考虑lncRNA候选物并省略阳性对照靶标时也观察到这些相关性。我们的脱落相关性与先前的CRISPR-del脱落49相当(图S2F)。正如预期的,阳性对照基因的pgRNA在脱落筛选中显著耗尽,而中性对照没有(图2F)。为了测量启动子缺失的LOF效率,靶向阳性对照PCG的pgRNA分为两种不同的模式:(1)常规开放阅读框(ORF)突变,预期产生最大LOF,和(2)启动子缺失,类似于lncRNA。启动子缺失pgRNA显示出可检测但较低的表型影响,表明与PCG的ORF靶向筛选相比,lncRNA的CRISPR-del筛选面临固有的较低灵敏度(图2F)。使用生物学复制的dropout筛选,77个lncRNA被鉴定为A549细胞增殖所必需的这些包括已知的NSCLC lncRNA,例如也在H460中发现的PVT 1,20SBF 2-AS 1,51和LINC 00511,23此外 , 在 其 他 癌 症 类 型 中 鉴 定 的 lncRNA 包 括 LINC0068021 和LINC0091052(图2G)。影响pgRNA缺失效率的因素知之甚少。使用生长表型作为删除效率的代表,我们观察到了预期的相关性,观察到的和生物信息学预测的sgRNA效率(RuleSet2算法)(图S1H)。另一方面,我们发现与pgRNA取向没有关系(图S1I),并且较大缺失产生较强表型的倾向较弱,这可能是由于对lncRNA表达的较大影响(图S1J)。接下来,我们比较了两种NSCLC背景中的等效脱落筛查。即使在省略阳性对照之后,在鉴定的靶标之间也存在显著一致性(图2H)。此外,在库中包含的109个阳性对照中,分别有37个和16个在A549和H460的脱落筛选中得分,其中10个是两者共有的(p = 0.011,超几何检验)。为了加强这些数据,我们在相同的细胞中进行了互补CFSE筛选。正如预期的那样,这些阳性选择筛选在H460细胞中显示出与dropout结果的反相关性,尽管在A549细胞中没有,可能是由于技术原因(图S2B)。KRAS+肿瘤患者通常接受细胞毒性铂类化疗药物治疗,但肿瘤经常出现耐药性。为了鉴定促进化学抗性的lncRNA,我们再次在仔细选择的顺铂浓度(图S2C)下采用互补筛选(图2B)如前所述,在生物学重复中观察到相关结果(图S2D和S2F)。迁移是肿瘤细胞侵袭和转移的重要标志通过将具有快速或缓慢迁移的细胞通过多孔膜分离48小时(图2C、S2E和S2G),我们筛选了促进迁移的lncRNA.这产生了65个lncRNA,其中10个已经与许多癌症类型16(包括SNHG 654和SNHG 12)中的迁移和侵袭相关。55图2I和数据S1中总结的这些数据代表了NSCLC标志中功能性lncRNA的来源。筛选命中可以通过RNA产物进行验证和发挥作用接下来,我们通过选择两种lncRNA TSS用于进一步验证来测试这些结果的可靠性,基于它们的最高排名和两种细胞系之间的一致性:候选物205,在脱落筛选中被鉴定为最高命中(A549:log 2倍数变化[FC] =-1.81,错误发现率[FDR] = 1.2310- 7),以及在增殖和顺铂两者中的候选物509(A549:log 2 FC =-1.15,FDR = 9.783 10- 7)。候选物205与双向反义GENCODE注释的基因LINC 00115和RP 11 -206L10.11的TSS重叠(图3A)。候选物509靶向由几种BIGTranscriptome lncRNA共享的TSS(图3A)。支持该基因座的重要性,它包含两个额外的命中,候选507(LINC00910)和候选508(图S2H)。为了验证这些缺失的表型效应,我们测试了随机选择的高分pgRNA(图3B,箭头)。候选205 pgRNA有效地删除了靶向区域(G) A549脱落屏幕。水平线指示FDR 0.2处的命中的截止值先前发表的NSCLC和其他癌症中的lncRNA分别以绿色和蓝色标记(H) A549和H460脱落筛选的比较(为了更清晰的可视化,删除了四个点,使用Pearson相关性估计了所有数据点的统计学显著性)。(I) 通过在具有FDR 0.2的A549和H460细胞中筛选,分析对所述表型具有潜在影响的lncRNA命中浅蓝色的蝙蝠表示以前从CLC2数据库中发现的“癌症lncRNA”的分数166Cell Genomics2,100171,2022会开放获取文章C一BDE(图例见下页)F会开放获取文章Cell Genomics2,100171,2022年9月14日7(图S2I),并且虽然设计PCR引物的困难阻止了候选物509的缺失的直接测试,但它有效地降低了RNA水平(图S2J)。两种pgRNA均对细胞适应性产生有效作用:表达pgRNA的mCherry+细胞被对照细胞(GFP+,表达AAVS1的pgRNA)竞争,其作用与必需核糖体基因RPS5的失活相当(图3C和S2K)。在常规生长试验中观察到类似结果(图S2L)。此外,候选物509的pgRNA也使细胞对顺铂敏感,与筛选结果一致(图3C)。与候选205区域重叠的两个基因中的哪一个负责这些效应仍然不明确此外,基因组缺失不能区分DNA依赖性(例如,增强子)或RNA依赖性机制(例如,成熟lncRNA或其转录)。为了解决这两个问题,我们使用两个基因特异性ASO靶向每个基因。这揭示了LINC 00115而不是RP 11 -206L10.11在通过RNA依赖性机制56驱动细胞增殖中的含义(图3D)。这些效应在三维(3D)球 体 模 型 中 得 到 进 一 步 证 实 ( 图 S2M ) 。 这 些 结 果 与 将LINC00115与肺癌增殖和迁移54、57以及与其他恶性肿瘤联系起来的先前报告一致。例如,它的敲低抑制乳腺癌58和前列腺癌59中的细胞增殖和侵袭,并且它可以抑制结肠直肠癌细胞60对于迁移屏幕,观察到类似的高验证率。三个命中物(候选物215(AC104024.3)、候选物448(CECR 7)和候选物489(MIR23AHG))的ASO敲低导致A549迁移的显著损害(图3E和3F)。总之,这些发现支持CRISPR-del筛选鉴定通过RNA依赖性机制促进癌症标志的lncRNA基因多标志屏幕集成,目标我们接下来将这些数据整合到驱动NSCLC标志的lncRNA的定量和综合图谱中。为了结合不同的筛选结果,同时平衡效应大小和显著性,我们创建了一个综合目标优先级排序管道(TPP)(图4A)。TPP可以在所有屏幕上运行,以进行(‘‘hallmark-specific’’; see 在正确分类阳性和中性对照品方面,泛标志评级优于常用积分方法和单独筛选(图4B)。在通过泛标志排序定义的总体置信度的背景下,标志特异性值提供了每个lncRNA在三个功能维度中的特征(图4C)。单独的泛标志分析鉴定了总共80个lncRNA命中(筛选的那些的~8%;数据S2)(FDR 0.2),其中73个先前与NSCLC无关(图4D)。正如预期的,生长促进PCG阳性对照和已知的肺癌lncRNA,但不是中性对照,在命中中富集这得到了独立富集评分分析的支持(图S3C)。标志特异性整合在至少一个标志中产生了134个命中(约筛选的那些的13%),其中19个在两个标志中发现,并且在三个标志中没有发现(图S3D)。先前的CRISPR筛选已经证明细胞生长所需的lncRNA具有高度细胞类型特异性活性。实际上,在A549和H460背景中比较来自常规缺失分析的lncRNA命中揭示了低程度的一致性-lncRNA倾向于仅在发现它们的细胞类型中显示活性(图4E,左)。相比之下,泛标志命中显示出相对背景无关的活性,在两种细胞类型中都有活性(图4E,右),因此支持了组合多种细胞系的整合筛选策略用于发现治疗靶标的有用性。几条额外的证据支持筛选命中lncRNA的致癌作用。预期促癌lncRNA在肿瘤中上调。62,63与此一致,在KRAS+肺肿瘤中,泛标志命中比非命中显著更高地表达(图4F),并且与邻近组织相比,在肿瘤中上调(图4G)。此外,在来自肿瘤(图4H和S3E)和细胞系(图S3F)的DNA中,筛选命中倾向于扩增,但不会耗尽。总之,不同筛选的整合产生了功能性lncRNA的准确图谱,其富集了有意义的临床特征并显示了细胞背景独立性活性。靶向NSCLC lncRNA的多标志lncRNA图谱是治疗性ASO的靶标资源。64图3.筛选命中验证显示可重现的表型(A) 候选205(左)和候选509(右)基因座。引物和ASO位点如上所示TSS靶区域和来自筛选文库的10个pgRNA如下所示。(B) A549中脱落筛选过程中pgRNA计数的Log2倍数变化T0:时间点0; T2:时间点2周; T3:时间点3周。箭头表示随机选择并单独克隆用于验证的pgRNA。(C) 竞争测定。通过流式细胞术随时间(天)测量携带对照AAVS1基因座(绿色,GFP)或指示靶标(红色,mCherry)的pgRNA的荧光标记细胞靶向必需核糖体蛋白RPS5的ORF的pgRNA用作阳性对照。n = 3,误差条表示在最后时间点通过Student t检验估计的SD统计学显著性(D) 使用ASO分别靶向在候选物205处共享TSS的两个lncRNA对于每一种,在A549细胞中使用两种不同的ASO(1和2)顶板:LINC 00115;下壁板:RP 11 -206L10.11。细胞群(左); ASO处理72小时后通过qRT-PCR测量的RNA表达(右)n = 4;误差条表示通过单尾Student t检验估计SD显著性(E) (左)来自A549迁移筛选的迁移和非迁移细胞群体中pgRNA的Log2倍数变化(右)A549细胞跨transwell支持物迁移24小时的验证实验用靶向所示lncRNA的ASO或非靶向对照处理细胞。(F) (左)用两种不同的ASO处理的A549细胞中的qRT-PCR,每种ASO用于候选物215、448和489。将表达标准化为非靶向ASO。(右)标准化为非靶向ASO的结晶紫定量将数据绘制为来自三个独立生物学重复的平均值土SD通过单尾Student t检验估计统计学会开放获取文章8Cell Genomics2,100171,2022B一CD EH(图例见下页)GF会开放获取文章Cell Genomics2,100171,2022年9月14日9基于新颖性和缺乏蛋白质编码证据的标准排名靠前的命中,此后称为“第1级”。7个由GENCODE注释,2个由FANTOM CAT或BIGTranscriptome注释(表S2)。对于每种候选物,我们设计了一系列ASO,并设法鉴定出至少两种具有R40%敲低效力的独立ASO(图S4A)。接下来,我们测试了ASO在对于五种lncRNA(第2层),我们观察到具有两种不同ASO序列的细胞增殖的可再现损失,表明中靶活性。为了检查这些作用的广泛适用性,我们在另外两种KRAS+ NSCLC细胞系H460和H441(来源于心包积液转移)中重新测试了ASO,并观察到类似的结果(图5A)。与它们对顺铂敏感 性的 作用 一致, 第 2层基 因使用 来自 癌症 基因组 图谱(TCGA)数据集的表达数据,我们注意到第2层 lncRNA在NSCLC肿瘤中过表达,尽管这不是选择标准(图5B)。有人提出,靶向lncRNA可以在健康组织中引起较低的副作用,尽管很少有研究对此进行了测试。17我们评估了第2层ASO对一组非转化的肺衍生细胞的作用:HBEC 3-KT、MRC 5-CV1(均为永生化)和CCD-12 Lu(原代)。这些细胞表现出减弱的或不存在的应答,特别是对于前两种候选lncRNA(图5A)。因此,我们将我们的重点缩小到这些第3层 lncRNA:候选42(ENSG 00000253616),此后更名为肺LncRNA 1(CHiLL1 ) 中 的 癌 症 霍 尔 标 记 , 和 候 选 物 240 ( ENSG00000272808;GCAWKR)。68两者都具有低蛋白编码潜力(图S4D)。复制实验证实了使用CRISPR-del方法与多个pgRNA(图S3B)以及更重要的是每个基因的两个独立ASO(图5C、S4C和S4 E)的敲低效力和表型影响。ASO在其他KRAS+和EGFR-突变细胞系中显示活性,表明具有亚型依赖性活性(图S4F)。另一方面,过度表达CHiLL1和GCAWKR都不能挽救ASO诱导的表型(图S5C)。这可能是顺式调节机制的结果,尽管我们没有观察到CHiLLl的最近邻TNFRSF10B的这种作用(图S5B)。另一个合理的解释是,这些lncRNA基因座通过功能性转录本亚型发挥作用,这些亚型未被注释,也未在本文中进行测试。据我们所知,CHiLL1以前从未与癌症有关。 它位于8号染色体上,由两个注释的同种型组成,共享第一个外显子(图5D,上图)。GENCODE注释可以在真正TSS的稍微下游开始,如各种转录组学证据所证明的,但后者落在CRISPR-del靶向的区域内 , 因 此 不 太 可 能 影 响 筛 选 结 果 ( 图 S5A ) 。 它 位 于PCGTNFRSF 10 B的上游和同一条链上,先前与NSCLC相关,69尽管我们没有发现两个基因座之间的通读转录的证据,如注释的表达序列标签(EST)(图S5A)和RT-PCR(图S5B)所示。支持其相关性的是,CHiLL1的高表达与较差的总存活率相关(图S4G)。GCAWKR(Chr15)包含共享共同TSS的四种同种型(图5D,下图),其由包括全长长读段测序70的多种证据支持(图5D)。它与结肠癌的不良预后有关71,在本文的准备过程中,据报道它是胃癌的一个致癌基因。68它在小鼠中具有可能的直系同源物,未表征的Gm44753(图S5H)。与CHiLL1相反,GCAWKR基因座在癌症基因组中经常扩增(图S5F)。在TCGA样品中,GCAWKR表达在近端炎性(PI)肿瘤亚型中上调,这与较差的预后相关(图S4H和S4 I; PI相对于PP:p = 43 10- 5; PI相对于TRU:p = 0.008)。与单层培养物相比,3D体外模型代表了更忠实的肿瘤模型。我们将CHiLLl和GCAWKRASO递送至H441细胞的球状体培养物,并观察到接近阳性对照mTOR的活力降低(图5E和S4J)。图4. lncRNA在NSCLC(A) 目标优先级管道(TPP)集成多个屏幕以生成统一的命中排名。TPP采用效应量(稳健秩聚合[RRA])和统计显著性(经验布朗TPP Pan,将筛选整合在一起的TPP靶优先化管道; TPP pheno,整合特定癌症表型的多个筛选的靶优先化管道(即,增殖或顺铂反应)。(B) 比较屏幕和集成方法的性能性能测量为基于正确召回/拒绝文库对照(分别为阳性和中性对照)的ROC曲线下面积(AUC)(C) 三元图包含泛标志分析中的所有显著命中(FDR 0.2)三个角代表标志,由符号表示每个角落的接近度选择用于进一步验证和蛋白质编码对照的候选物分别由候选物编号或基因名称选择的先前与肺腺癌(LUAD)相关的lncRNA以蓝色标记花瓣图显示了所选lncRNA的标志性贡献。(D) 在泛霍尔马克和个人霍尔马克屏幕中发现的点击数。右:用于比较的筛选文库的靶标组成。 16Pro,增殖; Cis,顺铂; Mig,迁移; Pan,pan-标志,将所有筛选整合在一起。(E) 散点图显示了H460和A549中脱落检测命中(左)和泛标志命中(右)的相关性箭头指向各组的几何(F) 与来自癌症基因组图谱(TCGA)LUAD队列的KRAS+样品中所有其他筛选的lncRNA(非命中)相比,泛标志命中的表达通过单尾Welch t检验估计统计学显著性(G) 在LUAD样品和健康组织的独立队列中与非命中相比的泛标志命中的表达(87个肿瘤; 77个正常)。61统计学显著性:成对双尾Student(H) 泛癌症复发性扩增和缺失,在全基因组泛癌症分析(PCAWG)队列中估计。统计学显著性:Fisher会开放获取文章10Cell Genomics2,100171,2022一BCDEH图5. 致癌lncRNACHiLL1和GCAWKR(A) (左)测试敲低效率和ASO转染的表型效应的实验工作流程。(右)所有ASO/细胞系结果的总结。柱:靶向lncRNA;柱:ASO和细胞系。值反映了ASO转染后存活力的平均log2倍数变化,并针对对照非靶向ASO进行增殖标准化,n> 2。左边的数字表示库候选标识符,并被分组到层中。每个lncRNA被两个(图例接下页)GF会开放获取文章Cell Genomics2,100171,2022年9月14日11来源于患者来源的异种移植物(PDX)的类器官概括了个体患者的治疗反应。74CHiLL1ASO的交付导致KRAS+人NSCLC BE874类器官的细胞活力(图5F)。我们很好奇,通过ASO的“鸡尾酒”,同时瞄准两个或更多不同的漏洞是否可能提供协同效益。实际上,与单独的相等剂量的任一ASO相比,CHiLL 1/GCAWKRASO的50:50混合物(第3层混合物)显示出对细胞活力的更大影响(图5G和S4K)。第2层lncRNA的五种ASO混合物产生类似的益处(图5G)。有趣的是,鸡尾酒对非癌细胞没有产生额外的毒性(图1)。ure S4L),这表明它们可能代表了以无毒性为代价增加效力的治疗策略。最后,我们询问了哪些患者可能从ASO治疗中获益。TCGA肿瘤 的 RNA 测 序 ( RNA-seq ) 数 据 表 明 , 78% 表 达 CHiLLl 和GCAWKR中的至少一种,并且可能通过第3层混合物治疗,其对于第2层上升至92%(图5H)。总之,这些结果表明,第3层lncRNA可以被有效且低毒性的ASO靶向,这对于大多数NSCLC病例单独或组合可能是有益的(图5H)。CHiLL1和GCAWKRASO通过不同的作用调节癌症标志我们接下来研究了将NSCLC霍尔标记与CHiLL 1和GCAWKR联系起来的作用模式。CHiLL1外显子缺乏明显的功能元件(图S5E),而GCAWKR包含许多保守的序列和结构(图6 A),暗示潜在的功能元件。亚细胞定位为lncRNA提供了重要的机制线索。令人惊讶的是,尽管它们具有相似的致癌作用,但荧光原位杂交(FISH)揭示了相反的定位模式:CHiLL 1主要位于细胞质中,而GCAWKR位于细胞核中(图6B)。通过敲低验证特异性(图S5G),并通过细胞分级进一步证实结果(图6C)。为了获得更详细的机制见解,我们使用RNA-seq的分子表型分析来量化A549细胞被CHiLL1ASO干扰。71对照细胞中的CHiLL 1表达为8.3个转录物/百万(TPM),相当于每个细胞约4个分子,并且与FISH一致。RNA-seq证实了ASO敲低效率(图6D和S6A),并且所得的转录组变化在ASO之间高度相关,表明大多数效应是通过CHiLLl的靶向干扰产生的(图6E)。在H460细胞中观察到类似的凋亡(图S6B)。通过A549和H460之间的相关表达变化进一步证实了CHiLL1依赖性表达变化的普遍性(图S6C)。我们通过富集分析探索了受干扰的基因。从两个ASO的交叉定义高置信度靶基因子集,我们鉴定了富集的KEGG术语78(图6F和S6D)。这些强调了疾病的相关性(例如,分子特征数据库(MSigDB)79的类似分析涉及p53和mTORC1信号传导(图S6E)。许多转录因子结合位点(TFBS)在变化的基因中富集,包括ZBTB7A(在A549和H460中)80, 81(图S6F)。有趣的是,ZBTB7A已被报道为调节包括细胞凋亡和糖酵解在内的过程的癌基因和肿瘤抑制基因。82-85在细胞类型非依赖性富集的KEGG途径中,有支持这一点的是,CHiLLl而不是GCAWKR的敲低导致早期凋亡细胞的显著增加(图6G)。转向GCAWKR(平均表达2.5TPM,每个细胞约1个拷贝),我们观察到使用单个ASO的有效敲低和细胞类型依赖性效应(图6H、6I和S6G)。基因富集分析揭示了与CHiLL1部分重叠的术语 ( 包 括 p53 途 径 、 胆 固 醇 稳 态 和 上 皮 间 质 转 化 ) 。 在GCAWKR特异性术语中,我们注意到几个与细胞周期进展相关的术语,包括实际上,GCAWKR而不是CHiLL1的敲低导致G2期细胞的增加(图6K)。GCAWKR目标独立的ASO序列(1和2,下文)。MALAT1lncRNA用作阳性对照,预期其敲低会降低活力。(B) TCGA RNA-seq中2级lncRNA-CHiLL 1、GCAWKR、候选物205(LINC 00115)、候选物507(LINC 00910)的表达LUAD:513份样本;正常:59份样本。通过Student t检验估计的统计学显著性TCGA数据集中的候选215数据不可用。(C) 用两个独立的ASO转染后的A549细胞生长将结果相对于非靶向对照ASO标准化(n = 4个生物学重复;误差条:SD统计显著性:双尾学生(D) 编码CHiLLl(上图)和GCAWKR(下图)的基因组基因座。(E) (左)ASO转染(25 nM)后7天H441球状体培养物的活力mTOR ASO用作阳性对照(n = 4个生物学重复;误差条:SD;单尾Student(右)代表性图像(Leica DM IL LED组织培养显微镜)。(F) CHiLL1ASO转染后从单个KRAS+患者来源的异种移植物生长的BE 874类器官的独立重复的活力。误差条表示技术重复的可变性,而生物重复在底部指示(n= 4个生物重复; n > 3个技术重复;误差条:SD;单尾学生(G) ASO鸡尾酒(Top)对于所有实验,ASO的总量不变(25 nM)。鸡尾酒由相同比例的指示ASO组成。(底部)A549细胞群体,标准化为非靶向ASO(n = 4个生物学重复;误差条:SD;统计学显著性:单尾Mann-Whitney检验)。(H) KRAS+ LUAD肿瘤中第2层 lncRNA的表达(TCGA,n = 101)。每个细胞代表一个患者,并被着色以反映通过RNA-seq估计的表达底部是具有
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