Sorbonne Université Ecole doctorale n°158 Cerveau Cognition Comportement Institut du Fer à Moulin Equipe « Plasticité des réseaux corticaux et épilepsie » Caractérisation et intérêt thérapeutique de potentialisateurs du co-transporteur potassium-chlorure de type 2 (KCC2) dans les épilepsies du lobe temporal Par Florian Donneger Thèse de doctorat de Neurosciences Dirigée par Dr Jean-Christophe Poncer Présentée et soutenue publiquement le 9 septembre 2022 Devant un jury composé de : Dr. Sandrine Betuing Présidente du jury Dr. Yves De Koninck Rapporteur Dr. Vincent Magloire Rapporteur Dr. Elena Dossi Examinatrice Dr. Stéphane Auvin Examinateur Dr. Jean-Christophe Poncer Directeur de thèse 1 Résumé Dans les neurones, les co-transporteurs cation-chlorure (CCCs) tels que le co-transporteur potassium-chlorure de type 2 (KCC2) et le co-transporteur sodium-potassium-chlorure de type 1 (NKCC1), contrôlent l'homéostasie intraneuronale des ions chlorure et, par conséquent, l'efficacité et la polarité de la signalisation synaptique par l'acide gamma-aminobutyrique (GABA). Dans de nombreuses affections neurologiques dont l'épilepsie, une réduction de l'expression ou de la fonction de KCC2 peut conduire à une signalisation GABAergique dépolarisante et paradoxalement excitatrice, et ainsi contribuer à l’émergence d’activités pathologiques et de crises. Compenser la dérégulation de la fonction des CCCs dans la pathologie apparaît donc comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Le bumétanide, un antagoniste du transporteur NKCC1, ne parvient pas à prévenir les crises néonatales aiguës lors d’essais cliniques et au contraire induit des effets secondaires tels qu’une ototoxicité. En revanche, deux composés – la prochlorperazine (PCPZ) et le CLP257 – récemment identifiés par criblage de banques de petites molécules et proposés comme potentialisateurs de KCC2, semblent améliorer les symptômes dans différents modèles animaux d’affections associées à une perte d’expression de KCC2. Cependant, leur mode d'action dans les neurones corticaux et leur potentiel thérapeutique dans l'épilepsie restent inconnus, voire controversés. Au cours de ma thèse, j’ai tout d'abord comparé le mode d'action de ces composés dans des neurones hippocampiques de rat et mis en évidence que tous deux améliorent la fonction de KCC2. Cet effet s'accompagne pour le CLP257 d'une modulation allostérique positive des récepteurs GABAA extrasynaptiques. De façon intéressante, ces deux composés réduisent la diffusion latérale de KCC2 à la membrane plasmique et augmentent l’agrégation du transporteur, sans modifier son expression totale ou membranaire, ni le niveau de phosphorylation de ses résidus canoniques. J’ai alors mis en évidence que ces deux composés suppriment efficacement les décharges spontanées de type interictal, enregistrées in vitro dans le tissu hippocampique postopératoire réséqué de patients souffrant d’épilepsie du lobe temporal (ELT). De plus, pharmacorésistante. 0l'administration chronique de PCPZ permet de réduire l'apparition de crises et la fréquence des0mTLE模型中的癫痫样事件。因此，我的研究结果解读了0两个候选KCC2增强剂在海马神经元中的作用方式0并首次证明了它们在药物耐药性癫痫中的抗癫痫潜力2 0摘要0在神经元中，阳离子-氯共转运体（CCCs），如钾-氯共转运体02型（KCC2）和钠-钾-氯共转运体1型（NKCC1）控制0神经元内氯离子稳态，进而影响GABA的效率和极性0γ-氨基丁酸（GABA）突触信号传导。在许多神经系统疾病中，0包括癫痫在内，KCC2表达或功能的减少可能导致去极化和0反而具有兴奋性的GABA信号传导，可能有助于病理活动0和癫痫。因此，补偿CCC功能失调在病理中的作用似乎是一种有希望的治疗策略0看起来是一种有前途的治疗策略。NKCC1的拮抗剂布美他尼0转运体，在临床试验中未能预防新生儿急性癫痫，反而引起了副作用0如耳毒性等副作用。相反，两种化合物 - 盐酸普罗氯贝嗪（PCPZ）和CLP2570最近从库筛选中鉴定出的两种候选KCC2增强剂似乎改善了0在与KCC2抑制相关的多种动物模型中改善了症状。然而，0它们在皮层神经元中的作用方式及其在癫痫治疗中的潜力仍然未知0尚不清楚甚至存在争议。在我的博士学位期间，我首先比较了这些化合物的作用方式0两种化合物在大鼠海马神经元中的作用，并显示它们都增强了KCC20功能。CLP257的这种效应伴随着对KCC2的正向变构调节0extrasynaptic GABA A 受体。有趣的是，这两种化合物都减少了0KCC2在细胞膜中的表达并增加其聚集，而不改变其总量或0膜表达或其经典残基的磷酸化水平。然后，我0证明这两种化合物有效地抑制了自发的癫痫样放电0在难治性中央颞叶癫痫患者手术后切除的海马组织中记录的0癫痫（mTLE）患者。此外，长期给予PCPZ可以减少癫痫发作的发生0以及小鼠mTLE模型中癫痫样事件的频率。因此，我的研究结果揭示了0我比较了两种候选KCC2增强剂在海马神经元中的作用方式，并证明了0首次揭示了它们在药物耐药性癫痫中的抗癫痫潜力 3 Cette partie remerciement ne serait rien sans un immense merci pour toi Jean-Christophe ! 0致谢0首先，我要衷心感谢评委会成员接受评审0评估我的工作：Yves De Koninck，Vincent Magloire，Elena Dossi，Stéphane Auvin和0Sandrine Betuing。我迫不及待地想向您展示我在博士学位中取得的成果0我很期待与您在9月9日讨论0我还要感谢Corentin Le Magueresse，Alexandre Mourot，Fabrice Wendling0和Michel Le Van Quyen，因为您是我的论文委员会成员。您的0您的关心、鼓励和宝贵的反馈一直激励着我0年来一直对这个项目的进展至关重要0感谢医学研究基金会资助我第四年的博士学位0(FDT202106013286)，它使我能够平静地完成这项研究工作。0感谢你在我M2阶段开始时对我的信任和支持。这4年的博士论文是0没有Jean-Christophe，这部分致谢将毫无意义！0但也有很多成功和难以忘怀的时刻。就像你经常对我说的那样，“这就是博士论文，小伙子”。0年半是充满了工作、情感、怀疑、困难和失败的时光。0宝贵建议，你的关注细节，你的倾听，你的耐心，你的鼓励和支持。0“这就是博士论文，小伙子”。没有你的帮助，你的宝贵建议，你的细心，你的倾听，你的耐心，你的鼓励和支持，这个博士论文是不可能的。0一起工作，并且我一直非常尊重你的工作方式和看待事物的方式。0我为我们所取得的一切感到非常自豪。0一起工作，并且我将带着你给我的一切离开实验室。0能和你一起做这个博士论文，希望我们能继续在困难时刻互相支持。我为0打电话而不是发邮件...0你传授的知识，不要担心，我不会忘记测量溶液的渗透压，也不会0我的博士论文，你在某些技术上的专业知识以及你的研究经验对我帮助很大。0Sabine，也谢谢你！尽管我们之间的交流并不多，但在这个0与整个团队一起，对每个人在新冠疫情期间都有很大帮助。4 Merci aux “anciens” du labo : Marie, Sana, Clémence, Manisha… Marie pour m’avoir tant 0也对你的烧烤派对印象深刻。0没有她们，这个博士论文将会完全不同，困难得多：0我希望感谢团队中的许多人，但我必须从你开始。你对推动这个项目的进展0八卦会议，每周的泰国经济巨坑。幸好我们在“倒霉星期二”时互相支持！0Marion和Étienne。Marion，感谢你在实验室的帮助，每天的支持，我们在0的架子上，但这就是种很多白菜、番茄和胡萝卜的结果...谢谢你们！0感谢Étienne的支持，感谢你在许多实验中提供的宝贵帮助，以及我们的愉快0我们（和相应的笑声）。幸好在这些年里你一直在那里！如果没有你，我会0如果我能保持动力和情绪，这在很大程度上要归功于你！没有什么比0只是在JC家度过一个晚上，去ter ter St Charles转一圈，去Magic Saint-Tropez玩一下，就这样了。0再见！0感谢Zaha，我们每天的交谈和欧洲杯期间的小比赛。0Claire，感谢你带来的小发现和好心情，Anne-Lise，感谢你的善良0帮助我发现了著名的蘑菇之舞！感谢Jeremy在0博士论文的最后阶段。请不要在我离开时破坏实验室并打击每个人...0你知道，一支小蜡烛总能缓和气氛。感谢Marianne在0你的善良和关怀。Erwann，祝你在博士论文上好运，Carla和0Solen，我相信你们会很好的。0感谢Adrien在项目的in vivo部分给予的帮助。我们将长久记住我们的0在马赛的冒险/困难！0感谢我有幸指导的实习生：Nicolas、Yoness、Rosenn、Benjamine、Mona、Youcef、Estilla、Pauline。你们直接或间接地对这个论文做出了贡献。0你们都非常优秀，我对你们的未来充满信心。0你们对这个论文的进展间接地做出了贡献，对我帮助很大。0你们在实习期间做得很出色。我相信你们将在自己选择的领域取得成功。0祝你们未来一切顺利。Pauline，用英语给你几句话：你的才华令人难以置信。0感谢实验室的“前辈们”：Marie、Sana、Clémence、Manisha...Marie对我帮助很大。0选择下一步做什么！0感谢Sana在我到达实验室时教给我的一切，感谢你的鼓励和我们的激动人心的讨论。0感谢你的愉快、支持和在生物化学方面的宝贵帮助。0感谢克莱曼斯的陪伴和我们经常的小聊天，感谢Manisha的友善和帮助。0感谢你在Matlab方面的帮助。5 0我很幸运能在这个“家庭式”友善的环境中完成我的博士学位。0感谢Jean-Antoine在这个研究所的接待和你的友善。0感谢菲奥娜的支持和友善！0感谢Mythili在显微镜方面的帮助，以及你的温柔和友善。0感谢安妮在生物化学方面给予我的宝贵建议，总是很愉快。0很高兴来找你问很多问题。也要感谢研究所的全体工作人员。0感谢动物房、行政部门和洗衣房的工作人员，感谢你们的工作和帮助。0我也要特别感谢研究所的教师同事们。0感谢苏菲和理查德。与你们相遇和交谈总是一种愉快。0感谢Richard教给我如何进行出色的实验。0感谢塞莉娅、比勒尔和多尼亚，感谢我们偶尔的小聊天和你们的支持。0祝你们在论文的最后阶段好运！0也要感谢我通过合作结识的人们。感谢你们。0感谢Antoine教给我和Adrien如何植入ECoG探头。谢谢你。0感谢金伟在我到达埃克塞特时的热情接待，以及你教给我的一切关于...的知识。0感谢你在免疫沉淀实验方面的帮助。我在这个美丽的城市度过了美好的时光。0感谢奥雷莉、路易斯和西奥，感谢我们的交流和这个城市的圣诞市场。0感谢我们一起取得的成功。0在我的博士期间，我也在索邦大学教授课程。0这次经历真的很不可思议，我会非常怀念这个美丽的职业！0感谢所有教师同事和技术平台的工作人员。0感谢你一直在帮助那些小助教（包括我）。0也要非常感谢我在这三年里遇到的所有学生，我很荣幸。0很高兴看到你们的进展和进步。0说到索邦大学就不能不提IBPS，我一定会想到你，斯蒂芬妮。谢谢你。0感谢你在我M1时让我了解了研究的世界，谢谢你的建议和帮助。0你的善良和关怀。谢谢你给我自信，鼓励我继续从事我喜欢的领域！0这个论文需要我花费时间和精力。6 0感谢所有一直陪伴在我身边的朋友们，他们非常理解我有多么...0那个为复习高考而紧张的时期已经过去了！我们的讨论、外出和...0感谢你，Damien，长久以来一直在我身边鼓励和支持我。她...0这个论文没有你，不会是同样的。所以真的谢谢你！还要感谢你，Kévin，我们可以...0在魔兽世界上放松的时光是无价的。如果我今天能走到这一步，是因为...0我们一起度过的时光：烧烤、新年晚会和我们的小放松时光（或者...0非常感谢你，Julien！很遗憾这四年来我很少有时间。0Adrien，Florent！每次我们见面时，总是有美好时光的保证。0感谢你的坚定支持，偶尔的外出和鼓励！0谢谢你，Amina，在我最需要的时候支持和鼓励我。0谢谢你，Alexis，我在博士论文中的“兄弟”。幸运的是，我们在整个过程中互相支持...0在硕士期间，感谢你的帮助和陪伴。当你回到巴黎时，见到你真是一种享受。0困难，也是实验室日常小胜利。我真诚地认为这个...0谢谢你，Sara，为我们在巴黎的小餐馆和漫步，我们总是设法安排...0我总是可以依靠你，你的好心情和快乐。谢谢你为我带来的所有时刻...0在这不容易的一年里。谢谢你们，Joachim和Camille，为硕士期间的美好回忆。我们...0解决不同游戏中的谜题。谢谢你们，Céline，Quentin，Valentin，...0博士论文时，总是保证有美好时光。0逃生游戏、餐厅和假期。0谢谢你，Amina，在我最需要的时候支持和鼓励我。0谢谢你，Émeline，为我们的笑声和一起度过的时光。0在硕士期间，感谢你的帮助和陪伴。当你回到巴黎时，见到你真是一种享受。0巴黎。你的博士论文也快要结束了！0谢谢你，Sara，为我们在巴黎的小餐馆和漫步，我们总是设法安排...0我们的时间表像部长一样！谢谢你，Juliette，在这段时间里陪伴和支持我...0在这不容易的一年里。谢谢你们，Joachim和Camille，为硕士期间的美好回忆。我们...0这些年我们见面不多，但我喜欢和你们相遇，和你们分享...0博士论文的进展和困难。7 0谢谢你，Chloé。尽管我们在一个非常困难的时刻相遇，你...0你一直在这里给我带来笑容，支持我，陪伴我和鼓励我。这些...0在写作期间一起度过的时光真是一股清新的空气，给了我...0让我坚持下去。能和你在一起，我真是太幸运了。0我还要感谢我的家人，首先是我的父母。谢谢你们...0一直相信我，无论何时都给予我支持和鼓励。这些年来...0研究方面的。我知道我的工作节奏可能令人担忧和难以理解...0尽管如此，你们尽力陪伴我，总是非常了解我在经历什么。0感谢您为我做的一切，为我们在音乐厅度过的美好时光，以及在家中分享的时刻。我迫不及待地想让您看到整个工作的成果！0感谢我的父母，感谢他们对我的支持和鼓励。我很幸运能有你们作为我的父母。0希望您能看到我整个工作的成果！0还要感谢我的兄弟们。感谢奥雷利安在魁北克度过的难忘时光！那真是太棒了！0真的很完美，这给了我开始论文所需的所有能量。谢谢你！0还要感谢你们陪伴我度过的所有时光：音乐会、电影等等...这些都是美好的时刻！0非常感谢文森特的支持，以及我们在假期期间进行的小型运动会！0还要感谢我们在布列塔尼度过的美好时光，这让我们在工作之前能够充电！0也感谢我的姑姑、叔叔和表兄弟们的支持和鼓励。0最后，我要深深地思念我的祖父母。我真心希望你们能够看到这一切的成果！0希望您能看到这项工作的完成并出席我的答辩，但是生活却做出了不同的决定。0不幸的是，生活做出了不同的决定。你们一直是我的榜样。0在生活中教会我追求梦想，坚定不移，坚持不懈，永不放弃。0希望这份谦逊的工作能够反映出我所做的一部分，甚至只是一部分。0你传授给我的价值观。8 0目录0摘要 ......................................................................................................... 1 摘要........................................................................................................ 2 致谢............................................................................................. 3 目录..................................................................................................... 8 图表目录........................................................................................ 14 表格目录...................................................................................... 17 缩写列表................................................................................. 18 引言............................................................................................... 230总体引言............................................................................................................. 230I. KCC2：表达、功能和调控 ....................................................................... 260I.1- KCC2的表达...................................................................................................... 260I.1.1- CCCs家族：介绍和系统发育 .................................................. 260I.1.2- CCCs的分子结构 ............................................................................. 270I.1.3- CCCs的表达.............................................................................................. 300I.1.3.1- 在生物体中的表达 ............................................................................ 300I.1.3.2- 在中枢神经系统中的表达................................................................................... 320I.1.3.3- KCC2的细胞和亚细胞表达 ............................................... 370I.2- KCC2的功能：经典和非经典角色............................................. 400I.2.1- KCC2和热力学平衡 ..................................................................... 400I.2.2- Neuronal chloride ion homeostasis and polarity of GABAergic responses430I.2.3- Water transport and osmotic regulation in neurons ................................... 470I.2.4- Non-canonical functions of KCC2 ....................................................................... 500I.2.4.1- Synaptogenesis and synaptic function.............................................................. 500I.2.4.2- Neuronal excitability ....................................................................................... 520I.2.4.3- Other roles ....................................................................................................... 530I.3- Regulation of KCC2 expression, membrane stability and function... 530I.3.1- Regulation of KCC2 expression ...................................................................... 530I.3.2- Post-translational regulation mechanisms of KCC2 ...................................... 569 I.3.2.5- Phosphorylations .............................................................................................. 63 II.2.3.3- Voies de signalisation...................................................................................... 94 II.2.4- Ictogenèse et activités épileptiformes .................................................................... 96 II.2.4.1- Décharges de type interictal (interictal-like discharges, IILDs) ..................... 97 II.2.4.2- Décharges de type préictal (PILDs) et ictal (ILDs)......................................... 99 II.2.4.3- Oscillations à haute fréquence (HFOs) ......................................................... 101 II.2.5- Diagnostic et examens ......................................................................................... 102 II.2.6- Traitements antiépileptiques (TAEs) : mécanismes d’action et effets secondaires......................................................................................................................................... 107 II.2.6.1- Mécanismes d’action des TAEs .................................................................... 107 II.2.6.2- Effets indésirables des TAEs......................................................................... 113 II.2.7- Épilepsies pharmacorésistantes : quelles solutions et avec quels risques ? ......... 115 II.2.7.1- Résection du foyer épileptique par chirurgie ................................................ 116 II.2.7.2- Neurostimulation ........................................................................................... 118 II.2.7.3- Thérapies diététiques ..................................................................................... 120 0I.3.2.1- Exocytosis, endocytosis and degradation .............................................................. 570I.3.2.2- Oligomerization ................................................................................................ 590I.3.2.3- Aggregation ........................................................................................................ 610I.3.2.4- Lateral diffusion .............................................................................................. 620I.3.3- Regulation of KCC2 by synaptic transmission .............................................. 700I.3.3.1- Regulation by excitatory transmission........................................................ 700I.3.3.2- Regulation by inhibitory transmission ........................................................ 710I.3.3.3- Regulation by metabotropic receptors ................................................ 720I.3.4- Regulation of KCC2 by protein interactions .............................................. 730II- KCC2 and pathology........................................................................................................... 760II.1- Alteration of KCC2 expression and function in pathology.................... 760II.1.1 Spasticity and neuropathic pain ........................................................................ 760II.1.2- Psychiatric and neurodegenerative diseases ..................................................... 790II.1.3- Other pathologies.................................................................................................. 810II.2- Epilepsy(s) ................................................................................................................... 820II.2.1- Definitions and classification of seizures and epilepsy ........................................ 820II.2.2- Pathophysiology of epilepsy............................................................................. 870II.2.3- Mechanisms of epileptogenesis................................................................................ 880II.2.3.1- Morp
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