基于PCR-DGGE生物条形码的桃品种细菌和酵母菌群落特异性分析

埃及基础与应用科学杂志2（2015）327主办方：完整文章基于PCR-DGGE生物条形码的桃品种Ahmed El Shobakya，b，*，Jean-Christophe Meileb，Didier Montetba埃及，El Dakahylea 35516， El Mansoura，El Gohoureya Street，Mansoura大学，科学学院，植物学系b法国蒙彼利埃市Cirad，UMR 95 Sud，TA B-95/16，73，rue Jean-François Breton，Cedex 5 34398A R T I CL EI N F OA B S T R A C T文章历史记录：2015年4月5日收到2015年6月15日收到修订版2015年6月17日接受2015年6月29日在线发布保留字：桃子生物条形码PCR-DGGE细菌和酵母菌群落简介：欧盟法规继续严格，以确保食品安全和质量的最高程度。欧盟进口产品的可追溯性和标签仍然是一个有价值的问题（欧盟法规178/2002）。客户最关注的问题之一是产品可追溯性，其定义为通过认证方法筛选任何食品的整个历史或地理来源或养殖类型的能力。在这方面，我们建议通过一种独特的分子分析技术，然后通过图像分析来研究微生物生态学和农业食品类型之间的联系。目的：利用“PCR-DGGE”技术建立16 SrDNA和26 SrDNA图谱结果：当使用图像和多变量分析分析16S和26S rDNA图谱时，在来自约旦的不同栽培类型的细菌和酵母菌谱带具有一定的特异性，可作为水果栽培类型的条形码本文的意义：这种方法可以被认为是一种新的可追溯性技术，它为水果提供了一个独特的生物条形码，并允许控制食品的农业类型© 2015曼苏拉大学。由Elsevier B. V.制作和托管。这是一个CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。* 通讯作者。联系电话： +20 1000858724。电子邮件地址：dshobaky84@yahoo.com（A. El Shobaky）。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2015.06.0022314- 808 X/© 2015曼苏拉大学。Elsevier B. V.制作和托管这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp328埃及基础与应用科学杂志2（2015）3271.介绍食品安全是欧盟进口食品的一个欧盟规定对所有进口食品实行可追溯性长期以来，食品工业的追溯系统非常简单，但随着现行良好生产规范（GMP）的日益实施，追溯系统在生产链中变得非常重要。可追溯性可以定义为通过注册的标准化方法检索物品或其相关组件或活动的历史或地理来源的能力（ISO，2007）。在撒哈拉以南非洲等发展中国家安装这些文件系统面临着很多困难，这就是为什么已经制定了新的可追溯性战略为了跟踪桃果实加工过程中的耕作类型，我们提出了鉴定和验证来自这些果实原产地的一些连锁和重要的生物标记桃（Prunus persica）被定义为原产于中国西北地区的落叶乔木，在昆仑山北坡和塔里木盆地之间的地区，它是第一个栽培的[1]。它有一种可食用的多汁水果，叫做桃子。种名P. persica与其在波斯的广泛种植有关。它也属于李属，包括蔷薇科的樱桃和李子。最后，桃与扁桃同属扁桃亚属，扁桃亚属的区别在于种子的波纹壳最常见的分析方法，可以确保确定耕作类型，使用条形码，稳定同位素，光谱学等。利用果实的基因组标记来确保桃子的可追溯性似乎很困难。然而，新鲜水果的表皮被污染并且不是无菌的，因此它可能携带微生物或其任何DNA片段。各种微生物的发生取决于水果还有人类活动带来的微生物[3]。该想法是开发一种基于对产品上存在的微生物菌群的DNA分析的该技术基于水果的微生物群落对某种农业类型具有特异性的假设本论文的主要目的是进行PCR-DGGE，一种在特定的独特步骤中分析水果上存在的所有细菌和酵母的方法，以创造一种分析技术，该技术允许将细菌和酵母群落与耕作类型联系据我们所知，只有Hamdouche等人[5]描述了发酵过程中可可的类似方法该技术最具体的优点是，它允许分析不可培养和可培养的厌氧和好氧细菌，还提供了一种快速分析方法，以观察群落结构响应不同环境因素的任何变化[6]。2.材料和方法2.1.水果取样成熟的桃果实是从约旦两种不同的农业类型中收获和收集的，它们是来自传统农业的有机和处理的果实。对照水果由有机农业生产，而处理水果由常规农业生产。收集这些水果是为了保存它们最初的微生物菌群。2012年10月，使用手套直接从树上采集，并保存在无菌袋中。将采集的样品储存在冰箱中，然后通过飞机转移至CiradMontpellier（法国）。从新鲜水果中提取细菌和确定了样品的耕作类型和收获日期。2.2.从细菌和酵母中该技术根据El Sheikha等人[7]描述的方案进行。2.3.PCR-DGGE分析使用Muyzer等人[8]描述的细菌结构域通用引物，通过PCR进行16SrDNA的特异性扩增。Gc338f（ 5′CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGCACGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG，Sigma公司，法国）和518r （5′ATTACCGCGGCTGCTGG ，Sigma公司）。用GC钳技术扩增了桃细菌群落16SrDNA的V3可变区。在338f的正向引物5 ′端添加夹子是为了确保DNA片段保持部分双链[9]。每种PCR混合物由约100 ng DNA模板、引物（0.2 µM）、dNTP（200 µM）、5 µL MgCl2（1.5mM）的10 X 无MgCl2 Taq 缓冲液（Promega Company，France）和5单位Tag聚合酶（Promega Company）组成。初始变性在95 ° C下进行1分钟，并在95 °C下变性1分钟，然后在65 °C下退火1分钟，最后在72 °C下延伸约3分钟，然后在94 °C下1分钟、55 °C下1分钟和72 °C下3分钟的20个循环用真核生物通用引物“NL 1GC（5′- CGC CCG CCG CGC GCGGCG GGC GGG GCG GGG GCC ATA TCAATA AGC GGA GGA AAAG-3′Company）扩增250个碱基对的片段[7，10]。将30 bp GC-夹（Sigma Company）加入到NL 1中。在50 μL的终体积中进行PCR，所述终体积含有0.2 μM的每种引物、dNTP（200 μM）、MgCl 2（1.5 mM）、5 μL的无MgCl 2的反应Taq缓冲液（10×）（ Promega Company ） 、 1.25 单 位 的 Taq DNA 聚 合 酶（Promega Company）和2 μL的前体DNA {约30 ng}。PCR运行约30个循环，退火温度为52 °C，持续2分钟，延伸温度为72°C，持续2分钟，变性温度为95 °C，持续60秒[7]。最初使用2%（w/v）约5µL细菌和酵母菌PCR产物329埃及基础与应用科学杂志2（2015）327琼脂糖凝胶，用溴化乙锭染色，并通过DNA质量梯100 bp标准品（Promega Company）定量。使 用 DGGE 通 过 Dcode™ 通 用 突 变 检 测 系 统 （ Bio-RadLaboratories，USA）使用Muyzer等人首先描述的程序分析PCR产物。[8][9][10][11][12][13][14][15][16][17][18][19] [7]的文件。将样品上样至含8%（w/v）聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺/N，N '-亚甲基双丙烯酰胺，37.5/1，Promega Company）的1×TAE缓冲液（40 mMTris-HCl，pH 7.4，20 mM乙酸钠，1.0mM Na 2-EDTA）中所有电泳实验均在60 °C下使用30%至60%范围内的变性梯度（100%对应于7 M尿素和40% [v/v]甲酰胺，PromegaCompany）进行。凝胶在20伏电压下干燥10分钟，然后在80伏电压下干燥12小时。电泳后，将凝胶用溴化乙锭染色30分钟，然后在蒸馏水中冲洗10分钟，然后使用Gel Smart7.3系统（Clara Vision，Les Ulis）在UV透射照明器上拍照。2.4.统计和图像分析通过Image Quant TL -软件，v.2003将所有凝胶图像的单个泳道拉直并对齐。该软件允许识别条带的相对位置DGGE分析中产生的带型被认为是种群中所有优势细菌和酵母的完整照片。任何单独的不同条带都是指独特的Kowalchuk等人[12]证实了这一点，他们证明了共迁移条带通常与相同的序列相连PCR-DGGE指纹通过共迁移条带的存在和不存在手动评分，而不管强度如何。通过Dice相似系数（SD）对成对群落相似性进行量化[13]。SD 2NcNaN b其中，Na是指A样本中记录的带号，Nb是指B样本中的带号，Nc是指两个样本中共有的带号。相似性指数表示为0（完全不相似）至100（完全相似）。通过因子对应分析，确定了两种栽培类型使用前两个方差进行FCA分析，这两个方差描述了整个数据集中的大部分变化2.5.DNA条带序列分析及微生物鉴定选择DGGE凝胶DNA条带，并通过无菌切割器从凝胶上小心地切除。将凝胶块浸泡在TE缓冲液（IOOmL）中过夜（4 °C）。使 用 Wizard PCR Preps 试 剂 盒 DNA 纯 化 系 统 （ PromegaCompany）纯化每个条带洗脱的DNA，然后使用引物（没有GC-夹）通过与上述相同的PCR条件再次扩增纯化的DNA通过GATC Biotech（Germany）对PCR扩增子进行测序。通过与NCBI的GenBank数据库进行比较，进行DNA碱基序列分析。然后，通过BLAST程序在GenBank中进行搜索，以检测部分16S和26S rDNA序列的最近记录的相对物[14]。3.结果3.1.水果取样成熟的桃果实收集在约旦从两个农业类型，这是有机农业和传统农业（图）。①的人。3.2.两种栽培类型约旦桃果实中细菌和酵母菌DNA的提取及PCR扩增验证在琼脂糖凝胶{0.8%（w/v）}上验证桃果实上存在的细菌和酵母菌群落的DNA提取，并获得非常好的模式。通过PCR产物（扩增子）在琼脂糖凝胶{2%（w/v）}上在TEA缓冲液中在100 V下电泳30分钟来进行级分的扩增效率。清楚地观察到所有得到的条带，并且具有250个碱基对（酵母）和236个碱基对（细菌）的分子大小（图1A和1B）。第2和第3段）。PCR产物（扩增子）的条带强度是非常重要的，并且证实细菌和酵母DNA的扩增进行得非常好，并且通过这种方式，我们可以继续通过DGGE方法对所有这些扩增子进行分析。图1330埃及基础与应用科学杂志2（2015）327图2 -使用Gc 338 f和518 r引物（236 bp）进行PCR后细菌群落的扩增子。泳道2-5是有机农业的c2、c3、c4、c5，而泳道6-10是常规农业的f1-5。泳道12：+ve对照大肠杆菌泳道11：3.3.细菌和酵母DNA。不同栽培方式下约旦桃果实的DGGE图谱从DGGE凝胶中观察到和获得的条带具有良好和足够的强度，使我们能够分析从约旦桃果实中提取的细菌和酵母DNA样品（图4），因此，沉积在凝胶中的整个DNA量是100%。利用DGGE凝胶电泳技术，可以利用细菌和酵母DNA作为有效的标记来检测约旦桃果实每条垂直线指的是水果种植类型，每个点指的是细菌或酵母物种。每种栽培类型的约旦桃果实的PCR-DGGE图谱的复制品对于每种类型是相同的，并且指示每种桃果实栽培类型存在4至11条带图3 -使用NL 1 GC和LS 2引物（250 bp）进行PCR后酵母菌群的扩增子。泳道2泳道13：+ve对照顶端念珠菌泳道11：331埃及基础与应用科学杂志2（2015）327图4-泳道10此外，因子对应分析（FCA）被证实是一种潜在的统计分析工具，用于比较收获季节期间根据耕作类型的约旦桃果实样品的细菌和酵母菌群落相似性（图5）。最后，我们可以清楚地看到，两种不同的耕作类型由两个不同的群体代表。3.4.两种栽培方式桃果实上优势细菌和酵母菌的测序采用PCR、DGGE和测序技术对约旦桃果实污染的细菌和酵母菌进行了分子鉴定通过这种方式，可以通过对凝胶感兴趣的条带进行测序来检测和鉴定样品中存在的优势微生物菌群。据我们所知，没有关于通过培养方法获得的来自这两种不同约旦桃种植类型的细菌和酵母菌群的从桃果实DGGE凝胶中提取酵母菌DNA和细菌DNA，并进行测序，以鉴定样品中存在的细菌和酵母菌株每个条带序列指的是基于超变区的部分16S rDNA和26S rDNA序列的236和250个碱基对的系统发育关系，将获得的序列与BLAST标准参考进行比较（表1）。3.5.DGGE条带为了描述两种栽培类型的约旦桃果实上存在的细菌和酵母菌群的变化，进行了包括PCR-DGGE和测序的分子方法。它揭示了两种农业类型之间的微生物多样性3.5.1.从DNA鉴定细菌如图4所示，对两条带的序列分析可以鉴定出类肠明串珠菌是有机桃子中该菌株传统上与植物物质、水果等相关，并且可能导致食品腐败[15]，其可能以多种不同的形式出现，所有这些都是腐败化合物累积效应的结果。因此，明串珠菌的腐败潜力不仅取决于它们的生长，还取决于它们的代谢活动。产生的腐败代谢物反映了332埃及基础与应用科学杂志2（2015）327图5细胞的生理活动，因此取决于食物系统的条件，包括氧张力，pH值和可用的碳源。第二条谱带经鉴定为棒状乳杆菌，是常规栽培桃的主要细菌该菌株是最重要的乳酸菌之一。乳酸菌群的名称是由于细菌将乳糖转化为乳酸的能力。乳酸的生产能力使其培养基呈酸性，这反过来又抑制一些其他有害或致病细菌和真菌的生长，并有利于良好的植物生长和发育[16]。此外，这些细菌可能具有一些有效的治疗特性（抗炎、抗癌活性等）。3.5.2.酵母菌的DNA鉴定在“图10”上指示的条带中包括的三个条带序列分析。4“，确保其中两种被鉴定为克鲁维毕赤酵母和发酵毕赤酵母，据报道它们是有机农业类型的桃中酵母菌群的一部分。这种酵母属于真菌科，大多数菌株通常存在于腐烂的植物和果汁中。一些毕赤酵母属物种的无性型是假丝酵母属物种。一些毕赤酵母属物种最近已被临床证明是病原体，众所周知是水果中的机会致病菌[17]。试验结束时，在常规栽培桃中检测到了占优势的酵母菌为黄银耳（Tremellaflava，TF）。该菌株是银耳科真菌属，并且该物种具有抗炎和抗感染适用性[18]。因此，许多研究人员认为TF可能是一种新型的天然替代品，可用作抗炎和抗感染剂，因此在这种农业情况下，它对水果很有价值。4.讨论一些科学家已经使用PCR-DGGE技术来分析水果及其产品中的细菌和酵母菌群[7，19 -21]。然而，我们认为，我们的论文是为数不多的出版物之一，介绍了细菌和酵母菌群分析的桃果实，以区分不同的农业类型PCR-DGGE。本研究证明了从约旦桃果实中分离的细菌和酵母菌群DNA的DGGE图谱与果实的处理密切相关表1条带最近的亲戚与参比菌株的源1（有机农业，细菌）假肠膜明串珠百分之九十九JX866706.12（传统养殖，细菌）棒状乳杆菌百分之九十八JX914660.13（有机农业，酵母）克鲁维毕赤酵母百分之九十九JX1031904（有机农业，酵母）发酵毕赤百分之九十九JX8486375（传统农业，酵母）n.黄银耳百分之八十九AF042238333埃及基础与应用科学杂志2（2015）327两种不同栽培类型桃果实的DGGE电泳图谱分析表明，桃果实中的迁移谱然而，通过研究，每种耕作模式的复制品给出了相似的DGGE图谱微生物环境的差异主要是由于土壤微生物谱带的差异，而土壤微生物谱带的差异又受耕作类型的影响不同加工方式也会所有桃果实样品的DGGE凝胶电泳均观察到一些常见的细菌和酵母菌条带我们还看到，有一个完整的统计联系之间的细菌和酵母菌群和农业模式，如果我们比较了FCA的DGGE图谱不同的水果种植模式我们可以得出结论，有足够的环境差异，两种不同的农业类型之间的约旦桃果实的收获有重大影响的细菌和酵母菌生态。在此基础上，我们可以建立一个统计关系的养殖模式和细菌酵母菌群。利用PCR-DGGE技术对桃果实酵母菌群进行分析，可用于不同栽培类型的鉴别。该全局技术与所使用的所有其他经典和传统微生物技术非常快速（即24小时）兼容，并且避免了微生物的生化分析。此外，条带的分子大小允许通过测序设施鉴定菌株通过这种方式，这种技术可以建议作为一个快速的分析追溯工具，水果，可以被认为是一个“唯一的分子生物条形码”的供应商致谢作者感谢法国蒙彼利埃Cirad，UMR 95 Sud和埃及高等教育部对这项科学研究工作的财政支持R E F E R E N C E S[1] Faust M，Timon BL.桃的起源与传播。第331章.[2] PeresB，Barlet N，Loiseau G，Montet D.食品原产地测定的分析溯源性的现行方法综述。食品控制2007;18：228[3] Sodeko OO，Izuagbe YS，Ukhun 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