多药耐药铜绿假单胞菌肺部感染的转录组学数据分析及新潜在生物标志物发现

医学信息学解锁22（2021）100509新的潜在多药耐药生物标志物 铜绿假单胞菌肺部感染的转录组学数据分析Nazanin Hosseinkhan*，Abbas Allahverdi，Fereshteh Abdolmaleki内分泌研究中心，内分泌学和代谢研究所，伊朗医学科学大学，伊朗德黑兰A R T I C L EI N FO保留字：铜绿假单胞菌多重耐药肺部感染生物标志物A B S T R A C T多药耐药性的发展是治疗铜绿假单胞菌感染的主要障碍，铜绿假单胞菌是一种导致全身广泛持续感染的机会致病菌。因此，鉴定导致铜绿假单胞菌多药耐药发展的主要基因有助于引入新的有效药物来防止耐药性的发展。在这里，我们进行了差异基因表达分析和一系列的系统生物学研究的RNASeq数据集的多药耐药铜绿假单胞菌分离株从患者的气道和野生型，药物敏感菌株。分别检测到67个和178个表达上调和下调的基因，其中包括一些功能未知的基因，其功能特征将有助于阐明铜绿假单胞菌多重耐药发展的潜在机制。通过检查构建的基因调控网络，确定了两种前馈环的情况，在确定转录因子与其靶基因之间的调控相互作用类型（激活或抑制）的情况下 ， 将 更 好 地理 解 其 对 多 药 耐 药 的真 正 贡 献 。 对 构 建 的 基因 共 表 达 网 络 进 行 检测 ， 发 现 PA14_32830 、PA14_03380、fpvA和PA14_15610等4个去调控基因与4个已知的耐药生物标志物之间存在共表达。对这四个共表达基因的功能研究，将有助于阐明它们在铜绿假单胞菌多药耐药过程中的作用。这些发现将提示新的潜在多药耐药生物标志物，在大量样本确认后，可被视为新的有希望的药物靶点。1. 介绍铜绿假单胞菌的多药耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）已成为近年来公共卫生的主要问题之一。这是非常重要的，因为铜绿假单胞菌是一种机会性病原体，能够在免疫功能低下的患者中以及在患有遗传性疾病囊性纤维化（CF）的患者的肺中引起潜在的严重感染[1]。耐药铜绿假单胞菌克隆的全球传播对公共卫生构成威胁，因此迫切需要新的治疗替代方案[2]。一些研究也强调了多药耐药性与发病率和死亡率增加之间的联系[3铜绿假单胞菌具有几种抗生素耐药性机制，包括诱导型AmpC头孢菌素酶表达、MexAB-OprM和诱导型MexXYeffluX泵，以及低外膜渗透性，与其他革兰氏阴性微生物相比，这有助于具有较低的固有抗生素敏感性[6]。药物暴露也可以通过不同的突变事件促进铜绿假单胞菌获得耐药性，这些突变事件激活耐药基因、修饰抗微生物靶标并上调几种多药外排泵。水平获得性耐药是铜绿假单胞菌获得耐药的另一种机制[7]。例如，B-内酰胺酶、超广谱B-内酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯酶的传播越来越广泛[8]。大多数铜绿假单胞菌治疗方案导致免疫力不足，因此铜绿假单胞菌感染通常用抗生素组合治疗以克服多药耐药性[9]。然而，在铜绿假单胞菌感染的联合治疗后也经常报告耐药性的发展。鉴定与耐药性相关的失调基因和途径有助于了解耐药性发展的潜在分子机制。另一方面，构建抗性样品的基因共表达网络将有助于* 通讯作者。电子邮件地址：hosseinkhan@ut.ac.ir，hosseinkhan. iums.ac.ir（N。Hosseinkhan）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100509接收日期：2020年10月7日;接收日期：2020年12月21日;接受日期：2020年12月24日2020年12月30日在线提供2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuN. Hosseinkhan等人医学信息学解锁22（2021）1005092图1.一、50个耐药和4个野生型（敏感）样品的下调（a）和上调（b）基因的热图。N. Hosseinkhan等人医学信息学解锁22（2021）1005093Fig. 1. （续）。识别被称为模块的共表达基因的功能组。检查共表达网络中高度内部连接的模块是鉴定新的耐药生物标志物的有效方法。在这项研究中，我们的主要目标是确定新的生物标志物与铜绿假单胞菌的多药耐药。对从患者呼吸道分离的多重耐药铜绿假单胞菌PA 14菌株研究可被视为新的药物靶点。2. 方法2.1. 基因表达数据集一 基因 表达 数据 设置 （SRP034661） 包括 50 RNA测序从SRA-NCBI检索从人呼吸道分离的多重耐药铜绿假单胞菌PA 14和4种野生型铜绿假单胞菌菌株的样品[10]（表S1）。铜绿假单胞菌菌株先前已被分离，并被在该项目中合作的德国几个研究机构归类为多重耐药（对2种或多种药物具有耐药性）。使用Vitek 2系统（bio M′erieu X）或Etest试纸（bio M′erieu X）进行抗生素敏感性试验。2.2. 差异基因表达分析使用“Trimmomatic“[ 11 ]流水线，应用“平均质量“阈值20和“滑动窗口“大小4，对108个fastq文件（54个配对末端样品，包括抗性和野生型）进行修剪. 然后将修剪的fastq文件引入“map with bowtie for illumina“[ 12 ]程序，使用从“Ensemb 1“数据库[ 13 ]获得的铜绿假单胞菌UCBPP PA 14基因组。的计数N. Hosseinkhan等人医学信息学解锁22（2021）1005094≥≤表1耐药样本中上调和下调转运蛋白的列表。基因是从Galan等人的研究中发现的[17] -这是唯一可用的来源-TF-靶调控关系是可见的，上调基因分子功能下调基因分子功能在“Cytoscape“3.4中实现[ 18 ]。2.5. 50例多药耐药基因共表达网络的构建PA 14_32330跨膜运输PA14_09380乙酰辅酶A跨膜样品PA 14_18090推定的主要促进者亚家族转运蛋白PA14_55020转运体活性50个多药耐药样本的归一化表达值（以FPKM的形式）用于使用“Aracne“算法重建基因共表达网络[ 19 ]。Aracne计算成对的PA14_23520推定的MFS转运蛋白PA14_16410跨膜所有基因（这里，大约6500个基因）之间的表达相关性，使用PA 14_12300推定Mg2+和Co2+转运蛋白CorCPA 14_10340假定为Xin转运蛋白PA14_57990PA14_31010转运蛋白活性金属离子跨膜转运蛋白活性阳离子跨膜一种被称为“互信息”（MI）的相关性度量然后去除弱相关性，只留下生物学上有意义的相关性。有一种选择是将一系列标记物-转录因子或任何感兴趣的基因集PA14_20900推定MFS转运蛋白PA14_31040转运蛋白活性Eflux跨膜转运蛋白活性这些标记和其他基因被报道，因此得到的网络小得多，但更有意义。我们提供了68个与铜绿假单胞菌UCBPP抗生素耐药性PA14_57930跨膜PA14_26360转运蛋白活性从假单胞菌基因组数据库中到PA14[ 21 ]，TrkA运输细胞体积稳态- 钾离子转运PA14_11600可能的ABC转运蛋白将其导入Aracne，以获得耐药性相关的共表达网络使用p值的1 e-7截止值运行“Aracne“。我们从结果中删除了MI≤0.25的成对相关性，hsiC3金属离子结合- 泛喹啉-细胞色素-c还原酶活性- 线粒体电子传递，泛醇，细胞色素cPA14_58500组件氨基酸转运可视化药物抗性相关共表达网络 在“3. 结果PHOH家族蛋白PA14_46560pilBATP结合蛋白转运体活性3.1. 差异基因表达结果我们分别鉴定了67个和178个具有生物学意义的上调和下调基因（调整后的p值≤ 0.05，|logFC|≥1）使用“DeSeq2“程序（图 1a和b）。在查明的推定的铁ABC转运蛋白，通透酶蛋白11dP乳酸跨膜转运蛋白活性lapC蛋白转运体去调节基因，分别为13和57个上调和下调基因，具有未表征的分子功能（表S2中的粗体）。3.2. 基因富集分析结果我们鉴定了10个上调和16个下调的转运蛋白，merT汞离子跨膜活性转运蛋白活性样品（表1）。PhoH是上调的转运蛋白之一，其在抗微生物剂抗性Dickeya dadantii（一种植物病原体）分离株中的上调也已被指出[22]。我们还确定了pilQ蛋白转运体活性每个基因上的比对（映射）序列的（片段数）是随后确定使用[14]使用从“Ensemb 1“获得的铜绿假单胞菌PA1 4 GTF（基因转移格式）文件。然后将50个多药耐药和4个野生型应用调整后的p值0.05和|logFC|1个临界值，分别鉴定了统计学和生物学显著性上调和下调基因的列表。2.3. 基因和途径富集分析将上调和下调基因的列表分别引入“DAVID“[15]和“PANTHER“[16]程序，并确定去调控基因的分子功能和相关途径。2.4. 从已鉴定的去调控基因推断转录因子-靶基因调控网络所鉴定的去调节的转录因子的相应转录因子PA14_18090 、 PA14_23520 和 PA14_20900 的 下 调 ， 以 及 hitB 和PA14_11600的上调，都是MFS转运蛋白的成员--其通过质子动力提供能量3.3. 基因调控网络在构建的抗性状态下去调控基因的基因调控网络中鉴定了两种相干前馈环（FFL），包括anr-dnr- narX和anr-dnr-hemN（图2）。在连贯的FFl中，全局TF激活局部TF，并且两者都激活共享的靶基因。3.4. 基因共表达网络检测结果共表达网络的构建可以显著帮助预测已经未知的基因的功能。本文通过构建已知抗生素耐药生物标志物与其他基因的共表达网络，尝试引入新的潜在抗生素耐药生物标志物。在共表达网络中检测到四个高度连接 的 抗 性 生 物 标 记 物 ， 包 括 PA14_48300 、 mexB 、 PA14_12820 和PA14_33770，它们的大多数共表达配偶体不具有已知的功能（图3）A14_32830、PA14_03380和fpvA三个基因意外地显示与四个高度连接的抗性相关生物标记物共表达。N. Hosseinkhan等人医学信息学解锁22（2021）1005095图二. 转录因子（紫色）与上调（绿色）和下调（洋红色）基因之间的调控关系。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版图三. 采用“Aracene“算法构建了50份铜绿假单胞菌（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本4. 讨论下呼吸道感染中出现多重耐药革兰氏阴性菌（包括铜绿假单胞菌）是全球死亡率的主要原因之一[23]。新的多药耐药相关生物标志物可用作预测分子，有助于选择最合适的治疗策略，提高生存率[24]。此外，这些候选生物标志物可以被认为是新的药物靶标，其可能导致对抗抗生素耐药性的新药的开发[25]。本系统生物学研究分别检测了来自呼吸道不同部位的多药耐药铜绿假单胞菌中67个和178个上调和下调基因。我们没有找到类似的转录谱研究N. Hosseinkhan等人医学信息学解锁22（2021）1005096见图4。5个下调基因（洋红色）和4个已知耐药生物标志物（紫色）之间的共表达。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版与野生型菌株相比，多重耐药铜绿假单胞菌的改变用于验证鉴定的失调基因。本研究中大量功能尚不明确的去调控基因的功能鉴定将至少在一定程度上阐明假单胞菌多药耐药的分子机制。 铜绿。由于蛋白质组分析可以揭示不同生理条件下蛋白质丰度的变化，因此是细胞表型变化的更真实代表，我们进一步搜索了蛋白质组学研究，其中比较了多药耐药铜绿假单胞菌和野生型菌株的蛋白质组分析。虽然以前没有进行蛋白质组学研究来研究多药耐药铜绿假单胞菌的蛋白质组学改变，但我们发现很少有研究表明对单一药物（西罗沙星，妥布霉素）的和银化合物）一直是研究的主题[26此外，在所有这些研究中，研究了中等毒力铜绿假单胞菌PAO 1菌株的蛋白质组改变，由于SRP 034661数据集由高毒力铜绿假单胞菌PA 14分离株组成-具有多药耐药特性-，因此其结果与本研究不完全可比。然而，GroEL、PilQ和PhzM丰度的降低和PA14_04300丰度的增加证实了它们在我们的结果中分别下调和上调。在上调基因列表中存在10个膜转运蛋白，证实了转运蛋白在抗生素输出中的作用。然而，我们还确定了16个下调转运耐药样品。转运蛋白数量的减少是已知的有助于减少抗生素吸收的耐药机制之一。Delcour及其同事证明，外膜孔蛋白F（ompF）的下调与大肠杆菌中倍他内酰胺类药物和喹诺酮类药物吸收减少直接相关，进而导致多药耐药性的发展[31]。类似地，在对多种抗生素（包括诺氟沙星、四环素、头孢噻吩、头孢西丁和碳青霉烯类）具有抗性的大肠杆菌分离株中，已报告ompF表达降低[32，33]。我们发现SOS基因的一个成员dinP表达升高，这种反应有助于耐受DNA损伤。Cabot及其同事表明，环丙沙星的致突变作用导致DNA聚合酶dinP的过度表达[34]。类似地，最近的研究表明，响应于醌类化合物，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌和鼠疫耶尔森氏菌菌株中dinP的上调[35，36]。Qin及其同事还指出，图五. PA14_32830、PA14_03380和fpvA与四种已知耐药基因的同时共表达（黄色）。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本。暴露于环丙沙星后聚合酶增加，导致SOS反应启动。在氟喹诺酮类药物（如环丙沙星）存在下，氟喹诺酮类耐药基因的抑制剂lexA被降解，因此耐药基因的表达升高[37]。通过检查构建的去调控基因的调控网络，鉴定了2例相干前馈环（FFL），包括anr-dnr- narX和anr-dnr-hemN（图2）。这种FFL作为延迟元件工作，并防止细胞对周围环境中的瞬时变化做出快速反应。在铜绿假单胞菌的厌氧条件下，两种鉴定的FFL均与硝酸盐呼吸相关。Anr是无氧呼吸基因的转录因子。由于生物膜中的厌氧条件，铜绿假单胞菌能够使用硝酸盐和亚硝酸盐作为最终的电子受体[38]。因此，通过增加narX通过anr和dnr的表达，后者在这里被上调，铜绿假单胞菌逃避抗生素压力并在生物膜内存活。HemN（此处下调）是一种脱氢酶，负责在厌氧条件下粪卟啉原III转化为粪卟啉原IX。突变大肠杆菌（hemN缺失）对亚碲酸盐化合物具有高度抗性[39]。考虑到hemN的下调，尽管anr和dnr的激活作用，揭示了其他调节机制的可能作用，如基因组改变在hemN的减少N. Hosseinkhan等人医学信息学解锁22（2021）1005097表情如前所述，4种抗生素耐药性相关生物标志物（PA14_48300、mexB、PA14_12820和PA14_33770）的大多数共表达配偶体是功能未知的蛋白质（图4）。这些基因的功能特性可能会揭示更多的铜绿假单胞菌耐药的分子机制。PA14_32830、PA14_03380和fpvA与4种高度相关的抗性生物标志物同时共表达（图5）可能揭示它们参与抗性发展过程。PA14_32830和PA14_03380是功能未知的蛋白质。fpvA是一种siderofore受体，负责从周围环境中收集Fe离子。铁在铜绿假单胞菌妥布霉素和替加环素耐药性发展中的作用已得到证实[40]。总体而言，在本研究中，我们引入了铜绿假单胞菌的潜在抗生素耐药性相关生物标志物，在多重耐药样本中通过qRT-PCR确认后，可将其视为对抗多重耐药的新靶标。本研究的主要局限性之一是耐药组和野生型（抗生素敏感）组的样本数量之间的不平衡（50对仅4），这可能对结果产生重大影响。我们建议，为了证实所鉴定的生物标志物的基因表达改变，将使用更多的耐药和野生型铜绿假单胞菌分离株，以获得更可靠的结果。此外，众所周知，多种抗生素抗性基因在感染中比在实验室条件下具有更高的表达。因此，为了获得耐药状态下铜绿假单胞菌转录改变的真实估计，样品必须立即进行RNA提取和随后的测序。作者N.A. H设计了实验，进行了数据分析，并撰写了论文，A.A. A帮助将网络可视化，F.A. A帮助撰写了介绍。数据和材料数据见（SRA，NCBI，SRP 034661）。竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作附录A. 补充数据本 文 的 补 充 数 据 可 在 https ： //doi 网 站 上 找 到 。org/10.1016/j.imu.2020.100509。引用[1] Sadovskaya I等人，铜绿假单胞菌生物膜中的高水平抗生素耐药性：ndvB基因参与高度甘油磷酸化β-（1→3）-葡聚糖的产生，其结合氨基糖苷类。糖生物学2010;20（7）：895-904.[2] Tacconelli E，et al. 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