植物14-3-3基因提高转基因烟草耐旱和耐盐性的研究

© 2013由Elsevier B.V.发布。信息工程研究院负责评选和同行评议可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirectIERI Procedia 5（2013）102 - 1062013年农业与自然资源工程梨果实Pp 14 -3-3基因过表达提高转基因烟草的耐旱性和耐盐性李红丽，刘迪秋 *，何华，张楠楠，葛峰，陈昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500摘要干旱和盐碱是降低农业生产力的主要非生物胁迫。在植物中，14-3-3s参与防御反应的分子网络，在逆境条件下保护植物细胞免受伤害。本研究以CaMV 35 S启动子驱动的梨果实14-3-3基因转化烟草（Nicotiana tabacumL.）cvXanthi），Pp 14 -3-3的过表达提高了T1代转基因植株的耐旱性和耐盐性。在干旱和NaCl胁迫下，Pp 14 -3-3在T1代转基因烟草中大量表达。此外，与WT相比，T1转基因株系表现出更高的抗氧化活性，表现为丙二醛（MDA）含量降低和超氧阴离子产生速率减慢。此外，抗坏血酸过氧化物酶（APX）作为植物抗氧化系统的一个组成部分，在T1代转基因株系中的活性明显高于野生型。本研究的结果表明，Pp 14 -3-3可能参与减少干旱和盐胁迫引起的氧化损伤。© 2013作者。出版社：Elsevier B.V. 在CC BY-NC-ND许可下开放访问。信息工程研究院负责评选和同行评议关键词：14-3-3;砂梨;转基因烟草;耐旱性;耐盐性;氧化胁迫* 通讯作者。联系电话：+86（0）87165920621;传真：+86（0）87165920570。电子邮箱：diqiuliu@126.com。2212-6678 © 2013作者 由Elsevier B. V.在CC BY-NC-ND许可下开放获取。信息工程研究所负责的选择和同行评审doi：10.1016/j.ieri.2013.11.077Hongli Li等/ IERI Procedia 5（2013）1021031. 介绍随着世界人口的迅速增加，迫切需要提高农作物的产量，以满足日益扩大的粮食生产需求。然而，值得注意的是，作物经常遇到广泛的环境胁迫，如盐和干旱。植物已经进化出一系列复杂的机制来应对环境胁迫，包括参与胁迫识别、信息传递和一系列抗性相关基因激活的分子网络（Vinocur和Altman，2005）。抗性相关基因的表达调控导致植物发生各种生化和生理变化，如解毒酶的激活和活性氧（ROS）的清除（Foolad，2007）。许多研究表明，14-3-3s参与防御反应的分子网络，并在保护植物细胞免受不利环境条件下的损害中起作用（Chen et al.，2006; Denison等人，2011年）。植物14-3-3s的多基因家族在调节代谢、生长和细胞分裂、转录、细胞周期控制和胁迫反应中起重要作用，并且它们被证明与14-3-3的磷酸化靶蛋白相互作用，然后调节靶蛋白的功能（Denison et al.，2011年）。在盐、钾和铁缺乏的每种胁迫条件下，番茄（Solanum lycopersicum）14-3-3基因TFT 7的表达水平强烈增加（Xu和Shi，2006）。在胁迫条件下，14-3-3蛋白参与多种信号转导过程，已知与14-3- 3蛋白相互作用的靶标有质膜H+-ATPase、离子通道、ABA和抗坏血酸过氧化物酶（APX）。作为抗氧化系统的重要成员，APX在清除在胁迫期间引起植物细胞中氧化损伤的ROS中起作用，并且14-3-3同种型与APX的相互作用暗示了14-3-3在植物受到胁迫威胁时维持氧化还原稳态中的潜在作用（Lukaszewicz et al.，2002年）。火八里砂梨是云南特有的砂梨品种，对环境胁迫表现出较强的抗性。本研究从'火巴里'果实中分离到一个新的14-3-3基因Pp 14 -3-3（GenBank登录号JF 810599）此外，Pp 14 -3-3在'火芭梨'果实果皮中大量表达，提示Pp 14 -3-3在本研究构建了Pp 14 -3-3基因的植物过表达载体，并通过农杆菌介导法将其导入烟草中，分析了T1代转基因株系和非转基因株系在干旱和NaCl胁迫下的生长状况以及对氧化损伤的耐受性。2. 材料和方法2.1. 植物材料Nicotiana tabacumL.本研究以黄西（Xanthi）为转基因受体，以无菌苗为外植体进行遗传转化。2.2. Pp 14 -3-3过表达载体的构建及其遗传转化将Pp 14 -3 - 3的ORF从pMD-18 T-Pp 14 -3-3中克隆到pCAMBIA 2300 s载体中，经BamHI和EcoRI酶切，构建了植物表达载体pCAMBIA 2300 s-Pp 14 -3-3。通 过 转 化 筛 选 出 正确构建的Pp 14 -3-3表 达载体104Hongli Li等/ IERI Procedia 5（2013）102大肠杆菌感受态细胞和PCR。2.3. 烟草的遗传转化及阳性转基因株系助理电转化法获得含双元质粒pCAMBIA 2300 s-Pp 14 -3-3的根瘤菌LBA 4404，通过卡那霉素筛选和PCR筛选，获得了携带表达载体的克隆。烟草叶盘的遗传转化方法与Horsch等（2007）相同，然后从感染A.根瘤菌随后，在补充有卡那霉素的MS培养基平板中选择再生植株。最后，用Pp 14 -3-3基因特异引物对烟草基因组DNA进行PCR扩增，获得了阳性转基因烟草株系。2.4. 非生物处理将总共3个T1转基因株系与WT幼苗一起移植到填充有腐殖质和土壤的盆中，并在Phytotron中培养2周。然后将培养物置于温室中2周。在此期间，所有烟草植株每隔2天补充Hoagland营养液。通过隔水灌溉评价T1代转基因植株和野生型植株的耐旱性。当土壤含水量降至9%时，干旱胁迫处理持续7d。为了评估耐盐性，将所有烟草植物用500mM NaCl溶液小心地浇水7天。在干旱和NaCl胁迫处理后，观察转基因株系和WT的生长状况，收集幼叶并用于以下测定。2.5. 实时PCR利 用 Primer Premier 5 软 件 设 计 Pp 14 -3-3 的 特 异 性 引 物 ， 正 向 引 物 序 列 为 5 '-CGAGACAATCTGACACTCTGGACTTC-3'，反向引物序列为5'-ACCCACATGCCATCTATTACAAAGG-3'。烟草肌动蛋白基因（AB158612.1）被包括在实时PCR中作为内部对照。实时PCR的详细方案描述于Liu et al（2012）中。2.6. 胁迫条件下生理指标和APX活性的测定为了评估在NaCl和干旱胁迫下Pp 14 -3-3转基因株系和WT之间超氧阴离子产生速率的差异，使用Wang和Luo（1990）的改进方法。将约0.5g叶片用液氮研磨成粉末，然后加入1.5mL 50 mmol L-1磷酸钾缓冲液（pH7.0）并均质化。离心后获得上清液。孵育液中含上清液0.5mL，5 0 mmol L-1磷酸盐缓冲液（pH7.0）0.5mL，1 mmol L-1盐酸羟胺1 mL，2 5 ℃孵育1h。随后，加入17 mmol L-1对氨基苯磺酸1 mL和7 mmol L-1 α-萘胺1 mL。在25 °C下孵育并着色20分钟后，测量530 nm的吸光度。采用Wang和Luo（1990）中描述的方法建立标准曲线。采用Le Martret et al（2011）中提出的方法测定丙二醛（MDA）蓄积，并根据Nakano和Asada（1981）通过监测240 nm处吸光度的下降获得APX的酶活性。以MDA含量、超氧阴离子产生速率和APX活性为指标，用SPSS软件进行统计分析的统计差异Hongli Li等/ IERI Procedia 5（2013）102105通过Student’s t检验分析非转基因植物和T1转基因株系之间的差异3. 结果和讨论3.1. 转基因烟草阳性株系的获得与筛选本研究通过遗传转化获得了41个卡那霉素抗性烟草品系。对卡那霉素抗性植株进行PCR分析，筛选出阳性转化子。最后，共获得24个含有Pp 14 -3-3基因的转化株系，Pp 14 -3-3基因已整合到烟草基因组中，表明这24个转化株系均为阳性转化体。共选择3个T1转基因烟草品系3-5、3-7和3-10进行进一步研究。为了检测Pp 14 -3-3基因在正常和胁迫条件下是否表达，从幼叶中提取总RNA用于实时PCR分析。结果表明，Pp14 -3-3在正常和胁迫条件下均在转基因株系中高表达。干旱和NaCl胁迫对Pp 14 -3-3的转录水平有轻微的诱导作用。Pp 14 -3-3在T1代植株中表达量明显高于对照。3.2. 过量表达Pp 14 -3-3提高T1代转基因烟草的抗旱性和耐盐干旱胁迫处理后，WT植株出现明显的脱水和萎蔫，而T1转基因植株表现出轻微的脱水，但没有明显的萎蔫。在NaCl处理下，野生型植株明显黄化，植株生长受到严重抑制，而Pp 14 -3-3转基因植株没有表现出明显的退绿症状。显然，Pp 14 -3-3过表达的T1代转基因烟草表现出比WT更高的抗旱性和耐盐性。超氧阴离子（O2-）是自由基中活性最强的活性氧之一，它不仅能破坏生物分子，而且还能与膜内的其它自由基一起引起脂质过氧化反应，最终形成MDA。正常条件下，转基因烟草的超氧阴离子产生速率和MDA含量差异不显著，但在干旱和盐胁迫下，T1代转基因烟草的超氧阴离子产生速率和MDA含量均显著低于野生型烟草。类似地，有报道称番茄14-3-3基因TFT 7在拟南芥中过量表达，并且转基因株系表现出明显降低的H2O2和MDA生成（Xu and Shi，2007）。Pp 14 -3 - 3过表达烟草植株明显降低了干旱和NaCl引起的氧化损伤，并通过降低非生物胁迫下的MDA水平来保护膜。在非生物胁迫期间，14-3-3与APX的相互作用有助于保护植物细胞免受氧化胁迫（Zhang等人，1997; Lukaszewicz等人，2002年）。APX广泛存在于植物细胞的大多数腔室中，并作为酶活性氧清除剂发挥作用（Smirnoff，2005）。APX活性测定结果表明，在正常发育过程中，野生型和Pp 14 -3-3转基因烟草中APX活性没有显著差异。干旱和NaCl胁迫后，WT和转基因株系APX活性均升高，但3个T1代转基因株系APX活性的升高幅度明显高于非转基因株系。基于这些数据，毫无疑问，Pp 14 -3-3在烟草中的过表达通过这种机制上调APX活性以抑制ROS并增强对氧化应激的耐受性。损害本研究中，将Pp 14 -3-3基因在烟草中过表达，显著提高了烟草的耐旱性和耐盐性。可以肯定的是，Pp 14 -3-3基因参与了对干旱和盐胁迫的防御反应，并可用于开发新的耐旱和耐盐品种在未来。106Hongli Li等/ IERI Procedia 5（2013）102引用[1] Vinocur B，Altman A.植物抗逆工程研究进展：成就与局限，生物技术新观点，2005; 16：123-32。[2] Foolad MR.盐和干旱耐受性育种番茄的现状，2007; pp 669 -700。In：Jenks MA，HasegawaPM ， Mohan Jain S （ eds ） ， Advances in molecular breeding towards drought and salt tolerantcrops，Springer Press New York.[3] 陈峰，李勤，孙丽，等。水稻14-3-3基因家族及其对生物和非生物胁迫的响应。DNA Res，2006; 13：53-63.[4] 李文，李文，等.14 -3-3蛋白质在植物生理学中的应用。Semin Cell Dev，2011; 22：720-7.[5] 徐文芳，施文梅. 14-3-3基因家族在番茄幼根盐胁迫和钾铁缺乏中的表达谱：实时RT-PCR分析植物学年鉴，2006; 98：965-74。[6] Lukaszewicz M，Matysiak-Kata I，Aksamit A等14-3-3蛋白质对转基因马铃薯块茎抗氧化能力的调控。植物科学，2002; 163：125-30.[7] 霍施RB，弗莱JE，霍夫曼NL等。一种简单而通用的方法将基因导入植物。Science，1985;227：1229-31.[8] 刘东，何新，李伟，等。梨类奇异果蛋白基因的克隆及其在烟草中的表达增强了对病原真菌的抗性。植物细胞组织器官崇拜，2012; 111：29-39.[9] Wang AG，Luo GH.植物体内羟胺与超氧阴离子自由基反应的定量关系。植物生理学通讯，1990; 26：55-7.[10] 表达编码脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶的基因的烟草叶绿体转化体表现出改变的抗氧化剂代谢和改善的非生物胁迫耐受性。Plant Biotechnol J，2011; 9：661-73.[11] Nakano Y，Asada K.菠菜叶绿体中抗坏血酸特异性过氧化物酶能清除过氧化氢。植物细胞生理学，1981; 22：867-80.[12] 徐文芳，施文梅.组成型过量表达番茄14-3-3蛋白TFT 7的转基因拟南芥的耐盐机制植物土壤，2007; 301：17-28.[13] 张华，王军，吴晓，等.拟南芥抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达.植物分子生物学，1997;34：967-71.[14] 斯米尔诺夫河植物中的抗氧化剂和活性氧Blackwell Sci，Oxford，2005; pp293.