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斑马鱼早期生长发育受双酚AF影响的转录组学分析
环境科学与生态技术4(2020)100054原创研究双酚AF对斑马鱼早期生长发育影响的转录组学分析李荣珍a,b,1,刘帅c,1,邱文辉a,b,**,冯阳a,b,郑毅a,b,d,熊英a,b,李冠荣a,b,郑春苗a,b,*a南方科技大学环境科学与工程学院地表水-地下水污染综合控制国家环境保护重点实验室,深圳,518055b南方科技大学环境科学与工程学院土壤与地下水污染控制广东省重点实验室,深圳,518055c上海大学环境与化学工程学院,上海,200444d南方科技大学深圳市环境物联网技术工程实验室,广东省深圳市,518055A R T IC L EIN F O文章历史记录:接收日期:2020年5月8日接收日期:2020年2020年7月12日接受关键词:双酚AF斑马鱼早期发育氧化应激MAPK信号通路A B S T R A C T双酚AF(BPAF)是双酚A的替代品,广泛存在于水生环境中。由于对健康的关注,BPAF对生物体的毒性作用引起了人们的关注。本研究将组学技术与实验结果相结合,对BPAF的毒性进行评价。采用转录组测序(RNA-seq),我们获得了391,648,512,和545差异表达基因(DEG)在0.1,1,10,和100毫克/升BPAF暴露的斑马鱼幼虫,分别。 基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集揭示了BPAF对早期发育、刺激-反应和MAPK信号通路的显著影响。此外,使用蛋白质-蛋白质相互作用网络,5个枢纽基因(fgf 3,fgf 4,map 2k 1,myca和Casp 3b)被强调为MAPK信号通路中的关键基因。因此,RNA-seq结果表明,早期发育和刺激-反应是BPAF影响的主要过程,这与我们的形态学和病理学结果一致。 1和10 mg/LBPAF组斑马鱼胚胎孵化率均受到显著抑制,100 m g/L BPAF处理组斑马鱼胚胎总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化(LPO)等氧化应激指标均显著升高。此外,碱性磷酸酶(AKP)活性在所有BPAF暴露组中均显著降低。综上所述,环境相关浓度的双酚A F暴露通过调节MAPK信号通路影响斑马鱼幼鱼的早期发育和免疫系统,为进一步研究双酚的毒性提供了有力证据。©2020作者(S)。出版社:Elsevier B.V.代表中国环境科学学会这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。*通讯作者。南方科技大学环境科学与工程学院,地表水-地下水污染综合控制国家环境保护重点实验室,深圳,518055。**通讯作者。南方科技大学环境科学与工程学院,地表水-地下水污染综合控制国家环境保护重点实验室,深圳,518055。电子邮件地址:11611101@mail.sustech.edu.cn(R.Li),601543197@qq.com( S.Liu ) , qiuwh@sustech.edu.cn ( W.Qiu ) , yangfeng20082407@126.com( F.Yang ) , zhengy@sustech.edu.cn ( Y.Zheng ) , xiongy@sustech.edu.cn ( Y.熊),mail.sustech.edu.cn(G.Li),zhengcm@sustech.edu.cn(C. Zheng)。1、作者的贡献是平等的。1. 介绍双酚AF(BPAF)是双酚A(BPA)的替代品,在塑料生产中作为单体和交联剂有着广泛的应用[1],如聚碳酸酯共聚物、食品接触聚合物和电子材料。由于其在工业中的广泛应用,BPAF已成为一种新兴的环境污染物[2]。在嘉兴市化学品生产区附近的几种不同的环境基质中检测到BPAF,包括水,沉积物和土壤(灰尘)[3],河水中BPAF的最高浓度为15.3mg/L,中位浓度为https://doi.org/10.1016/j.ese.2020.1000542666-4984/©2020作者。由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院出版。这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表环境科学与生态技术期刊主页:www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.comR. Li,S. Liu,W. Qiu等人环境科学与生态技术4(2020)10005423.08毫克/升。此外,在辽河和太湖中也发现了BPAF,浓度分别为1.9ng/L和0.28 ng/L [4],两年后太湖中BPAF浓度增加到140 ng/L [2]。然而,很少有研究报道BPAF在其他浓度相对较低的国家的水环境中的存在,例如斯洛文尼亚和印度的废水中BPAF的最高浓度分别为49ng/L和1.1 ng/L[5,6]。此外,在乳制品(0.028 ng/g)和海产品(0.01 ng/g)中检测到BPAF [7]。明显地,在人类血液、母乳和尿液中,检测到的BPAF分别高达17 ng/L、56 ng/L和120 ng/L [8e11]。同时,在其他国家的人体体液中也发现了BPAF ,浓度为mg/L,如马来西亚和沙特阿拉伯[12,13]。此外,与BPA相比,BPAF对光降解和生物降解等处理过程更具抗性[14]。因此,与BPA相同,BPAF将普遍存在于环境中,由于其生物放大和生物累积潜力,可能对人类健康和生态系统构成显著风险[2]。BPAF可对早期生长发育造成不良影响,2 mg/L BPAF处理120h的胚胎/仔鱼全部死亡,成年斑马鱼暴露于BPAF后,子代存活率显著降低 [15,16]。此外,在BPAF暴露后观察到斑马鱼幼虫的发育畸形,包括心脏水肿、脊髓畸形和颅面畸形[17]。 作为BPA的替代品,BPAF也被报道会干扰生物体的内分泌系统。在先前对斑马鱼的研究中,已证明短期暴露于 BPAF 通过介导与下丘脑-垂体 -甲状腺(HPT)轴、甲状腺激素产生和甲状腺发育相关的基因表达水平诱导甲状腺内分泌紊乱,并且在雌性小鼠中也发现了类似的结果[18]。根据先前的研究,BPAF可以通过雌激素受体(ER a和/或ER b)作为激动剂或拮抗剂干扰生理过程,并且由于被疏水基团取代,BPAF的内分泌干扰活性比BPA更强(ER a强20倍,ERb强48倍)[19]。因此,在体内试验中,BPAF对水生生物的毒性比BPA更严重[20]。此外,BPAF通过抑制巨噬细胞的活力和T细胞的功能对免疫系统产生负面影响[21,22]。特别是,BPAF诱导对细胞毒性的实质性影响,包括升 高细胞内 活性氧(ROS ),增 强c-Myc 、G蛋白偶 联受体(GPER)和细胞周期蛋白D1的蛋白表达[23],以及改变核形态、细胞周期和细胞骨架扰动[24]。因此,许多研究已经证明BPAF具有多种毒性作用,这些毒性作用与BPA相同或不同,但其毒性作用机制尚不清楚,需要进一步研究。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一种高度保守的模块,由三种不同的MAPK组成:p38 MAPK、细胞外信号相关激酶(ERK)和Jun氨基末端激酶(JNK)[25]。MAPK信号通路在脊椎动物胚胎发生的发育、免疫应答和激素调节中起着至关重要的作用[26]。多篇文献报道BPA可通过MAPK信号通路调节神经元分化和炎症反应[27,28]。此外,BPAF暴露诱导的小鼠细胞骨架结构扰动和神经毒性通过MAPK信号通路的激活进行调节[29,30],BPAF还可以通过ERK-MAPK信号通路抑制人树突状细胞成熟,这可能会损害免疫反应[22]。然而,很少有研究探讨BPAF毒性与MAPK信号通路在硬骨鱼中的关系。全球转录组测序(RNA-Seq)是近年来发展起来的一项新技术,用于全面研究环境污染对生物的生态毒性机制。因此,我们使用生物信息学分析进行了RNA-Seq,包括聚类分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径分析,以首次表征BPAF对鱼类毒性的潜在机制。探讨了BPAF对斑马鱼幼鱼早期发育和应激反应的影响,并进一步研究了MAPK信号通路在这些不良反应中的作用。我们的研究结果提供了一个必要的了解,以确定在环境相关浓度的BPAF的环境和生态风险。2. 材料和方法2.1. 化学品和试剂BPAF(>98%,CAS 1478-61-1)和二甲亚砜(DMSO,>99%,CAS 67-68-5)由Aladdin(Shanghai,China)提供。通过将BPAF 粉末溶解在DMSO 中并 在4°C 下 静 置 来 获 得 储 备 溶 液 ( 10g/L)。在每个实验中制备新鲜的sto ck溶液。使用的其他化学品为分析级,并从Aladdin(中国上海)获得。2.2.斑马鱼养殖所有程序均由南方科技大学健康科学动物护理和使用委员会批准(JY2019067)。将成年AB品系野生型斑马鱼(Danio rerio)保持在28 ± 0.5 ℃的循环水养殖系统中,具有14:10 h的光-暗循环,并且每天两次用活卤虫喂养。在产卵前,两条雄性和两条雌性鱼在繁殖池中配对过夜,并在第二天早上收集在立体显微镜下检查的受精胚胎。如Qiu et al.[31]。将胚胎保存在光照培养箱内的供试品溶液中,光照周期为14:10 h,温度为28± 0.5℃。2.3.实验设计在受精后4小时(hpf)将斑马鱼胚胎混合,并随机分布在含有25mL暴露溶液的90 mm培养皿中,每个培养皿的浓度为50个斑马鱼胚胎。BPAF的暴露浓度设定为0.1、1、10和100mg/L。与BPAF暴露组 平 行 设 计 空 白 对 照 ( E3 ) 和 溶 剂 对 照 ( E3 中 的0.001%DMSO),每个处理组使用三个重复的50个胚胎每日更换总治疗溶液。此外,每天检查胚胎的死亡率和孵化状态。在立体显微镜下测量并记录斑马鱼幼虫的体长和畸形。在暴露120 h后,收集每个暴露组的斑马鱼幼体,然后储存在-80°C下进行RNA分离和生化分析。2.4.RNA分离、cDNA文库构建和测序在暴露于四种不同浓度的DMSO和BPAF后,使用TRIzol®试剂(Invitrogen,USA)从幼虫提取总RNA。 使用NanoDrop分光光度计和Agilent 2100生物分析仪(Thermo Fisher,MA,USA)对每个样品的RNA进行定性和定量。将三个重复合并为一个处理样品,并且将每组的两个独立处理用于RNA-Seq分析(n=2)。溢价R. Li,S. Liu,W. Qiu等人环境科学与生态技术4(2020)1000543选择RNA样品以用商业试剂盒(Mega Genomics,Beijing,China)构建cDNA文库,然后用BGISEQ 500平台(Shenzhen,China)进行配对末端读取测序。2.5.生物信息学分析在获得10个样品的原始数据后,使用Qiu等人的研究[32],然后获得斑马鱼幼虫中的所有表达使用先前的方法计算表达基因的每百万映射读段(FPKM)值的转录物的每个酶的片段[33]。使用DEGseq评估DMSO组和每个BPAF处理组之间的差异表达分析。基因与|log 2(倍数变化)|大于1且调整p值低于0.001的基因被筛选为显著差异表达基因(DEG)。分别使用R中的软件包ggplot2和pheatmap进行DEG的减加(MA)图和层次聚类分析。然后分析四个DEG数据集的维恩图。在细胞、组织和生物体水平上对营养物质、药理化合物和内分泌干扰化学品产生的剂量反应为研究人员和风险评估人员提供了重要信息[34]。采用R软件包Mfuzz对四个BPAF处理组和DMSO组中的样品进行噪声稳健的软聚类根据基因表达在5个不同剂量点的变化,基因被聚类为12个不同的组。选择具有上调和下调基因的两个簇,并使用Cytoscape软件中的BiNGO插件进行这些基因的基因富集分析[35]。使用R中的phyper函数识别不同生物过程中的基因本体(GO)术语和两个簇和DEG的显著富集的KEGG途径此外,基于阈值,认为基因集显著富集(p0.05,错误发现率[FDR] 0.01)。<<丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络是从STRING数据库中进行的,并使用我们先前研究中描述的方法通过Cytoscape 3.6.1进行可视化[32]。插件cytoHubba[36]使用Cytoscape中的方法来鉴定关键的枢纽基因,PPI网络由五种算法组成:最大团中心性(MCC)、最大邻域分量密度(DMNC)、边缘渗透分量(EPC)、贴近度和度。2.6.定量实时PCR(qRT-PCR)分析从DMSO和4个BPAF暴露组中分离的总RNA样品用于qRT-PCR以检测靶基因的mRNA水平按照QuantScript RT Kits(TiangenBio,Beijing,China)的方案合成每个样品的cDNA(lmg)由MYC原癌基因、bHLH转录因子a成纤维细胞生长因子3半胱天冬酶3,骨化相关半胱氨酸肽酶b(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3b),丝裂原 活 化 蛋 白 激 酶 激 酶 1 ( map2k1 ) 和 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 4(fgf4),以及11个随机选择的基因,包括生长因子受体结合蛋白2b(grb2b),丝裂原活化蛋白激酶12a(mapk12a),抑制蛋白,β 2a tek酪氨酸激酶,内皮细胞,肿瘤蛋白p53集落刺激因子1受体,b成纤维细胞生长因子10a fgf10a,fms相关受体酪氨酸激酶4表皮生长因子受体样(EGFR)(LOC 571431),血管内皮生长因子Ab(vegfab)和MYC原癌基因bHLH转录因子b(mycb)在PPI网络中的表达通过qRT-PCR验证。将20-mL体积中的qRT-PCR反应混合物稀释至100 mL。使 用 FastStart Universal SYBR Green Master 试 剂 盒 ( Roche ,Switzerland)进行,并通过CFX Connect实时PCR检测系统(Bio-Rad,USA)监测采用2e△△Ct法相对于参考基因核糖体蛋白蛋白L13A(rpl13a)[37]。在所有实验中进行三次生物学重复使用Primer Premier 6.0设计rpl13a和所选基因的引物序列(表S1)。2.7.氧化应激指标及免疫相关参数检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和脂质过氧化(LPO)水平分别通过水溶性四唑盐-1(WST-1)、2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)(ABTS )和硫代巴比妥酸(TBA)法(南京建成生物工程研究所,中国)在120 hpf下进行评价脂质过氧化物(LPO),氧化指标,测定丙二醛(MDA)水平。采用磷酸苯二钠-4-氨基安替比林-铁氰化钾法测定斑马鱼幼鱼的碱性磷酸酶(AKP)活性,以探讨BPAF对斑马鱼幼鱼免疫功能的调节作用使用从南京建成生物工程研究所(中国)获得的试剂盒和荧光酶标仪(Thermo Fisher Scienti fic,USA)检测AKP活性。2.8.统计分析数据用SPSS Statistics 22(USA)进行分析,并在本研究中以平均值±标准差(SD)采用单因素方差分析(ANOVA)和最小显著性差异(LSD)检验评价组间差异。DMSO和BPAF给药组之间的显著差异以图表形式显示(*,p<0.05)。该图由Cyto- scape 3.6.1和OriginPro9.1(美国)绘制。3. 结果3.1. BPAF对斑马鱼幼鱼发育、形态、氧化应激和非特异性免疫反应用不同浓度的BPAF(0.1、1、10和100 mg/L)处理斑马鱼胚胎,以测试BPAF对鱼类发育的影响。暴露于环境相关浓度(1和10mg/L)的BPAF后,斑马鱼胚胎的孵化率显著降低(图1a)。而BPAF 暴露的斑马鱼幼虫的体长与 DMSO 组没有显著差异(图11)。1 b)。此外,畸形数量为1.67 10和100 mg/L BPAF处理组分别为0.00 ± 0.58和2.33 ± 0.58,而DMSO组为0.00 ±0.00,无显著差异;斑马鱼幼虫主要表现为心包水肿、脊柱侧凸和尾部畸形(图1)。 1 c)。BPAF暴露组斑马鱼仔鱼的T-AOC和SOD活性均升高,100mg/LBPAF组的T-AOC和SOD活性显著升高(图11)。 1 d和e,以及表S2)。此外,在100mg/L BPAF处理组中,MDA水平显著诱导(图1)。在所有BPAF暴露组中,AKP活性均显著降低(图1 g和表S2)。3.2.BPAF对斑马鱼幼鱼转录组的影响我们分别获得了1.391亿、1.411亿、1.324亿、1.406亿和1.381亿分别来自0.1、1、10、100mg/L BPAF和DMSO组的清晰读数。各样品的Q20值均在97.8%以上,10个样品的映射率在77.20%~ 78.62%之间Fig. 1. 图1(a)BPAF对斑马鱼胚胎孵化率的影响;(b)BPAF对斑马鱼幼体体长的影响;(c)体视显微镜下测量的斑马鱼幼体在10m g/L BPAF(左)和100 m g/L BPAF(右)中的畸形情况。L BPAF(右);(d eg)BPAF暴露120 h后斑马鱼仔鱼总抗氧化能力(T-AOC,d)、超氧化物歧化酶(SOD,e)、丙二醛(MDA,f)和碱性磷酸酶(AKP,g)的变化。通过LSD检验确定统计学显著<性,* p 0. 05。R. Li,S. Liu,W. Qiu等人环境科学与生态技术4(2020)1000544R. Li,S. Liu,W. Qiu等人环境科学与生态技术4(2020)1000545(表S3)。然后,分析每个比较中的DEG,MA图(图2)显示了四个BPAF处理组和DMSO组之间391例(227例上调,164例下调),648例(360例上调,在暴露于0.1、1、10和100mg/L BPAF后,分别在斑马鱼幼虫中获得了512(230上调和282下调)和545(262上调和283下调)DEG(图3a)。此外,图3beee显示了四个BPAF处理组中每个DEG组的分层聚类结果,并且在不同BPAF浓度下获得了相似的表达模式。3.3.聚类分析和关键功能在上述获得的所有DEG数据集中,我们进一步研究了这四种不同浓度的BPAF如何影响同一组基因,并根据维恩图获得了68个共同的DEG(图1)。 4 a和表S4)。对这68个常见DEG进行GO富集分析,得到9个显著富集的GO术语(图4 b),包括胚胎发育(胚胎发育以出生或卵孵化为终点、胚胎模式特异化和胚胎发育的负调控等)。刺激反应(stimulus response)内源性刺激、对热的反应和对生长因子的反应等)。为了探索BPAF对斑马鱼仔鱼的剂量效应,进一步对所有表达基因进行聚类分析。 如图图4 c中,通过聚类分析得到了BPAF暴露组和DMSO组的两种相似的表达模式,包括1613个基因的剂量反应上调(聚类1,左)和2488个基因的剂量反应下调(聚类2,右)。进一步鉴定了两个簇的GO功能,簇1中的主要网络是胚胎发育,对刺激的反应,细胞成分组织和细胞代谢过程(图4 d)。对于第2类,胚胎发育、对刺激的反应、信号转导的调节和细胞代谢过程的调节是主要的功能网络(图11)。 4 e)。此外,利用这两个基因簇获得了8个显著富集的GO术语,有趣的是,这8个GO术语也分为两个主要部分(图4f),包括胚胎发育(胚胎器官发育、胚胎造血和胚胎模式特异化等)。和刺激-反应(对有机磷的反应、对食物的反应和对含嘌呤化合物的反应等),与68个共同基因的GO词相似。图2. 图2与DMSO组相比,0.1 mg/L(a)、1 mg/L(b)、10 mg/L(c)和100 mg/L(d)双酚AF(BPAF)暴露组中差异表达基因(DEG)的负加(MA)图。在MA图中,红色和蓝色点分别代表上调和下调DEG,灰色点代表非显著变化的Y轴和X轴分别是所有基因的log2倍数变化和log2FPKMR. Li,S. Liu,W. Qiu等人环境科学与生态技术4(2020)1000546¼¼图3. 图 3 ( a ) 四 个 B P A F 暴 露 组 中 D E G 相 对 于 D M S O 组 的 分 布 ; ( b e e ) 根 据 其 他 三 个 处 理 组 中 的 基 因 表 达 水 平 , 从 0 . 1 m g / L ( b ) 、 1 m g / L ( c ) 、 1 0m g / L ( d ) 和 1 0 0 m g / L ( e ) 的 四 个 B P A F 组 获 得 的 每 个 D E G 的 基 因 表 达 模 式 的 分 层 聚 类 分 析 。 代码上从红色(上调)到绿色(下调)的颜色表示与DMSO组相比,BPAF处理组中的表达变化(log2倍数变化)。3.4.识别与BPAF治疗为了进一步研究这两个基因簇的功能,剂量-反应分析,采用KEGG途径分析,并且MAPK信号传导途径(包括126个基因)高度富集(p0.0001,adjp0.0095)(图5a和表S5)。探讨这126个基因在MAPK信号通路图第四章 图4(a)与DMSO组相比,四个BPAF处理组之间所有获得的DEG的维恩图;(b)68个常见DEG的基因本体(GO)富集分析。Y轴表示GO项,X轴表示每个项中候选基因在总基因中的比例,圆圈大小表示DEG的数量,较深的颜色表示较低的p值;(c)与DMSO组相比,四个BPAF暴露组中上调和下调基因的剂量反应;(d和e)上调基因(d)和下调基因(e)的生物网络中的GO富集分析节点代表GO术语,颜色表示显著富集的GO术语(p0.05),节点大小表示每个GO术语中的基因数量;(f)剂量反应基因的GO富集分析。
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