工程7（2021）1293研究中药-文章临床与动物实验一体化平台基于茵陈蒿汤治疗黄疸综合征熊辉a，#，张爱华a，#，郭亚静a，周晓航a，孙辉a，杨乐a，方恒a，严广丽a，王喜军a，b，c，a黑龙江中医药大学药物分析系国家中医药研究中心b澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室，中国澳门999078c西南濒危药材开发国家工程实验室，广西药用植物园，南宁530023阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2020年10月12日修订2020年12月29日接受2021年3月4日网上发售保留字：疗效生物活性化合物小分子靶标中药代谢组学A B S T R A C T中药方剂具有成分复杂、作用靶点多等特点，其生物活性成分的测定极具挑战性。茵陈蒿汤在临床上被广泛应用于黄疸病的治疗虽然已有许多研究对益气活血汤的疗效和有效成分进行了研究，但对其有效成分、作用机制和潜在靶点，尤其是对临床患者的研究尚缺乏深入本研究建立了一个基于临床和动物实验平台的创新策略，以发现YCHT的潜在靶点和活性化合物。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-ToF-MS）代谢组学结合血清药物化学方法，研究YCHT在小鼠体内的血清代谢特征及主要成分。此外，构建了化合物-靶点-通路网络，并通过网络药理学和独创性通路分析（IPA）进行了分析。我们发现八个活性成分可以调节五个关键靶点。酶联免疫吸附试验（ELISA）进一步验证了这些关键靶点，表明YCHT具有治疗作用。通过靶向胆固醇7α-羟化酶（CYP 7A 1）、多药耐药相关蛋白2多药耐药相关蛋白3（ABCC3）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）和法尼醇X受体（FXR），并通过调节代谢途径，包括初级胆汁酸生物合成、卟啉和叶绿素代谢以及胆汁分泌。发现了8个主要的有效化合物，并与关键靶点和途径进行了关联。通过这种方式，我们证明了这种综合策略可以成功地应用于有效发现草药处方的活性化合物和治疗靶点©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍由于中医学和人类疾病的复杂性，目前还没有有效的模式来揭示中药成分与功效之间的关系*通讯作者。电子邮件地址：xijunw@sina.com（X.- J. Wang）。#这些作者对这项工作做出了同样的处方与传统方法中的一对一分离相比，血清药物化学是阐明草药处方体内化合物的有力工具，因为只有从血液中提取的成分才有可能成为潜在的药用物质[1]。网络药理学被认为是一种有效的技术，为彻底了解的完整性和系统性的草药处方。其核心思想是阐明活性化合物、分子靶点和疾病特征之间的生物学语言。https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.12.0162095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engH. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931294网络药理学甚至可以与组学技术相结合，以提高未知和已知靶标识别的准确性[2]。代谢组学作为一种先进的系统生物学方法，主要用于研究生物系统中受干扰的生物标志物和生物学途径，特别是用于表征生物体的生化表型。因此，代谢组学对新药开发具有巨大的影响潜力[3]。血清药物化学、代谢组学和网络药理学的综合网络分析可以将活性化合物和靶点与内源性代谢产物联系起来，有利于活性化合物有益作用的整体靶点识别[4]。胆汁淤积性黄疸是指由于肝内外胆管梗阻或肝细胞受损而导致胆汁酸异常蓄积而引起的临床疾病，主要表现为黄疸[5]。茵陈蒿汤是东汉张仲景《伤寒论》中首次记载的治疗胆汁淤积性黄疸的经典方剂，由大黄 、 茵 陈 、 茵 陈 组 成 。 (YC) 和 栀 子 （ Gardenia jasminoidesEllis（ZZ））。 大量临床和动物研究表明，YCHT具有多种功能，包括利胆去黄、治疗肝损伤、治疗肝纤维化、抗炎活性、胰腺保护和抗肿瘤活性[6，7]。虽然YCHT治疗胆汁淤积性黄疸的动物和临床疗效已被广泛认可，并确定为无但由于中药的复杂性和多样性，存在着明显的毒副作用等问题，阻碍了对其有效成分和保肝作用机制的深入研究YCHT的潜在活性分子、核心靶点和作用机制尚未系统阐明，这极大地限制了新活性化合物的发现。本研究基于血清药物化学、代谢组学、网络分析和实验验证，建立了一种新的、具有广泛应用潜力的策略，系统地解读草药处方的活性成分和核心目标。研究设计的详细概述见图1。首先，我们招募了226名人类受试者和60只小鼠，以揭示疾病生物标志物并评估通过非靶向代谢组学分析，从临床和动物两个方面评估配方的功效。第二，通过血清药物化学方法发现YCHT的体内活性成分，并通过网络分析（包括文本挖 掘 、 MetaboAnalyst 途 径 分 析 （ MetPA ） 和 独 创 性 途 径 分 析（IPA））确定其潜在靶点。鉴于小鼠和人类生物学过程之间的强烈相似性，进一步分析了临床和动物数据，以发现活性化合物，核心生物标志物和药物靶标。最后，对关键靶点进行了实验验证，以证明当前策略的潜力。 这种方法可能有助于阐明生物活性化合物和发现草药处方中的新兴治疗靶点。Fig. 1.血清药物化学、代谢组学与网络药理学整合策略。ROC：接收机工作特性;国际音标：独创性路径分析; UGT 1A1：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A 1; CYP 7A 1：胆固醇7α-羟化酶; FXR：法尼醇X受体; ABCC：多药耐药相关蛋白; TCMSP：中药系统药理学数据库和分析平台。疾病基因搜索引擎证据句子（DigSee）、基因卡片和治疗靶点数据库（TTD）是数据库。H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931295···×2. 实验2.1. 药物和试剂所有原料药均购自中国哈尔滨同仁堂药店。YCHT由ZZ、YC和DH组成。α-异硫氰酸萘酯（ANIT）由Sigma-Aldrich（USA）提供。乙醇和橄榄油购自Sinopharm Chemi- cal Reagent Beijing Co.，有限公司 （ 中 国 ） 。 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 2 （ ABCC 2 ） 、 法 尼 醇 X 受 体（FXR）、胆固醇7α-羟化酶（CYP 7A 1）、多药耐药相关蛋白3（ABCC 3）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A 1（UGT 1A 1）的检测试剂盒购自Jing-mei Biotechnology Co. Ltd.（中国）。直接胆红素（DBIL）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和天冬氨酸转氨酶（AST）的测定试剂盒购自BioSino Bio-Technology Science Inc.。（中国）。总胆汁酸（TBA）、c-谷氨酰转肽酶（c-GT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）等试剂盒由南京建成生物技术研究所提供。2.2. 动物和治疗SPF级雄性Balb/c小鼠（体重（20± 2）g），由上海斯莱克实验动物有限公司提供，公司（中国）。将60只动物分为两类，包括包含对照组和黄疸组的数据集1和包含对照组、黄疸组和YCHT组的数据集2，每组12只小鼠黄疸模型复制如下：黄连组和YCHT组上午灌胃黄连提取液（蒸馏水提取，制成浓度为0.013g mL-1的口服液），下午灌胃乙醇（12.5%（v/v），溶于蒸馏水），第15、16天，黄疸组和益气活血汤组分别灌胃不同浓度的ANIT溶液（1.5、1.0mg·mL-1，橄榄油溶解），每10 g体重灌胃0.1mL，每日1次。对照组每天灌胃蒸馏水0.1 mL/10 g体重在第17天，YCHT组成员经口灌胃给予YCHT溶液（5 g mL-1，10 mg/1 kg体重，溶于蒸馏水）7天，而对照组经口灌胃给予蒸馏水（0.1 mL/10 g体重）[8]。所有实验程序均经黑龙江中医药大学动物伦理委员会批准，实验按照赫尔辛基宣言的原则进行。2.3. 患者和治疗在2016年至2018年期间，共入组了来自黑龙江中医药大学第一附属医院的106例黄疸患者和120例健康受试者。病例纳入标准如下：具有血清TBIL水平约171lmol·L-1的典型特征的患者;临床诊断的皮肤组织黄染;以及血清ALP、c-GT和DBIL水平升高的患者被纳入研究。正在怀孕或母乳喂养的受试者，参与其他药物试验，影响疗效和安全性判断，显示肾脏或造血系统中的严重原发性YCHT由黑龙江大学第一附属医院包装中国医学。YCHT治疗的患者被分配服用YCHT（每包100 mL）口服，每天两次，连续15天。受试者被分为两个队列，包含数据集1，包括120名健康参与者和72名黄疸患者数据集2包括120名健康参与者，72名黄疸患者和34名YCHT治疗患者。所有患者在研究开始前均签署了书面知情同意书，并经黑龙江中医药大学伦理委员会批准。2.4. 样品采集和制备通过摘取小鼠的眼球收集小鼠血液样品，而从静脉收集人血清样品，并立即将血液样品在4 °C下以3000转/分钟（rpm）离心15分钟。收集上清液血液样品并储存在-80°C下，分析[9]。将600L甲醇和200L解冻的将血清涡旋30秒并离心（13000 rpm，4 ℃）5分钟。注射2微升上清液用于代谢组学分析。在人体成分分析中，2mL血清和40L磷酸的混 合 物 经 超 声 和 涡 旋 程 序 后分配到预活化和预平衡的固相萃取（SPE）柱。用1 mL水和2 mL 100%甲醇洗脱柱，并将100%甲醇洗脱液在氮气流下在45 ℃下干燥。将残留物重新溶解于0.15 mL100%甲醇中，并在4 ℃下以13 000 rpm离心15 min。注入5微升上清液用于成分分析。用于小鼠中的成分分析的方法与用于上述人的方法一致。2.5. 组织学和生化检测根据试剂盒说明定量测定FXR、ABCC 3和GSH-Px。取血后，用苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下进行组织病理学观察。2.6. 非靶向代谢组学分析使用配备四极杆飞行时间质谱（Q-ToF-MS; Waters，USA）的超高效液相色谱（UPLC）系统进行血清样品检测和分析。分别在ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 lm）和 ACQUITY UPLC HSS C18 色 谱 柱 （ 100 mm × 2.1 mm ，1.8lm）（Waters，USA）上分离小鼠和人血清样品。 代谢组学分析参数，包括色谱条件（如柱温和流速、梯度洗脱程序和进样体积）以及MS条件（如源和去溶剂温度、样品锥孔电压和毛细管电压）（如附录A表S1-S3所示用于小鼠和人样品分析的柱温分别设定为40和45°C，并且两种注射体积均为中等。在2L下测定。2.7. 代谢物鉴定和代谢途径分析用于代谢物鉴别的程序与先前研究中报告的程序一致[9]。显著H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931296·通过多变量统计方法，使用精确的分子量、分子式（同位素拟合模式（i-FIT）值接近于零，小于百万分之5（ppm）偏差的范围为了绘制来自黄疸相关研究的鉴定的代谢物的最相关途径，生成基于富集分析的代谢途径的可视化并通过MetPA进行注释。2.8. YCHT血清成分分析在ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱上分离血样，流速为0.4mL min-1，柱温为45 °C。其他UPLC和MS参数见附录A[9]中的表S4 和 S5 。数 据由 Progenesis QI 软件结 合元素组成 工具模块和MS/MS碎片信息进行处理，用于鉴定血清成分。2.9. 小分子首先，我们将潜在的有效成分引入传统中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）、SwissTargetPrediction和SuperPred数据库，以便根据所获得的来自YCHT的候选血清成分手动搜索分子靶标。然后从各种数据库中检索与胆汁淤积性黄疸疾病相关的潜在靶点，如在线人类孟德尔遗传（OMIM）、治疗靶点数据库（TTD）和GeneCards[10，11]。在此过程中，通过筛选去除了与黄疸无关的重复和假阳性结果数据挖掘。认为与活性成分和黄疸疾病相关的共同靶标是功能分子。结果，使用Cytoscape构建了一个完整的3.0.为了便于合理解释所鉴定的参与生物过程的功能靶标、分子功能和细胞组分，借助于邻近基因重复实例搜索工具（STRING）数据库进行基因本体（GO）富集分析和KEGG途径富集分析。应用综合代谢组学数据分析平台MetaboAnalyst 3.0和IPA丰富已识别生物标志物的代谢途径（P0.05），并分析各种小分子（包括生物标志物、蛋白质和基因）的相互作用网络。富集途径结合网络药理学和血清药物化学，深入捕捉活性化合物调控的核心靶点和代谢途径的生物网络，构建2.10. 数据分析通过统计产品和服务解决方案（SPSS）软件（IBM，USA）分析数据，并报告为平均值±标准差（SD）。使用Student t检验分析两组之间的差异P值小于0.05被认为具有统计学显著性。3. 结果3.1. 人类和小鼠样本的组织学和生化分析数据集1中黄疸患者的基线生化和人口统计学数据见表S6和图。附录A中的S1（a）。前白蛋白（PA）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）和总蛋白（TP）水平在两组之间无显著差异，而ALP、ALT、AST、TBIL、DBIL、胆碱酯酶（CHE）、c-GT和间接胆红素（IBIL）与胆汁淤积性黄疸显著相关（P <0.01）。数据集2包含120例健康受试者、72例患者和34例YCHT治疗患者。黄疸组的ALT、AST、TBIL、DBIL和IBIL水平呈显著下降趋势（P< 0.01或P< 0.05），经YCHT治疗后，观察到皮肤组织黄染部分缓解。在建立胆汁淤积性黄疸小鼠时观察到非常一致的结果黄疸组血清AST、DBIL、TBIL、ALP、ALT、c-GT、TBA含量较对照组明显升高（P0.01<或P0.05<），T-SOD含量较对照组明显降低（P0.05<）。在肝组织中，MDA含量未显著上调，GSH-Px含量显著下调（P0.01;附录A）。病理组织学结果显示，模型组肝细胞高度水肿，肝小叶结构紊乱，正常细胞被炎性细胞浸润，见附录A图S1与模型组比较，益气活血汤组肝组织坏死面积和水肿程度明显减轻，肝小叶、肝板、肝窦、小叶中央静脉、胆管等肝组织如图所示，YCHT组偶见少量炎性细胞分布。 S1（c）。这些结果证实，使用YCHT导致显着改善治疗胆汁淤积性黄疸。3.2. 轨迹和代谢特征分析EZinfo 软 件 通 常 用 于 对 血 清 数 据 进 行 无 监 督 主 成 分 分 析（PCA），以获得关于各组代谢轨迹的直观聚类信息从小鼠和人的二维（2D）PCA和三维（3D）PCA评分图中，观察到黄疸组和对照组之间代谢谱的明显分离，如图所示。 2，这通过附录A中图S2所示的基峰强度（BPI）血清色谱图证实。为了进一步评价养胆汤的疗效，我们着重对PCA评分图进行分析，发现无论动物还是人，经养胆汤干预后黄疸组均出现明显的逆转趋势，表明养胆汤能恢复黄疸病的病理进程，如图所示。 S3在Appen-100 A。3.3. 代谢物鉴定和代谢途径分析为了发现导致两组之间差异的潜在血清生物标志物，我们使用与多变量数据分析集成的UPLC-Q-ToF-MS来解读电喷雾电离（ESI+）中的正离子模式和电喷雾电离（ESI -）中的负离子模式潜在结构判别分析（OPLS-DA）的正交投影对投影（VIP）值的可变影响（>1.0）和基于Student t检验的生物标志物的概率值（P 0.05）H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931297图二. 小鼠和人类非靶向血清代谢组学的多变量分析。(a)–(d) The 2D and 3D PCA score plots of all the analysis data in mice were carried PC：主成分。选择用于筛选潜在变量。在所有变量中，我们最终表征了12种生物标志物，包括分别来自小鼠中ESI+和ESI人（附录A中的表S9），基于可用数据库和MS/MS片段信息。同时制作了所鉴定的生物标志物的相对强度的散点图和聚类热图，以便直观地解释YCHT如何影响代谢变化，H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931298确定重要的回调生物标志物，如图1A和1B所示。3和4为了检查所鉴定的代谢物的分类能力，我们利用这些代谢物作为来自60个临床样本的代谢谱分析的基础，这些样本是在我们不知道所选样本是来自黄疸患者还是健康受试者的前提下从192名受试者中随机选择的。结果，数据集被分为两个聚类，其中32个样本被安排在第1组，28个样本被安排在第2组。通过观察两组中每个样本的信息，发现组1和组2中的样本分别是健康组和黄疸组的受试者。在此基础上，我们初步验证了筛选标记的适用性，如附录A所示。为了减少用于临床诊断和功能分析应用的代谢物的数量，我们根据代谢物的曲线下面积（AUC ）值大于0.9 的受试者工作特征（ROC）曲线的筛选原则，对人类患者中的14种生物标志物和小鼠中的12种血清生物标志物进行了指数降低作为评价模型使用人或小鼠受试者的AUC值顺序，将牛磺胆酸、胆红素葡糖苷酸、胆红素和胆绿素确定为临床黄疸患者的潜在生物标志物（附录A中的表S10和图S5（a）），并将磷脂酰胆碱（PC）（16：0/16：0）、胆红素、磺基乙醇石胆酸盐（2被认为是黄疸小鼠的潜在生物标志物（表S11和图附录A第S5（b）条）。巧合的是，在所有这些代谢物中，有三种常见的标记物，即胆红素、胆绿素和牛磺胆酸，在人类患者和小鼠样本中均被发现。通过聚焦于基于MetPA的临床核心生物标志物包括胆红素、胆绿素、胆红素葡萄糖醛酸苷和牛磺胆酸的通路拓扑分析，我们发现它们主要涉及卟啉和叶绿素代谢以及初级胆汁酸生物合成。然后使用KEGG途径数据库进一步构建代谢途径和生物标志物之间的相关网络，用于下一个核心靶点分析，如图所示。 五、3.4. 潜在目标为了进一步挖掘黄疸病功能变化的潜在机制，开发了IPA组学平台。在IPA对疾病、典型途径以及黄疸小鼠和患者的功能变化的帮助下（附录A中的表S12和S13），我们鉴定了选定的代谢物。其中，牛磺胆酸、胆酸、胆红素葡萄糖醛酸苷、胆红素和胆绿素参与胆汁淤积与胆汁酸生物合成、血红素降解、白细胞介素（IL）-10信号转导和FXR/类维生素A X受体（RXR）激活的关系，并构建血清生物标志物预测网络。根据经典途径和相互作用网络分析，图三.血清代谢物通过来自人类的数据集1进一步验证。(a)健康参与者、黄疸患者和YCHT治疗之间鉴定的生物标志物的相对强度的散点图;（b）健康参与者、黄疸患者和YCHT治疗患者之间血清代谢物的热图。结果表示为平均值± SD。*P 0.05和**P0.01 vs健康组;#P 0.05和##P0.01 vs黄疸组。S1 P：1-磷酸鞘氨醇; PC：磷脂酰胆碱; TG：甘油三酯。H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931299见图4。通过小鼠数据集1进一步验证血清代谢物。(a)对照组、黄疸组和YCHT组之间鉴定的生物标志物的相对强度的散点图;（b）来自对照组、黄疸组和YCHT组的血清代谢物的热图。结果表示为平均值± SD。*P 0.05和 **P 0.01 vs对照组;#P 0.05和##P0.01 vs黄疸组。PA：磷脂酸。（图2）附录A中的S6和S7），我们发现含有UGT 1A1、ABCC 3等的下游蛋白质与血红素降解相关的胆红素有关系。下游ABCC 3、FXR等和上游蛋白质如CYP 7A 1等与牛磺胆酸有关，参与初级胆汁酸生物合成和FXR/RXR活化。YCHT治疗后，FXR、ABCC 3和UGT1A1的激活以及CYP7A1的抑制表明这三种途径在调节胆汁酸平衡中起关键作用（图1A和1B）。附录A中的S8和S9）。从代谢组学分析的角度，可以推断药效代谢物的富集途径包括与黄疸生物标志物相同的典型途径。 IPA表明YCHT调节初级胆汁酸生物合成、血红素降解和FXR/RXR途径，以预防小鼠和人黄疸病的进展。3.5. YCHT血清成分分析使用PCA和OPLS-DA的多变量模式识别分析通过Progenesis QI软件筛选变量（图6）。在所有变量中，模型组中不存在但给药组中存在的离子被视为潜在的血液成分。根据YCHT的既往成分分析，在人血液中初步鉴定了共26种原型成分和3种代谢物，在小鼠中初步鉴定了33种原型成分和3种代谢物（附录A）。3.6. 网络药理学网络药理学和血清药物化学的结合策略为共同靶点提供了新的见解黄疸病和血清成分来自YCHT。通过数据库检索，从血清组分相关靶标和黄疸病相关靶标中鉴定出小鼠和人类中总共79个共同靶标为了说明YCHT的潜在药理作用及其常见靶标的关键作用我们提取了共同的目标，并将它们引入到一个字符串数据库搜索和转换操作的GO和KEGG途径富集分析，这是排序区分差异，根据降序使用在线绘图网站Omishare工具对最高排名进行可视化（附录A中的图S10）。根据小鼠和人类GO富集分析的结果，共同的分子靶标主要发生在生物过程中，例如对化学物质的响应、对化学刺激的细胞响应在细胞组分中，细胞部分和胞外区部分的-lg P值和基因数最高在分子功能分析中，酶结合和蛋白结合作用较为突出。根据KEGG途径富集分析的气泡图，突出了扩展的相关途径，包括胆汁分泌、卟啉和叶绿素代谢以及初级胆汁酸生物合成。动物和临床试验均表明，所鉴定的靶点分布在不同的通路中，这些通路由YCHT组分以协同方式调节。3.7. 综合分析基于基于血清药物化学的网络药理学和血清代谢组学分析之间的串扰，H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931300图五、黄疸患者和小鼠中差异表达的潜在代谢物的相关途径主要的紊乱途径（a）脂质代谢和(b)蓝框内显示黄疸小鼠的胆汁酸代谢橙色框内显示了黄疸患者的主要紊乱途径（c）脂质代谢和（d）胆汁酸代谢说明了（e）黄疸小鼠和（f）患者中存在的MetPA代谢途径的比较概述框内标识文件（ID）是指本研究中初步检测到的代谢标志物的KEGG编号，其中红框内的ID为差异表达，另一框内的ID为本次研究未鉴定连接方框的箭头上的符号表示KEGG提供的关键酶;红色方框旁边的箱形图显示黄疸组（红色）和对照组（绿色）之间的相对差异强度LacCer：乳糖神经酰胺; CoA：辅酶A。H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931301图六、 （a）YCHT组和黄疸组小鼠的色谱图(b)小鼠中黄疸组和YCHT组之间的S-图;（c）小鼠中鉴定化合物15.55_283.0253的趋势图;（d）小鼠中黄疸组和YCHT组之间的PCA评分图;（e）人类中YCHT组和黄疸组的色谱图;（f）人类中黄疸组和YCHT组之间的S-图;（g）人类中鉴定化合物15.55_283.0253的趋势图;（h）人类中黄疸组和YCHT组之间的PCA评分图。p[1]：s-plot中的第一主成分;p（corr）[1]：s-plot中第一主成分的偏相关系数我们推测卟啉和叶绿素代谢、胆汁分泌和初级胆汁酸生物合成可能是黄疸病发病机制和YCHT疗效的关键机制。关注生物标志物、可能的上游靶点和人类和小鼠中活性成分的相关性，我们提取了核心靶点，包括ABCC 2、ABCC 3、UGT 1A1、FXR和CYP 7A1，并通过IPA相互作用网络进行了确认，用于后续的靶点验证。与核心靶点相关的前八个组分是京尼平苷、滨蒿内酯、异鼠李素、槲皮素、柚皮素、大黄酸、绿原酸和山奈酚。胆红素、胆绿素、胆红素葡萄糖醛酸苷和牛磺胆酸等关键代谢产物可作为核心生物标志物。构建了YCHT的功能机制图，如图8所示。对人体中四种临床关键代谢物（包括胆红素、胆脂烷、胆红素葡萄糖醛酸苷和牛磺胆酸，其中三种也存在于小鼠中）进行了内部验证，该验证是在一个独立队列中进行的，该队列包含从226名受试者中提取的60名随机参与者。非监督聚类分析表明，具有四种代谢物的模型可以区分健康受试者和黄疸患者（附录A中的图S11（a））。此外，ROC分析显示AUC值等于0.996，表明所选代谢物的模型可作为一种复杂的诊断方法（图1）。附录A第S11（b）条）。3.8. 靶标验证为了通过小分子的综合分析进行深入探索和预测靶点验证，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒评估YCHT对胆汁排泄相关蛋白（包括ABCC 2，ABCC 3和UGT 1A1）以及胆汁生物合成相关蛋白（包括CYP 7A1和FXR）的影响。与健康对照组相比，黄疸组ABCC 2、ABCC 3、UGT 1A1、FXR水平显著降低，而CYP7A1水平显著升高（P0.01或P0.05）。 YCHT治疗可减轻ABCC 2、ABCC3、UGT 1A1和FXR的降低和CYP7A1的升高（图1A）。附录A中的S12）。综上所述，YCHT通过调节CYP7A1、ABCC 2、ABCC3、UGT 1A1、FXR等促进胆汁分泌，抑制胆汁酸合成，对黄疸病4. 讨论众所周知，胆汁淤积性黄疸患者肝细胞中的胆汁流动受损，这导致毒性胆汁酸的保留和积累，从而加剧了黄疸的恶化H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931302见图7。YCHT治疗后血清成分和黄疸疾病的共同目标。(a)小鼠黄疸和血清成分的独特和共同靶点。网络图包括与YCHT（红色）相关的36种目标成分（橙色）和三种草药（浅蓝色）以及与胆汁淤积性黄疸（红色）相关的323种独特目标（蓝色），其中79种目标由两者共享（绿色）。(b)人类黄疸和血清成分的独特和共同目标。网络图包括与YCHT（红色）相关的29种目标成分（橙色）和三种草药（浅蓝色）以及与胆汁淤积性黄疸（红色）相关的323种独特目标（蓝色），其中79种目标由两者共享（绿色）。骰子病在黄疸病中，通过抑制胆汁酸产生和刺激胆汁分泌促进肝细胞功能改善，在机体的胆汁酸代谢中起着不可磨灭的作用[12综上所述，胆汁酸生成和分泌的调节可能有助于YCHT对黄疸病的大量观察发现，YCHT治疗后黄疸症状明显缓解，相关生物标志物也有所恢复。的潜在YCHT的靶点和活性成分是通过IPA平台和标记代谢物与血清成分之间的相关性绘图发现的;然而，YCHT如何靶向胆汁淤积性黄疸的病理过程的潜在机制远未被清楚地揭示[16，17]。这些发现还只是在动物模型中推导出来的，还需要结合临床数据，通过可靠的证据进一步验证。为了彻底破解这些问题，第一个全面H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931303图8.第八条。发现代谢组学、血清药物化学和网络药理学驱动的潜在靶点和活性化合物（a）构建了YCHT调节黄疸机制的网络图;（b）构建了新靶点与潜在活性化合物之间的靶向效力相关关系在动物模型和人类中建立了整合血清药物化学、网络药物学和代谢组学表征的策略。我们假设与疾病相关的表型应该与异常内源性疾病的系统效应相关，因此，表型的鉴定需要在系统水平上进行全面的多角度分析，进行深度数据挖掘，转化为对单个基因的点对点靶点验证。使用包含上述临床和动物双向发现的多重分析，我们建立了描绘动物和人类共享的最具潜力的分子网络的示意性模型（图1）。8）。有趣的是，通过两种类型受试者的富集分析，相同的候选靶分子，包括ABCC 2、ABCC 3、CYP 7A1、UGT 1A1和FXR，被识别为YCHT的功能靶点。我们相信，YCHT的生物活性成分可能与多种信号通路共同作用，从而在治疗黄疸疾病中表现出协同作用。这些发现提供了一个新的机制连接，以阐明如何YCHT可以防止胆汁淤积性黄疸的病理进展。此外，进行了一项非靶向代谢组学、多受试者和多步骤验证的系统研究，以确定与胆汁淤积性黄疸相关的胆红素、胆绿素和牛磺胆酸，这些是胆汁淤积性黄疸肝功能改变的最有希望的牛磺胆酸是胆汁分泌的关键信号分子，被认为是胆汁淤积性黄疸期间胆汁排泄受损的诊断标志物，并被认为具有免疫调节和抗炎作用[18]。在这些鉴定的生物标志物中，胆红素和胆绿素也值得在临床黄疸诊断中发挥重要作用[19]。胆红素是由胆绿素经胆绿素还原酶合成的代谢产物在胆汁淤积性黄疸期间，胆汁酸蓄积导致线粒体功能障碍和胆红素葡萄糖醛酸化受损，这刺激胆绿素转化为胆红素，以发挥抗氧化和细胞保护作用[20]。几项研究表明，与黄疸病相关的代谢物，包括犬尿烯酸和D-葡萄糖醛酸，在动物血清和尿液样本中异常表达[14，21]。因此本这项工作强调了一种新的模型的潜在效用，该模型含有胆固醇、牛磺胆酸、胆红素葡萄糖醛酸苷和胆绿素，用于临床黄疸疾病的预测和诊断。其他相关代谢物，如L-高半胱氨酸、胆酸、LysoPC（18：1（9 Z））和LysoPC（16：1（9 Z））在人和小鼠之间存在差异，这可能归因于种属之间的内在差异。结合血清药物化学、网络药理学和代谢组学研究，不仅进一步验证了YCHT的治疗作用，而且有助于更好地了解其功能本质。我们的实验研究的一个令人兴奋的结果是发现了一种新的代谢介导的治疗机制YCHT。来自黄疸小鼠和人类患者的最分化的受影响代谢物包括与胆汁酸生物合成和胆汁分泌相关的胆汁酸和脂质数据集分析显示黄疸患者或小鼠的胆汁酸水平高于健康参与者或小鼠，胆汁酸生物合成和胆汁分泌似乎与胆汁淤积性黄疸密切相关事实上，大量研究结果表明，胆汁酸合成的改善和胆汁分泌的抑制有利于胆汁淤积性黄疸疾病的改善[22]。网络药理学分析表明，YCHT可通过对ABCC 2、ABCC 3和CYP7A1的作用，参与胆汁酸的分泌和合成，是一种潜在的调节胆汁酸的多药耐药相关蛋白（MRP）家族是一类有机阴离子转运蛋白，属于腺苷三磷酸结合盒（ABC）转运蛋白超家族，包括ABCC2、ABCC 3等，负责葡糖苷酸的转运[23，24]。ABCC2也称为多药耐药相关蛋白2（MRP2），参与肝细胞中胆红素和胆汁酸硫酸盐等多种两亲性阴离子的分泌，以维持胆汁酸稳态，在胆汁分泌中发挥关键作用[25]。CYP7A1是胆汁酸生物合成经典途径中的限速酶，具有调节胆固醇稳态和胆汁酸合成的功能。与广泛的黄疸模型证据一致，在黄疸组中ABCC 2的表达水平显著降低，并且ABCC 2的表达水平显著降低。H. Xiong，A.-H. 张玉-J. Guo等人工程7（2021）12931304与健康组相比，CYP7A1显著升高，YCHT治疗可逆转该升高，这一点得到了实验动物和临床数据的进一步证实[26]。由于ABCC 2的激活，胆小管侧膜细胞分泌二价胆盐的能力增强，这可能解释了ABCC3通常在正常肝细胞膜中不表达;一旦发生胆汁淤积，肝细胞基底膜中ABCC 3的表达水平显著增加。此外，由于ABCC 3转运底物与ABCC 2具有广泛的同源性，因此通常认为ABCC 3的高表达水平补偿ABCC 2以减轻胆汁淤积性黄疸期间胆碱诱导的肝毒性损伤[27]。这支持了ABCC 3在胆汁淤积性黄疸的保护中的重要作用，正如我们的实验从各组之间ABCC 3蛋白表达水平的比较中所坚定地证实的那样。由于胆汁形成、分泌和排泄障碍后胆汁酸量突然增加，形成肝内胆汁淤积。相应地，胆汁流不能正常地输送到十二指肠中并且流回到血流中，增加血液中胆汁酸的水平。这导致FXR活化，FXR通过降低CYP7A1活性参与抑制胆汁酸生物合成[28，29]。FXR是激素核受体超家族的成员，通过诱导特定靶基因的表达，在胆汁酸的合成、转运和分泌中发挥重要作用。FXR的激活可抑制胆汁酸的生物合成，并激活胆汁酸向胆管的分泌，从而防止胆汁酸在肝细胞中的毒性蓄积[30，31]。我们观察到YCHT可以改善胆汁淤积性黄疸的症状和恢复胆汁酸紊乱，因为调节FXR活化和抑制CYP7A1在YCHT的协同效应中有很深的参与。到目前为止，大量证据表明胆汁酸的改变可启动FXR激活或抑制CYP7A1表达的调节[32，33]。此外，与jaun dice组相比，YCHT干预后黄疸受试者中观察到CYP7A1下调和FXR上调的相反变化，支持两个靶点之间的密切关系。在靶向途径中，许多都与evo-黄疸病的治疗。通过改善卟啉和叶绿素代谢，YCHT可以减轻小鼠和人类黄疸的严重程度，因为胆汁淤积性黄疸病的病理变化主要是由胆红素功能障碍引起的。进一步分析发现，YCHT同时改变了卟啉和叶绿素Meta中的胆红素、胆红素和胆红素葡糖苷酸。UGT 1A1是卟啉和叶绿素代谢的关键代谢组学酶，在肝脏中胆红素葡萄糖醛酸苷的形成中起催化作用，以在良好条件下促进ABCC 2或ABBC 3介导的胆汁分泌[34，35]。从这个角度来看，UGT1A1和ABC转运蛋白在胆红素异常代谢的功能调节中的意义提示胆红素在胆汁淤积性黄疸中的关键作用。抑制UGT1A1可阻止胆红素和葡萄糖醛酸结合，从而导致胆红素水平升高。靶向卟啉和叶绿素代谢的药物将阻断它们的过度表达，并可被视为治疗黄疸疾病的治疗候选药物[36]。由于这些原因，UGT1A1可以作为黄疸药物发现的有效潜在靶点。YCHT治疗显著增加了UGT 1A1的活性，这可能导致胆红素下调和胆红素葡萄糖醛酸苷上调，表明YCHT使胆红素的产生和消除正常化。同时，ABCC2或ABCC3介导的胆红素葡萄糖醛酸苷分泌的改善对于减轻黄疸病，同时也产生一些实实在在的好处。综上所述，YCHT通过增强FXR、UGT 1A1、ABCC 2和ABCC3的活性以及抑制CYP7A1的活性需要进行进一步的研究，以评估YCHT在这些成分中，京尼平苷和滨蒿内酯对黄疸相关疾病的治疗作用已得到有力验证[37本研究对开展中药复方药物发现及其有效治疗靶点的整合研究具有5. 结论本研究为YCHT的潜在作用靶点和活性成分的发现提供了一种新的思路。我们报告了一种综合策略，用于识别人类和小鼠生物样本中胆汁淤积性黄疸疾病循环代谢物中的相关疾病。YCHT中的8种活性成分对CYP7A1、ABCC2、ABCC3、UGT 1A1和FXR具有调节作用，并对胆汁酸的生物合成、卟啉和叶绿素代谢以及胆汁分泌途径具有调节作用。该整合策略被证明是有用的有效发现的活性化合物和治疗目标从草药。确认本工作得到了国家自然科学基金重点项目（81430093、81830110、81861168037）和黑龙江省头雁创新团队项目的资助。遵守道德操守准则Hui Xiong、Ai-Hua Zhang、Ya-Jing Guo、Xiao-Hang Zhou、Hui Sun、Le Yang、Heng Fang、Guang-Li Yan和Xi-Jun Wang声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.12.016上找到。引用[1] 张A，孙华，杨刚，王晓. 中药成分质谱分析的最新进展与趋势。TrAC TrendsAnal Chem2017;94：70-6.[2] Tang J ， Gautam P ， Gupta A ， He L ， Timonen S ， Akimov Y ， et al.NetworkpharmacologymodelingidentifiessynergisticAuroraBandZAKinteraction intriple-negative breast cancer. 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