医学信息学解锁23（2021）100514角质形成细胞的计算驱动分子动力学模拟生长因子在不同pH条件下的行为Mohammadtaghi Borjian Boroujenia，Mansoureh Shahbazi Dastjerdeha，MohammadAli Shokrgozarb，Hamzeh Rahimia， *，EskandarOmidiniac，**a伊朗德黑兰伊朗巴斯德研究所生物技术研究中心分子医学系b国家细胞库，伊朗巴斯德研究所，伊朗c伊朗德黑兰伊朗巴斯德研究所生物化学系A R T I C L EI N FO保留字：角质细胞生长因子分子动力学模拟pH稳定性质子化状态A B S T R A C T愈合期长的慢性伤口被认为是一个世界性的问题。角质形成细胞生长因子（KGF）作为创伤愈合过程中的重要参与者，是治疗创伤最有效的方法之一。为了防止伤口变成慢性，应在伤口产生的第一步进行有效的治疗。然而，在伤口的第一阶段，KGF在酸性pH条件下的低稳定性阻碍了其在伤口治疗中的应用。缺乏对KGF在不同pH下的行为的了解使得难以设计该蛋白质的pH稳定变体。在本研究中，我们试图用分子动力学模拟KGF在不同pH条件下的行为。为此，使用PROPKA网络服务器分析了KGF在不同pH下的质子化和去质子化状态。然后，在不同pH下生成的PDB文件在300、400和500 K的温度下使用GROMACS软件进行分子动力学模拟。在原子水平上进行了构象稳定性、残基柔性、蛋白质紧密性和氢键分析。结果表明，在500K下，通过将蛋白质的总电荷从中性pH值的10降低到碱性pH值（pH：9.0）的7，KGF的稳定性显著提高。此外，溶剂可及表面积（SASA）的分析表明，KGF SASA随着蛋白质电荷的减少而减少。蛋白质内和蛋白质-溶剂氢键（H-键）的分析表明，不仅在碱性pH值下的H-键的数量比中性和酸性pH值更高，而且，在碱性pH值下，它们不随温度的升高而显著降低。我们的研究结果表明，更多的正电荷残基和它们的排斥的存在下，使KGF的不稳定的蛋白质。因此，似乎减少蛋白质电荷的靶向突变可以导致KGF的稳定性增加1. 介绍伤口是一个世界性的问题，具有复杂的再生过程，可能需要数年才能愈合[1]。预计到2024年，全球伤口护理市场将从2019年的198亿美元达到248亿美元，复合年增长率为4.6%[2]。伤口的pH值影响伤口愈合过程中发生的所有生化反应，包括细菌毒性、血管生成、氧气释放和蛋白酶活性[3，4]。已经证明，正常皮肤表面的平均pH为4.7，而在伤口进展期间监测皮肤pH显示pH增加至8.9，这是MMP-2、纤溶酶和弹性蛋白酶的最佳pH [3，5，6]。已经开发了不同的方法来治疗伤口。最有效的治疗方法之一是使用生长因子。角质细胞生长因子（KGF）是一种上皮细胞特异性有丝分裂原，参与伤口愈合的上皮形成阶段[7]。由于其对上皮细胞的特异性作用，KGF具有优于其他生长因子的优势。已知KGF是上皮细胞增殖和分化的特殊旁分泌介质，其影响细胞过程，例如DNA修复、游离氧的活化、细胞分化和增殖[8，9]。Palifermin是重组人角质细胞生长因子（rhKGF）的截短形式，用于预防或治疗接受化疗后进行干细胞移植的患者的口腔粘膜炎的应用* 通讯作者。** 通讯作者。电子邮件地址：gmail.com（H. Rahimi），eomid8@gmail.com（E.Omidinia）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100514接收日期：2020年10月16日;接收日期：2020年12月28日;接受日期：2021年1月5日2021年2月11日在线提供2352-9148/© 2021由Elsevier Ltd.发布这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuM. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）1005142+++++关于我们+++在伤口产生的第一阶段，rhKGF加速伤口愈合过程并防止伤口变成慢性的。然而，KGF在酸性和中性pH条件下的低稳定性阻止了其在伤口的第一阶段的应用[10，11]。KGF在中等温度下变性并开始聚集。为了克服这个问题，许多化学和基因工程技术已经被使用[10，12]。化合物的作用机制是与带正电荷的簇结合并中和它们[13]。 已使用生物信息学算法在pH 5和8.5下研究了pH对人表皮生长因子的影响[14]。然而，在这方面， 据我们所知，还没有进行计算研究来研究KGF在不同pH条件下的行为为了研究蛋白质在不同pH下的行为，需要在静电环境改变的条件下评估可滴定基团的质子化状态常用的模拟蛋白质-配体连接中可电离基团固定质子化状态的方法是H和PROPKA。但是这些工具无法计算由于静电环境的变化而发生的质子化状态的变化率[15]。通过分子动力学（MD）模拟来预测蛋白质性能的生物信息学中的高级算法的增加的计算能力和演变使得该方法能够模拟大的生物分子。用恒pH分子动力学方法计算了蛋白质质子化状态随pH值变化的涨落该技术已成功应用于预测蛋白质中可电离基团的pKa含量[15使用分子动力学模拟不同pH值下的蛋白质行为，使我们能够识别在各种pH条件下决定蛋白质稳定性的区域[25生物分子在溶液中的结构、功能和动力学是高度依赖于pH值。pH值的影响是通过稳恒相互作用发生的，是分子水平上最强的力之一，并可对分子结构产生直接影响[29]。 例如，酸性pH显著增加蛋白质疏水部分的暴露[30]。一般来说，pH对蛋白质结构的影响有三种方式[31，32]。首先，环境酸度的变化会影响蛋白质结构中氢原子的数量，从而影响蛋白质内部氨基酸的氢键和静电键强度。第二，环境酸度的变化影响环境中氢原子的数量，因此与中性pH相比，对表面氨基酸具有不同的影响。第三，由pH变化引起的蛋白质结构中存在的氢的数量的增加或减少影响结构紧凑性，从而影响蛋白质的功能。由于缺乏对rhKGF在不同pH值下行为的了解，很难确定受pH值变化影响最大的区域因此，在本研究中，我们试图研究酸性和碱性pH对rhKGF行为的影响。为此，使用PROPKA服务器在三个温度（300、400和500 K）下调整rhKGF在pH 5.5、7.0、8.0、8.5和9.0下的分子动力学模拟。结果表明，高的正电荷的存在使KGF成为不稳定的蛋白质，并且KGF的稳定性通过减少电荷而增加。2. 方法rhKGF在不同pH下的行为以及因此受pH变化影响最大的蛋白质区域先前尚未研究。为了进行rhKGF的CpHMD模拟，使用PROPKA网络服务器在pH 5.5、7.0、8.0、8.5和9.0下分析蛋白质的质子化和去质子化状态，然后使用GROMACS（版本5.1.4）在300、400和500 K2.1. rhKGF的同源模建rhKGF（DrugBank登录号：DB 00039）的三维结构尚未通过实验确定。因此，同源建模协议被用来预测其三维结构。为此，使用rhKGF序列（UniProt ID：P21781人FGF 7残基23-163）作为GalexyTBM网络服务器中的查询。在创建的所有模型中，最佳模型是基于差和有利的旋转异构体、拉玛钱德朗有利和离群值、坏债券和坏天使的百分比来选择的。GalaxyRefine2服务器用于优化所选模型。除了上述参数外，还对改进模型的RMSD、MolProbity评分、Clash评分和GALAXY能量进行了评估，以选择最佳模型。2.2. 不同pH下蛋白质的质子化和去质子化使 用 PDB2PQR 网 络 服 务 器 （ http ： //nbcr-222.ucsd.edu/pdb2pqr）上提供。使用H web服务器还计算了rhKGF在不同pH下的总电荷。H使用基于有限差分Poisson- Boltzmann（PB）连续静电方法的rhKGF的固定介电常数（http://biophysics.cs.vt）。edu/H）。基于从PDB2PQR网络服务器获得的可滴定基团的电离状态，将质子添加到输入rhKGF结构中PDB2PQR应用PROPKA算法计算在PARSE力场（5.5、7.0、8.0、8.5和9.0）下指定pH值下蛋白质的电离状态PROPKA算法分配蛋白质在不同pH下的质子化状态，并提供有关残基氢键、溶剂可及性、位置和库仑相互作用的信息[33，34]。PDB 2 PQR还使用户能够将PDB文件转换为PQR文件，该文件可用于静电场计算，包括pH-MD模拟。该Web服务器可以使用快速实验方法比其他软件更准确地确定pKa值。该程序计算由蛋白质溶解、氢键和电荷相互作用引起的pKa变化使用PDB 2 PQR网络服务器，有限数量的重原子（非--氢）被添加到生物分子结构中。然后滴定并且以与所需氢键一致的方式估计生物分子的质子化状态，从而产生输出“PQR”。该工具用于研究pH对蛋白质电荷的影响[25， 26]。2.3. 分子动力学模拟协议长时间的分子动力学模拟是研究蛋白质在不同生理条件下构象变化等原子水平上的生物过程的有力工具。使用GROMACS软件包（版本5.1.4）使用AMBER力场、LINCS约束算法和改进的Berendsen恒温器进行分子动力学模拟。将rhKGF的预测三维结构以及质子化和去质子化模型放置在十二面体box中，溶质和box边界之间的最小距离为10 μ m。然后用TIP3P水分子填充盒子。为了补偿蛋白质在0.15M盐浓度下的净电荷，分别在pH 5.5、7、8.0、8.5和9.0的模拟中加入43 Cl-和30 Na离子、39 Cl-和30 Na离子、39 Cl-和30 Na离子以及38 Cl-和30 Na离子。基于静电荷，在不同pH下用这些离子替换溶剂分子。然后在100 ps NVT和NPT条件下平衡系统，并进行100 ns分子动力学模拟，积分时间为0.002ps。将系统加热至300 K持续100 ns，并开始该过程。由于高温可以显著影响蛋白质的结构和稳定性，因此在包括400和500K的更高温度下进行了几次分子动力学模拟，M. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）1005143∫确定基因操作的潜在地点。温度以100 ps以上的逐步方式升高到400，然后升高到500K.高温下的MD模拟加速了可能的解折叠事件，并突出了解折叠启动的rhKGF结构的弱点[352.4. 300、400和500 K为了评价rhKGF在不同pH和温度条件下的构象稳定性、柔性和行为，在MD模拟上进行了不同的分析。RMSD（均方根偏差），RMSF（均方根波动），和Rg（回转半径）和平均Rg值计算为每个pH值在温度300，400和500 K的蛋白质碳α相对于初始构象。RMSD是用于估计蛋白质相对于初始结构的稳定性的基本因子之一。进行RMSF分析以评估模拟期间残留物的平均波动。Rg是一组原子与其共同中心的质量加权均方根距离，被用作蛋白质致密性的标准。因此，Rg分析指示蛋白质的总体尺寸[39溶剂可及表面积（SASA）被描述为聚合物的面积。暴露到足以与邻近溶剂分子发生相互作用的蛋白质。SASA被认为是蛋白质稳定性和折叠研究中的决定因素，其特征在于溶剂球的假想中心与分子表面的范德华接触[44，45]（图1）。SASA分析还在不同pH条件下对蛋白质进行。基于供体-受体（DA）和供体-氢-受体（DHA）角计算蛋白质-蛋白质和蛋白质-溶剂两者的氢键数。对于氢键的计算，采用几何标准，分别为3.5 μ m和30μ m的截止距离和截止角。氢键（HB）的寿命在所有模拟计算的基础上连续的方法。以这种方式，HB的数量从时间0到t在寿命的离散处连续存在。HB的寿命由平均总体自相关函数C（τ）计算，C（τ）=（Si（t）Si（t+τ）><其中Si（t）=（0，1）在时间t的H键i。C（τ）的积分给出了平均HB寿命（τh键）的粗略估计[46，47]。Fig. 1. 溶剂可及表面积（SASA）和范德华表面力。溶剂半径显示为红色。可接近表面用虚线绘制。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版∞τ氢键=C（τ）C（τ）dτ03. 结果3.1. rhKGF的同源模建GalaxyTBM服务器使用褐家鼠FGF7晶体结构（PDB ID：1QQL_A）作为模板，并提供了5个rhKGF模型。基于使用MolProbity结构验证服务器进行 的蛋 白质 几何分 析， 选择model-1作为 最佳 模型 。然后 使用GalaxyRefine2 Web服务器对该模型进行了改进。Gal-axyRefine 2优化后得到10个模型。基于全原子接触分析，共价几何，和扭转角的标准，模型-2被选为最好的一个进行MD模拟。模型-1在精修前后的蛋白质几何分析结果见表1。所选模型的三维结构如图所示。 二、3.2. 氨基酸在不同pH下的电荷计算对不同pH值下氨基酸电荷的计算结果表明，在酸性和碱性条件下，20种氨基酸的电荷发生变化。计算了不同pH下KGF的质子化和去质子化氨基酸蛋白质在pH 5.5、7、8、8.5和9下的总电荷为12.8、10、9、8和7，（表2）。荷电残基显示在rhKGF的三维结构上。rhKGF中有20个残基在pH5.5、7.0和9之间具有不同的质子化状态（表2）。对rhKGF在不同pH下氨基酸电荷的计算表明，在中性pH下有3个残基带负电荷（图3a，红色），1个残基带正电荷（图3a，蓝色），其他16个残基为中性（图3a，绿色）。在pH 5.5时，有14个残基带负电荷（图3b，红色），其他6个残基带正电荷（图3a，绿色）。在pH 8.0时，有17个残基带负电荷（图3c，红色），两个残基带正电荷（图3c，蓝色），一个残基是中性的（图3c，绿色）。在pH 8.5时，有一个残基带负电荷（图3d，红色），两个残基带正电荷（图3d，蓝色），其他17个残基是中性的（图3d，绿色）。在pH 9.0时，有17个残基带负电荷（图3e，红色），一个残基带正电荷（图3e，蓝色），另外两个残基是中性的（图3e，绿色）。3.3. 不同质子化状态为了确定rhKGF结构的弱点，展开现象开始，独立的100 ns MD模拟（在表1使用GalexyTBM服务器进行rhKGF同源性建模的汇总统计。使用最小化和细化关于有利的旋转异构体、Ramachandran有利的、Cβ偏差和坏角度的百分比来改善模型质量。精修前蛋白质几何结构精修后Number百分比Number个可怜的旋转异构体10.830 0呋咱旋转异构体12099.17121 100Ramachandran离群值10.720 0拉玛钱德朗赞成13194.24133 95.68Cβ偏差>0.25μ m86.150 0不良债券0/117100/1171 0坏天使19/15661.218/1566 0.51顺式脯氨酸0/200/2 0M. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）1005144表2图二. 通过同源建模制备的rhKGF的精细模型的3D结构。含有不相容氨基酸的区域位于N端，rhKGF的氨基酸在不同pH下具有不同的电荷状态如表所示蛋白质在pH 5.5、7、8、8.5和9下的总电荷分别为12.8、10、分别为9、8和7氨基酸pH 5.5中性pH 8.0pH 8.59.01SER 11.0001.0000.0000.0000.0002 TYR2-0.010 0.000-0.010 0.000-0.0103 TYR4-0.010 0.000-0.010 0.000-0.0104 MET 5-0.010 0.000-0.010 0.000-0.0105 TYR22-0.010 0.000-0.010 0.000-0.0106甲硫氨酸37-0.010 0.000-0.010 0.000-0.0107 TYR41-0.050-0.045-0.050-0.045-0.0508 ASN42 0.430 0.435 0.430 0.435 0.43010甲硫氨酸44-0.010 0.000-0.010 0.000-0.01010 TYR64-0.010 0.000-0.010 0.000-0.01011 MET 67-0.010 0.000-0.010 0.000-0.01012 TYR74-0.010 0.000-0.010 0.000-0.01013 LYS76 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00014 HIS93 0.980 0.000-0.020 0.000-0.02015 TYR94-0.010 0.000-0.010 0.000-0.01016 TYR97-0.010 0.000-0.010 0.000-0.01017 HIS104 0.980 0.000-0.020 0.000-0.02018 MET 109-0.010 0.000-0.010 0.000-0.01019 HIS133 0.980 0.000-0.020 0.000-0.02020 MET 137-0.010 0.000-0.010 0.000-0.010总费用12.8 10 9 8 7pH5.5，7，8，8.5和9）在300K以及400K和500K温度下进行。为了评价rhKGF在不同pH和温度条件下的构象稳定性、柔性和紧密性，在pH 5.5、7、pH8、pH 8.5和pH 9下进行RMSD、RMSF和Rg分析。3.3.1. 用均方根偏差（RMSD）分析蛋白质稳定性在300 K下的RMSD图的比较表明，rhKGF蛋白在所有pH下20ns后的偏差约为0.3nm。在pH 8.5和pH 9的偏差保持稳定，在300 K，显示最小的RMSD从起始结构相比，中性pH。在400 K的温度下，在pH 5.5，和7.0的RMSD因子达到0.5 nm后，40 ns和蛋白质迅速发展到解折叠。此外，与其他pH值相比，即使在400K下模拟100ns后，pH值为8.5和9.0的蛋白质构象仍保持稳定。RMSD图的分析表明，与pH：7.0相比，rhKGF在500K温度下在pH：8.5和pH：9.0下非常稳定（图11）。 4）.3.3.2. 残差波动的均方根波动RMSF图的比较表明，rhKGF蛋白的C-末端区域（100-140个氨基酸）。 在pH5.5、7、8、8.5和9的300K下分析RMSF图表明，该蛋白的N端区域在0.4 nm和1 nm之间显著移动。此外，蛋白质的C-末端区域，特别是氨基酸100-110，显示出比蛋白质的其他部分更大的迁移率（0.5 nm）（图5）。3.3.3. 用回转半径（Rg）比较不同pH下rhKGF的Rg图，50ns 后，在所有pH下的Rg约为1.37nm。不变Rg值表明rhKGF在pH8.5和9时保持非常稳定，在400和500K温度下100 ns后仍能折叠 （图 6）。rhKGF的平均Rg值的分析表明，在pH 5.5，7.0和8.0下，随着温度的升高，蛋白质的致密性降低，因此稳定性降低。而它在pH 8.5和9.0时保持其致密性。此外，蛋白质在pH 8.5和9下的较低平均Rg值表明，与中性和酸性pH相比，蛋白质在碱性pH下的紧密性和稳定性更高（表3）。3.3.4. 溶剂可及表面积（SASA）在pH 5.5、7、8、8.5和9下计算蛋白质周围的表面积。在中性pH条件下，10 0ns后，rhKGF的总表面积约为80nm2在300 ℃下，在pH5.5、8、8.5和9下100 ns后的表面积K分别为约80nm2、82nm2、82nm2和85nm2。蛋白质的SASA在中性时增加到约110nm2，pH5.5，500K时为8。而rhKGF在pH8.5和9时的表面积约为85nm2，与300K时的表面积相同。 7）。3.3.5. 蛋白质内氢键分析在中性pH下，100ns后，rhKGF中所有原子之间的总氢键（HB）数在300 K、pH值为5.5、8、8.5和9的条件下，100 ns后的HB总数分别为90、95、100和110在所有温度下，与酸性和中性pH值相比，pH值为9时的HB数量更高（图1）。 8）。3.3.6. 蛋白质-溶剂氢键分析在中性pH条件下，60ns后rhKGF蛋白与溶剂之间的氢键总数约为315。在pH：8.5和9下在300 K下100 ns后具有溶剂的HB的总数为约350。与500 K下的酸性和中性pH相比，在pH：9下的HB数量也更高（图11）。 9）。3.3.7. 氢键相关函数根据Luzar和ChandlerM. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）1005145图三. 在不同pH下具有不同电荷的rhKGF氨基酸。具有不同质子化状态的残基已在pH 5.5（a）、中性pH（b）、pH 8.0（c）、pH 8.5（d）和pH 9.0（e）下显示在3D结构上。带正电荷的残基以蓝色着色，带负电荷的残基以红色着色，并且中性残基以绿色着色（有关此图例中颜色的解释，请读者参考本文的Web版本见图4。在300 K（A）、400 K（B）和500 K（C）下，pH：5.5（黑色）、pH：7.0（红色）、pH：8（绿色）、pH 8.5（蓝色）和pH：9（黄色）的RMSD图的比较。中性pH（红色）下的RMSD图显示，在300K、400K和500K中性pH（红色）下，rhKGF蛋白质的偏差分别约为0.3nm、0.8nm和1.5nm。通过在pH 9下降低蛋白质的电荷，该偏差在300K、400K和500K下分别降低至约0.28 nm、0.4 nm和0.3 nm（黄色）。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版图五. 在300 K（A）、400 K（B）和500 K（C）下，rhKGF在pH：5.5（黑色）、pH：7（红色）、pH：8（绿色）、pH 8.5（蓝色）和pH：9（黄色）下的RMSF图。在中性pH（红色）下的RMSF图通过降低在pH 9的蛋白质总电荷（黄色）中，该柔性在所有温度下降低至约0.1 nm至0.9 nm。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版M. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）1005146++见图6。在300 K（A）、400 K（B）和500 K（C）下，rhKGF在pH：5.5（黑色）、pH：7（红色）、pH：8（绿色）、pH 8.5（蓝色）和pH：9（黄色）下的Rg图比较。在300K、400K和500K下，中性pH（红色）下的通过在pH 9下降低蛋白质的电荷，在所有温度下，Rg值在pH：9（黄色）下降低至约1.37 nm。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版表3在不同温度下，计算每个pH下rhKGF的总平均Rg值。如表中所示，平均Rg值随着pH值从酸性变为碱性而降低。这些值表明，与中性和酸性pH相比，蛋白质在碱性pH下更紧凑和稳定。pH平均Rg总平均Rg300K400K500KpH 5.51.371.381.961.57pH 7.01.371.411.651.48pH 8.01.371.371.701.48pH 8.51.371.371.371.37pH值9.0 1.37 1.37 1.37 1.37[48在100ns处测量了不同pH下rhKGF原子与溶剂分子之间的氢键自相关函数。取向迁移率取决于曲线的斜率[51]。如图10所示，除碱性pH值（8.5和9.0）外，所有pH值的曲线斜率均随温度增加，rhKGF在碱性pH值下的斜率小于中性和酸性pH值。4. 讨论KGF是一种上皮细胞特异性有丝分裂原，参与伤口上皮形成，用于治疗化疗后的口腔粘膜炎[29，52]。尽管rhKGF在伤口愈合中具有所有益处，但该蛋白在温度解折叠测试中非常不稳定KGF是变性的，甚至在中等温度下也逐渐开始聚集[25，26]。此外，rhKGF在酸性和中性pH条件下的稳定性差，阻碍了其在伤口第一阶段的应用[4，6，53]。由于缺乏对rhKGF在不同pH下的行为的了解，很难确定受pH变化影响最大的蛋白质区域。通过分子动力学模拟（MD）预测蛋白质性能的先进算法的发展因此，在本研究中，我们试图模拟rhKGF在不同pH下的行为。为此，首先，我们使用H和PROPKA服务器分析了酸性和碱性pH对rhKGF蛋白原子的影响。尽管两个网络服务器之间存在差异，但与碱性pH值相比，酸性pH值下蛋白质的总电荷更高结果用于在300、400和500 K温度下在pH 5.5、7.0、8.0、8.5和9.0下运行全原子MD为了确定不同pH下蛋白质稳定性的差异，并突出rhKGF在中性和 酸性pH下的 弱点， 所有 模拟都 在较高 温度下 进行， 包括400 ℃，见图7。 rhKGF在pH 5.5（黑色）、7（红色）、8（绿色）、8.5（蓝色）和9（黄色）、300 K（A）、400 K（B）和500 K（C）下的溶剂可及表面积（SASA）分析K（C）。在中性pH下，蛋白质的SASA从300K时的80nm2增加到400K时的90nm2和500K时的110nm2在300 K、pH5.5、8、8.5和9条件下，该蛋白的SASA分别约为80 nm 2、82 nm 2、82 nm 2和82 nm 2。随着温度升高到500 K，蛋白质SASA增加到约110 nm2，在pH5.5，7，和8，但它是约85 nm2，在pH8.5，和9。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）M. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）1005147见图8。在300 K（A）、400 K（B）和500 K（C）下，pH值：5.5（黑色）、pH值：7（红色）、pH值：8（绿色）、pH值：8.5（蓝色）和pH值：9（黄色）的rhKGF内氢键数图。在中性pH（红色）下，rhKGF内的氢键总数在300K、400K和500K下分别约为90、80和70。通过在pH 9（黄色）下降低蛋白质的电荷，在300K、400K和500K下，HB的数量分别增加到110、105和100。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版见图9。在300 K（A）、400 K（B）和500 K（C）下，在pH：5.5（黑色）、中性pH（红色）、pH：8（绿色）、pH 8.5（蓝色）和pH：9（黄色）下rhKGF蛋白与溶剂之间的氢键分析。在中性pH（红色）的模拟过程中，rhKGF蛋白与溶剂之间的总氢键在300K、400K和500K下分别约为320、275和220。通过降低pH 9（黄色）下蛋白质的总电荷，在300 K、400 K和500 K下氢键的数量分别增加到320、275和270。（有关此图例中颜色的解释，请读者参考本文的Web版本见图10。在300 K（A）、400 K（B）和500 K（C）下，pH：5.5（黑色）、中性pH（红色）、pH：8（绿色）、pH 8.5（蓝色）和pH：9（黄色）时rhKGF蛋白与溶剂之间氢键的自相关函数图。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）500K。用RMSD因子分析rhKGF在不同pH值和温度下的稳定性，结果表明，蛋白质在pH 8.5和9时的稳定性远低于pH 7.0时的稳定性，表明rhKGF在碱性pH下的稳定性提高。这些发现表明，蛋白质在pH值下的模拟行为M. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）10051489.0 可以作为 进一步研究的有效 平台。RhKGF 具有9.3 的等电点（pI），具有总共10个正电荷，主要在其C-末端区域。根据Chen等人的报告，KGF蛋白的不稳定性是由于带正电荷的残基的排斥[12]。我们的研究结果还表明，KGF的稳定性显着提高在碱性pH值，包括8.5和9。因此，估计KGF在较低pH（中性和酸性）下不稳定的关键原因是正电荷的高存在及其排斥，导致蛋白质解折叠和随后的不可逆聚集。理论上，RMSF值的增加，作为蛋白质柔性增加的量度，表明蛋白质稳定性降低。对rhKGF RMSF的评估表明，与其他pH值相比，KGF在pH 8.5和9下的总体流动速率较低。RMSF分析确定区域100-110和130-140为rhKGF的高度波动区域。对rhKGF的Cα原子之间的Rg的分析表明，在500K下，与碱性pH值相比，在中性和酸性pH值下，Rg值较高，因此蛋白质的紧密性和稳定性降低。这些结果也为正电荷对KGF稳定性的破坏作用提供了支持性证据。一般来说，在模拟过程中蛋白质SASA的值增加表明结构松弛，因此蛋白质稳定性降低[54，55]。在不同pH和温度下进行的关于SASA的MD模拟的分析表明，rhKGF在碱性pH（8.5和9）下的SASA值不仅显著低于pH 5.5、7和8，而且在300至500 K的温度升高时也不降低，证实了在碱性pH下随着电荷降低蛋白质的稳定性提高。对rhKGF中氢键数目的分析发现，碱性pH（8.5和9）下的蛋白质内和蛋白质-溶剂氢键数目不仅高于中性和酸性pH，而且不随温度的升高而减少。这也支持蛋白质在碱性pH下由于电荷减少而提高的稳定性。这是另一个证据，表明更多的正电荷残基的存在和KGF的不稳定性之间的关系。rhKGF在500K下的自相关函数分析结果表明，rhKGF与水分子之间的氢键在pH：9.0时比在pH：7.0.在500K时，除碱性pH值高于其他pH值外，所有pH值下的氢键相关函数都非常接近。rhKGF氢键的自相关函数分析表明，与α和ε-聚赖氨酸蛋白一样，曲线斜率随温度升高而增加[51]。此外，随着温度从30 K增加到500 K，除了碱性pH（8.5和9.0）之外，所有pH的斜率都增加，并且对于rhKGF，与中性和酸性pH相比，在碱性pH下斜率较小。这些结果与蛋白质-溶剂氢键数目的分析结果一致。这些发现证实了rhKGF在碱性pH值下的稳定性高于中性pH值。由于可电离的侧链，带电氨基酸（如Asp、Glu、His、Lys和Arg）的极性头部基团之间的库仑排斥可在pH值变化期间引发蛋白质变性[49rhKGF在pH 5.5、6.5、7.0、8.0、8.5和9.0以及温度300 K、400 K和500 K下的行为模拟表明，与中性和酸性pH相比，碱性pH下蛋白质电荷的减少增强了蛋白质克服位置之间排斥力的能力带电荷的残基并提高蛋白质稳定性。蛋白质稳定性和pI之间的关系已经在几种蛋白质中进行了研究。根据这些报告，一些蛋白质在接近其pI的pH下表现出最高的稳定性，而其他蛋白质可能不显示此特征[33，34]。我们的研究结果表明，rhKGF遵循这一规律。因此，似乎可以通过增加制剂pH值接近其pI或引入降低蛋白质pI的突变来改善rhKGF稳定性。生物活性是生物药品在生产、纯化、储存和应用过程中最重要的特征。蛋白质的最高活性通常在最佳pH下实现，该最佳pH也是蛋白质稳定性的最佳pH [56，57]。由于rhKGF在接近其pI的pH下显示出最高的稳定性，例如pH 8.5和9，因此在这些pH范围内，rhKGF预期保持其活性。由于慢性伤口的pH值升高[4，58]，预计rhKGF在伤口床条件下的稳定性会增加。相同电荷残基的静电排斥是影响蛋白质结构、稳定性和功能的主要因素之一[59我们的研究结果表明，随着rhKGF在碱性pH下净电荷的减少，与中性和酸性pH相比，RMSD、RMSF、Rg和SASA显著降低，表明蛋白质在碱性条件下的稳定性较高。这表明极性带电残基之间的排斥对rhKGF稳定性的负面影响。由于净电荷和因此氨基酸之间的排斥率降低，即使在高温（400 K和500 K）下，蛋白质内和蛋白质-溶剂氢键的数量也比中性和酸性pH下增加，表明带正电荷的残基之间的排斥是KGF不稳定的最重要原因之一。rhKGF在不同pH下的RMSD、RMSF和Rg行为因子类似于T7溶菌酶，因为与中性和酸性pH相比，它们在碱性pH下均显示出更高的结构稳定性、更少的残留物波动和更紧密性[55]。rhKGF的pH依赖性动力学和行为也类似于鞘氨醇激酶1（SphK1）蛋白。因为与酸性pH相比，它在碱性pH下显示出更高的结构SphK1在不同pH值下的计算和实验研究表明，它在pH 7.5-9范围内保持其天然构象，而在酸性pH下以熔融球结构存在，这表明在这些pH下蛋白质聚集。这些研究让我们深入了解蛋白质在生物过程中的行为，并帮助我们将其用于其他治疗目的[43]。不同pH条件确定了受pH值变化影响最大的区域。这些区域是诱导rhKGF突变以增强对不同pH的稳定性的候选位置。为了设计具有增强的pH稳定性的rhKGF的生物活性类似物，可以在除了参与肝素和受体结合的关键残基之外具有高积累的带正电荷的残基的区域中引入突变。这些突变体可能在伤口产生的第一阶段的酸性pH条件下具有潜在的治疗应用，以使治疗更有效并防止伤口变成慢性的。5. 结论rhKGF作为创伤愈合过程中最重要的参与者之一，其稳定性差限制了其在创伤形成初期的酸性pH条件下的应用。为了确定这种不稳定性的主要原因，在不同的温度下模拟rhKGF的行为。 pH条件。MD模拟分析表明，rhKGF的稳定性显着增加，在碱性pH值的蛋白质的净电荷减少相比，中性和酸性pH值。我们的研究结果表明，KGF不稳定的主要原因是高的存在和静电排斥的带正电荷的残基，特别是积累在肝素结合位点。因此，除了关键功能残基之外，降低蛋白质净电荷的突变增强了蛋白质克服排斥力的能力并改善了蛋白质稳定性。M. Borjian Boroujeni等人医学信息学解锁23（2021）1005149-资金来源这项研究得到了伊朗巴斯德研究所（Pasteur Institute of Iran）的资助。Mohammadtaghi Borjian Bor- oujeni的论文，批准号。BP-9255）竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作引用[1] JüarbrinkK，etal. 慢性伤口的人文和经济负担：一项系统评价方案。系统修订版2017;6（1）：15。[2] https://www.marketsandmarkets.com/。按产品划分的伤口护理市场（泡沫、水胶体、藻酸盐、抗菌敷料、评估、NPWT器械、替代品、缝线、吻合钉、胶带）、伤口（手术、创伤、糖尿病溃疡、烧伤）、最终用户、地区-全球预测至2024年。2019年。[3] Schneider LA等人，pH值对伤口愈合的影响：伤口治疗的新视角？皮肤病 学文 献 研究 2007;298（9）：413-20。[4] 格辛湾慢性伤口表面pH值的意义。创伤UK 2007;3（3）：52.[5] LambersH，et al. 天然皮肤表面的pH值平均低于5，这对其常驻菌群是有益的。 国际化妆品科学杂志2006;28（5）：359-70。[6] Percival SL等人，pH值对伤口愈合、生物膜和抗菌功效的影响。伤口修复再生2014;22（2）：174-86。[7] MarcheseC，et al. 人角质形成细胞生长因子对人角质形成细胞增殖和分化的活性：分化反应将KGF与EGF家族区分开来。细胞生理学杂 志 1990;144（2）：326-32.[8] Finch PW，Rubin JS.角质细胞生长因子/成纤维细胞生长因子7，一种具有上皮保护和修复治疗潜力的稳态因子。Adv CancRes 2003;91：69-136.[9] 吴凯，等.角化细胞生长因子促进过氧化氢暴露后肺泡上皮细胞DNA修复. 美国生理学杂志肺细胞分子生理学1998;（4）：275. p. L780-L787[10] 作者：ChenBL，Arakawa T. 渗透剂和盐对重组人角质细胞生长因子的稳定作用。药物科学杂志1996;85（4）：419-22.[11] Treuetum MJ，et al. 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