宏基因组学研究揭示生物处理生活污水中的病毒威胁

环境科学与生态技术7（2021）100105原创研究宏基因组学和病毒学数据挖掘揭示了生物处理生活污水李翔a，b，c，1，程占文a，党晨媛a，张淼a，严政a，b，c，d，**，于霞a，b，c，*，1a南方科技大学环境科学与工程学院，深圳518055b南方科技大学环境科学与工程学院地表水-地下水污染综合控制国家环境保护重点实验室，深圳518055c南方科技大学环境科学与工程学院广东省土壤与地下水污染控制重点实验室，深圳，518055d南方科技大学海洋科学与工程系，深圳市海洋生物地球组学重点实验室，深圳，518055我的天啊N F O文章历史记录：接收日期：2021年4月18日接收日期：2021年2021年6月2日接受保留字：WWTP宏基因组病毒数据挖掘生物处理过的废水A B S T R A C T活性污泥法是污水处理厂常用的二级生物处理工艺，能去除大量微生物。然而，人们对它对整个病毒社区的影响知之甚少。在编译了3 Tbp的下一代测序（NGS）宏基因组/病毒组数据集（包括来自27个WWTP的119个子数据集，包括感染、有效和AS样本）后，通过数据挖掘评估病毒去除效率病毒的正常丰度表明，糖尿病患者表现出最高的病毒流行率（3.21±3.26%，n= 13），其次是AS（0.48± 0.25%，n<$457）和稀释剂（0.23± 0.17%，n<$417）。相反，代表细菌遗传因子的质粒在感染者中的平均患病率（0.73 ±0.82%，n =17）高于AS（0.63± 0.26%，n=57）和疗效（0.35± 0.42%，n= 13）。此外，丰度占有分析鉴定了142种核心噬菌体病毒和17种非核心噬菌体病毒，包括几种致病性病毒。AS病毒组中的基因病毒。病原性病毒的持续存在，加上AS处理对病毒的不利去除，揭示了生物处理的生活污水中隐藏的病毒威胁。病毒持续存在的机制以及污水处理厂是病毒生存的潜在热点的可能性值得关注。©2021作者（S）。出版社：Elsevier B.V.代表中国环境科学学会这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍活性污泥（AS）是污水处理厂（WWTPs）最广泛采用的生物处理方法，由Arden和Lockett在英国曼彻斯特首次引入[1]，并在去除污染物（包括无机物，细菌和原生动物）方面发挥了关键作用[2]。通常，核心设计南方科技大学环境科学与工程学院，深圳，518055**通讯作者。南方科技大学环境科学与工程学院，深圳518055。电子邮件地址：yan.zheng@ sustech.edu.cn（Y。Zheng），xiay@sustech.edu.cn（Yu Xia）.1、同等贡献。包括曝气池、沉淀池和回流AS设备三部分简单地说，曝气池提供了滞留时间，并确保了污水在曝气池和AS中充分混合。经过一系列的生化反应，污染物被去除，污染物被转化为废水。虽然越来越多的证据表明它能够降低细菌的浓度[例如，粪便指示细菌（FIB）][3，4]，尽管人们一致认为WWTP是病毒储存库，其中一些是致病性的[5]，但对病毒清除效率的了解要少得多在污水处理厂发现的人类致病病毒包括腺病毒、肠病毒、轮状病毒、诺如病毒及多瘤病毒等。[6]。大多数DNA病毒是噬菌体，其通过形成微生物群落来影响WWTP性能[7，8]。到目前为止，人们一直致力于减少FIB和水质量指南[9，10]。https://doi.org/10.1016/j.ese.2021.1001052666-4984/©2021作者。由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表环境科学与生态技术期刊主页：www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.comX. Li，Z. 程角，澳-地 Dang等人环境科学与生态技术7（2021）1001052¼¼P1Cj×Lj由于上述细菌指标并不总是与水媒病毒相关[11]，病毒清除需要单独评估，研究报告的结果令人鼓舞，但也令人担忧。Ottoson等人发现，没有指示物预测处理过的废水中肠道病毒基因组的出现，但E.大肠杆菌、肠球菌和C.产气荚膜杆菌的去除与肠道病毒基因组的去除相关[12]。在日本进行的一项为期一年的调查（每月采样）显示，诺如病毒的清除在冬季和夏季之间差异很大[13]。 Ito等人证明了在第二次处理（物理沉降和生物过程）期间使用qPCR靶向诺如病毒（基因组I和II）的病毒类型依赖性清除[14]。令人鼓舞的是，Qiu et al.发现AS治疗大大减少了加拿大的八种人类致病病毒[15]。部分由于选择靶向FIB、某些细菌和一些充分研究的致病性病毒的低通量qPCR技术，AS治疗在整个社区水平上减少病毒的有效性尚不清楚。尽管已经通过高通量测序方法广泛研究了WWTP微生物组的细菌比例，以揭示处理相关的群落组装模式[16e18]，但WWTP的病毒组在很大程度上仍然未知。直到最近，全球海洋病毒组探索（GOV）[ 19 ]期间开发的方案才被引入调查WWTP中的病毒多样性。现在可以在特定病毒浓度、纯化和提取步骤的帮助下生成病毒数据集[20]。然而，只有少数研究使用这种复杂的病毒定量方法来研究WWTP中的病毒感染。Wang等人首次对活性污泥病毒组的病毒群落动态进行了长期评估[21]。他们发现AS病毒在香港冬季最多，启发我们分析全球污水处理厂生物二级污水处理过程中的病毒流行模式。据我们所知，还没有大规模的宏基因组学努力这样做。本研究通过分析的核心病毒前，期间，和后AS治疗，以阐明在整个社区水平的去除偏好为此，来自27个使用常规或改良AS处理的WWTP的119个WWTP 宏基因组 / 病毒组数据集首先从国家生物技术信息中心（NCBI）和使用子系统技术的元基因组快速注释（MG-RAST）公共服务器获得（详见SI和补充文件1）。使用改进的宏基因组学分析方法对污水、活性污泥和污水中的病毒流行率进行量化，以评估病毒去除效率。讨论了在污水处理厂生物二级处理过程中获得的关于病毒群落特征和风险管理意义的新见解。2. 材料和方法2.1. 宏基因组和病毒组数据在本研究中，从NCBI和MG-RAST下载宏基因组和病毒组NGS测序数据，包括来自12个不同国家（包括乌干达、美国、5个亚洲国家（中国、韩国、马来西亚、新加坡、东方类别）和5个欧洲国家（丹麦、意大利、斯洛文尼亚、瑞士、英国、西方类别）的27个WWTP的26个污水/污水样品、59个活性污泥样品和34个有效样品（见表S1、表S2和补充文件1）。支持性信息（SI）中描述了所有调查的污水处理厂的废水类型、配置和负荷能力特征。2.2.病毒识别和注释除了直接检索的组装重叠群之外，我们应用MetaSPAdes [22]和MEGAHIT [23]（>34 Gb原始读段）以默认设置组装后质量控制读段（fastp [24]寻址）只有长度超过1 kb的重叠群/支架才进行后续的病毒鉴定步骤。此后，我们使用最近发表的名为metaviralSPAdes的宏基因组病毒鉴定工具计算组装体数量并分析有效组装体[25]。简而言之，执行了名为viralVerify和viralComplete的两个步骤首先使用hmmsearch（HMMER 3.1b2）对Pfam-A数据库v30.0 [27]检索Prodigal [26]预测的基因在这里，我们只选择了在补充文件1中报告了组装体和病毒重叠群数量，在补充文件2中总结了将预测基因与Swiss-Prot数据库进行BLASTP比对[28]注释病毒蛋白质功能（图）。 S3）。具体而言，为了搜索病毒抗生素耐药基因（ARG），使用70%同一性和60%最小长度阈值，通过Rescue 3.2（基于DNA比对的方法）分析所有病毒组装体[29]。此外，我们还使用隐马尔可夫模型（HMM）来识别ARG。简单地说，hmmsearch用于注释ARG（Prodigal预测）与SARGfam数据库，具有收集截止值（-cut_ga）[ 30 ]。此后，使用KaKs_calculator 2.0和GMYN近似方法[ 31 ]，使用dN/dS比值评价作用于携带病毒的ARG的选择压力。简单地说，携带病毒的ARG的核苷酸序列与其最接近的命中（针对Resistance数据库）之间的MUSCLE比对用作KaKs_calculator 2.0的输入[32]。2.3.相对丰度计算由于直接下载的组装体（n 18）缺乏重叠群覆盖率值，因此仅使用101个原始读取数据集进行病毒定量计算。因此，在本研究中，对于给定的宏基因组/病毒组数据集，使用以下公式通过覆盖加权重叠群丰度计算病毒的相对丰度M病毒相对丰度i¼R ×NC是重叠群的覆盖度; L是相应重叠群的长度; m是病毒重叠群的总数;R是数据集的平均读段长度; N是数据集的读段总数我们还分别计算了污水处理厂位置（见表S4）和污水处理厂处理过程中的相对病毒丰度。由于特定的病毒浓缩和处理方法，斯洛文尼亚病毒的相对丰度远高于其他调查数据集;因此，我们在比较病毒流行率时排除了斯洛文尼亚、AS和有效性（以及进行主坐标分析）。我们还应用相同的策略来计算质粒相对丰度（仅靶向> 1kb片段）。2.4.统计分析所有119份样本的病毒鉴定结果均按独特和共有元素分组。用UpSet图和Venn图（R中的UpSetR和VennDiagram包）说明共享和唯一病毒。主坐标分析（PCoA）X. Li，Z. 程角，澳-地 Dang等人环境科学与生态技术7（2021）1001053¼¼¼¼基于主要病毒相对丰度的Bray-Curtis距离（平方根变换），为确保PCoA的统计学意义的置信度，排除了鉴定的病毒，如果1）分别存在于活性污泥或流出物样品中少于一半的活性污泥中;和2）在所有样品中表现出平均相对丰度小于0.001%。在置信水平0.68下绘制了不同组的椭圆，与纳入的最大样本数相比，类别之间的聚类模式不重叠。为了确定污水处理厂处理阶段之间是否存在统计学显著差异，使用具有9999个排列的“anosim”函数进行了ANOSIM。为了确定可以最好地区分WWTP病毒组处理阶段的病毒群体，我们使用了监督学习技术-Brei-man的随机森林算法（randomForest包）。斯洛文尼亚和马来西亚的数据集被排除在污水处理厂处理阶段的PCoA分析之外，因为它们显示出明显的批次效应，这可能是由斯洛文尼亚数据集的特殊病毒富集程序和马来西亚数据集的任意控制的测序深度引起的（表S1和补充文件1）。为了确定活化污泥中的世界性病毒，在占有率-丰度图中绘制了平均相对丰度大于0.001%的每个病毒种群（图1）。 1b）进行生态分区，以便于识别核心病毒和特殊病毒。在至少60%的东方（5个亚洲国家）和60%的西方（美国和欧洲国家）活性污泥中广泛分布的病毒种群[33]被定义为生态AS通才。3. 结果和讨论3.1. 相对病毒丰度从污泥到活性污泥和出水在119个污水处理厂样本中共鉴定出1779个独特病毒种群（212，310个病毒重叠群）（补充文件1和2）。正如预期的那样，72.2%的病毒是细菌性噬菌体或原噬菌体，证实了无论位置或处理配置如何，噬菌体和原噬菌体在污水处理厂中均占主导地位（图 S1和S2）[7]。病毒相对丰度的平均值0.84±1.59% （ n87 ）， 从 0.23 ±0.17% 增加 到 2000 年（ n17），至0.48± 0.25%（n57)在活性污泥中，有效期为3.21± 3.26%（n13）。为了保证宏基因组分析的质量，将丰度低的质粒（如病毒）的相对丰度封闭以进行比较（图1B）。 1 a）。参与者展示了质 粒 感 染 率 最 高 （ 0.73± 0.82% ， n= 17 ） ， 其 次 是 活 性 污 泥（0.63± 0.26%，n= 57）和流出物（0.35± 0.42%，n ¼13）。3.2.活性污泥中的病毒多面手与非细菌宿主病毒在 所 有 57 个AS 样 本 中 ， 159 个AS 主 要 病 毒 群 体 （ 相 对 丰度>0.001%）被鉴定为广泛分布于污水处理厂的世界性基因组（图11）。 1 b）。这些AS核心病毒中的绝大多数（159个中的142个）是可感染的，感染了54个细菌属（见补充文件3）。这些属通常在人类和动物肠道微生物群中观察到，突出了肠道微生物群和WWTP病毒组之间的紧密联系。一般来说，正的丰度-占有率关系已被认为是许多尺度上广泛的宏观生态分布模式[34]。然而，在这项研究中没有观察到这种模式，这些细菌种群根本不丰富（平均丰度低于主要病毒丰度分布的第三分位数，图1b），反映了AS中细菌的广泛多样性（主要宿主种群）[16]。几种影响单细胞原生动物的大型DNA病毒也在AS病毒generalist中被鉴定出来。（完整的AS病毒通才名单载于补充文件3），这些病毒包括：1）四种感染各种土壤/水生境中的变形虫的巨型DNA病毒（平均丰度为0.00063%~ 0.0029%）; 2）6种感染藻类的大DNA病毒（平均丰度范围为0.00027%至0.0019%）; 3）从Halorubrum属中分离的1株Halovirus毒株HRTV-5（平均丰度为0.00040%± 0.00053%）[35]。在17种非细菌宿主病毒中，确定了动物和人类特异性病毒（表S3）：1）三种影响野生鸟类的禽痘病毒（水生鸟类传染性病毒1型显示出>0. 02%的高流行率，在香港沙田污水处理厂有两次，图S4）。 在研究的活性污泥样品中，该病毒的平均丰度高达0.0027% ±0.0046%;2）一种蛙病毒株（欧洲鲶鱼病毒，0.0013%±0.0022%），导致鲶鱼业的高死亡率; 3）浣熊痘病毒，0.00068%± 0.00086%，显示天然肿瘤嗜性，无人类致病性，因此可作为溶瘤病毒用于临床肿瘤治疗; 4）一种病毒株（墨鱼颗粒病毒，0.00023% ±0.00017%），感染地理上广泛分布的蛾。生物处理过程中常见的动物（禽类和鱼类病毒）和人类（浣熊痘病毒）特异性病毒表明存在潜在的病毒威胁，因为宿主特异性水传播病毒可能导致人类和/或其他动物的多种疾病[36]。此外，我们在AS和流出物样本中检测到人类致病病毒的零星可信信号，包括2009年3月收集的香港沙田污水处理厂AS中SARS病毒人类冠状病毒HKU 1（HCoV-HKU 1）的部分命中率为0.000066%，2018年之前收集的韩国光州污水处理厂流出物中为0.00001.5%和0.000029%，这意味着有可能使用污水病毒组监测病毒在社区中的传播[37]。3.3.感染者、AS和感染者中尽管基于RNA测序的有效样本有三个离群值[38]，但感染者、AS和有效样本的病毒特征在PCoA中显示出显著的分离（p <10 - 4，ANOSIM）（图11）。2），表明不同的病毒组成。结果显示，AS样品中的病毒数量（977个病毒）高于污染物（872个病毒），表明活性污泥处理可以改变病毒群落，并可以作为一个独特的病毒来源[39]。基于随机森林分析，我们确定了9个噬菌体群体（补充文件4）作为AS分离的主要驱动因素（图2），在实验室和实验室中。布里氏菌、芽孢杆菌属噬菌体、克罗伊氏菌属噬菌体、曼氏菌属噬菌体、分枝杆菌属噬菌体和根瘤菌属噬菌体在污水处理厂废水中更普遍，而剩余的乳杆菌属噬菌体和聚球藻属噬菌体在活性污泥中突出，假单胞菌属噬菌体和玫瑰球菌属噬菌体在废水样品中突出[7]。3.4.病毒性ARG威胁最近，由于人类健康问题，在WWTP系统中广泛研究了 ARG[40e42]。HMM检索发现，共有1002个ARG携带病毒重叠群，抗生素主要包括夫西地酸（平均丰度为0.070%）、多粘菌素（0.055%）、四环素（0.045%）、万古霉素（0.044%）和X. Li，Z. 程角，澳-地 Dang等人环境科学与生态技术7（2021）1001054Fig. 1. （A）箱形图显示了从19个WWTP获得的污泥、活性污泥和流出物样品的病毒丰度（a1）和质粒丰度（a2）的比较。菱形代表平均值。星号表示显示显著（P值0.05）变异的<（b）37个东部（x轴）和24个西部（y轴）活性污泥（AS）样品中病毒群体的占有-丰度图仅显示平均相对丰度大于0.0010%的病毒群体圆圈的大小与相应病毒群体的平均相对丰度成比例。在至少60%的东方（5个亚洲国家）和60%的西方（美国和欧洲国家）AS中确定了AS病毒多面手（159个病毒群体）。喹诺酮（0.015%）等。铜绿假单胞菌、弧菌和聚球藻是主要的ARG携带菌群（图3a）。使用同源性为基础的方法，我们检测到10个病毒的ARG重叠群，所有这些都属于病毒。检测到具有多药耐药操纵子的两个病毒重叠群（图1B）。 3 b），其中ARG与整合酶活性密切相关。噬菌体编码的ARG的这种整合酶激活的移动性的发现增加了病毒驱动的移动ARG操纵子的不断增加的库[43e45]，其流行性和持久性现在可以在进一步的研究中进行调查。此外，本研究中鉴定的携带病毒的ARG的dN/dS比率较低（图11）。3 b）支持WWTP病毒组中抗生素抗性的负选择[46]。总之，尽管检测频率较低[47，48]，但ARG在病毒基因组上的持久性（由阴性选择表示）与病毒转导以及整合酶所实现的ARG迁移性相结合，表明了不可忽略的病毒对污水处理厂抗性基因组的影响3.5.活性污泥处理不利于去除在污水、活性污泥和流出物样品中，病毒和质粒的流行率对比（图1）。1）提供了明确的证据，有效的细菌去除活性污泥处理，但较差的病毒去除。 评估污水处理厂中的病毒去除是具有挑战性的，充满了方法上的不确定性。通过qPCR靶向指示病毒，研究表明病毒的发生与季节密切相关，一些研究表明病毒的清除与污水处理厂的容量无关[13，49]。污水处理厂病毒去除过程的复杂性也通过病毒去除效率和处理水力停留时间之间的弱相关性来说明，但与基因组大小、衣壳蛋白和消毒策略的相关性是X. Li，Z. 程角，澳-地 Dang等人环境科学与生态技术7（2021）1001055图二、 主坐标分析（PCoA）图描绘了来自不同WWTP处理阶段的样品的病毒组成之间的Bray-Curtis距离。 椭圆是在0.68的置信水平下绘制的。结果表明，病毒分型的相似性分析（