如何构建质粒做异源表达
时间: 2023-03-14 20:32:43 浏览: 73
答:质粒异源表达可以通过逆转录PCR(RT-PCR)和聚合酶链反应(PCR)来构建。RT-PCR的步骤包括在模板RNA上进行反义转录,然后使用特异性引物对转录产物进行扩增,最后将扩增产物用于质粒克隆。PCR的步骤包括使用双向引物对模板DNA进行扩增,然后将扩增产物用于质粒克隆。
相关问题
ncbi查找目的基因序列_手把手教你调取目的基因mRNA并构建质粒(上)
在NCBI网站上查找目的基因序列并构建质粒需要以下步骤:
1. 打开NCBI网站,进入NCBI数据库的Nucleotide页面。
2. 在搜索栏中输入目的基因的名称或基因序列的Accession号码,点击搜索按钮。
3. 筛选结果,选择符合要求的基因序列。
4. 下载基因序列的mRNA序列,保存为FASTA格式文件。
5. 在网上寻找合适的质粒载体,下载其序列文件,保存为FASTA格式文件。
6. 利用DNA编辑软件,如ApE或SnapGene,将目的基因mRNA序列和质粒载体序列导入软件中。
7. 在软件中进行序列比对,找到合适的限制性内切酶,利用此酶进行DNA分子的切割。
8. 将目的基因mRNA序列与质粒载体序列进行连接,构建目的质粒。
9. 进行目的质粒的测序验证,确保目的基因已经成功克隆至质粒中。
10. 利用目的质粒进行转染实验,验证目的基因的功能。
以上是构建目的基因质粒的大致步骤,需要注意的是,在选择合适的质粒载体和限制性内切酶时,需要考虑目的基因的长度和特殊序列,确保能够成功进行连接。
实验项目:将用于大肠杆菌表达的GFP基因克隆到pET21a或pET28a表达质粒
这是一个分子生物学实验项目,将绿色荧光蛋白(GFP)基因克隆到大肠杆菌表达质粒 pET21a 或 pET28a 中。具体步骤如下:
1.设计引物:根据 GFP 基因序列设计引物,分别引导 GFP 基因的扩增和表达质粒的线性化。
2.扩增 GFP 基因:通过 PCR 扩增 GFP 基因,使用引物将 GFP 基因扩增至适当大小。
3.线性化表达质粒:将表达质粒 pET21a 或 pET28a 线性化,以便将 GFP 基因插入其中。
4.连接 GFP 基因和表达质粒:使用连接酶将 GFP 基因连接到线性化的表达质粒上。
5.转化大肠杆菌:将连接好的表达质粒转化到大肠杆菌中,通过培养和筛选获得成功表达 GFP 的大肠杆菌菌株。
注意事项:
1.在实验过程中需要保持无菌操作,避免污染。
2.引物设计需要仔细考虑,确保引物能够正确地扩增 GFP 基因。
3.表达质粒需要正确的线性化,否则无法插入 GFP 基因。
4.转化大肠杆菌需要注意细节,例如转化条件、培养条件和筛选条件等。