家蚕新基因Bm-WJ的功能研究进展

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"家蚕一新基因的克隆表达及相关功能研究" 本文主要涉及的是家蚕生物学领域的科研工作，特别是对一种新的家蚕基因——Bm-WJ的克隆、表达和功能探究。研究人员从实验室构建的cDNA文库中成功克隆到一个长度为474bp的基因，该基因编码157个氨基酸。通过对NCBI数据库的同源性比对，确定此基因是家蚕中未被识别的新基因，并命名为Bm-WJ。为了深入研究Bm-WJ的功能，科研团队将其插入表达载体pET-28a中，构建了重组质粒。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达此融合蛋白，并通过纯化过程制备多克隆抗体。接着，他们采用荧光Western blotting技术分析了Bm-WJ在不同组织和发育阶段的表达水平，发现其在生殖器和蛾期的表达量最高，而在丝腺和卵期最低。同时，通过实时荧光定量PCR的方法，进一步证实了这一转录水平的差异。此外，研究人员还进行了Bm-WJ的亚细胞定位，结果显示该蛋白在家蚕Bm5细胞中广泛分布，细胞核内的浓度略高于细胞质。这些发现表明Bm-WJ可能在家蚕的生殖发育过程中扮演重要角色，但其具体功能仍需通过更多实验来确证。家蚕作为丝绸产业的关键物种，具有重要的经济和科学研究价值。基因组学和蛋白组学的研究为揭示家蚕生物学特性提供了有力工具。文中提及，自从20世纪初，家蚕的遗传图谱就开始构建，随着技术的发展，物理图谱如限制性图谱和FISH等提高了图谱的精确度和分辨率。随着家蚕全基因组序列的测定和多种基因组计划的实施，RNA干扰、转基因及DNA芯片等技术的应用，为家蚕功能基因组学研究提供了强大的平台。家蚕蛋白组学的研究同样重要，它可以帮助我们理解家蚕的生理过程、代谢途径以及对环境的适应性。通过对新基因Bm-WJ的深入研究，科学家们有望揭示更多关于家蚕生长、发育和繁殖的分子机制，从而为丝绸产业的改良和优化提供理论支持。

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透析除盐后冻干浓缩于-20°C 保存备用。将冻干浓缩的融合蛋白用反相 FPLC 纯化试剂溶液

A（含 0.1%TFA 的 5%乙腈溶液）进行溶解后注射入反向柱，其间需用 B 溶液（含 0.085%TFA

的 95%乙腈溶液）进行洗涤，整个过程由 FPLC 系统 AKTA Explorer（Amersham Biosciences）

自动运行，流速为 1 个柱体积/min。将自动收集的馏分在真空干燥机内冻干浓缩，部分样品

用 Q Trap LC/MS/MS System（Applied Biosystems）进行 EMS（Enhanced MS）分析，测定

该融合蛋白的分子量，其余样品于-20°C 保存备用。

2.2.4 抗体的制备与纯化

将冻干浓缩的融合蛋白用 PBS 重溶，用 Brandford 法进行定量，使其浓度达到 2mg/ml

左右。取 0.5ml 的蛋白液（内含约 1mg 融合蛋白）与等体积的弗氏完全佐剂混合，剧烈振

荡，直至乳化液入水不散开，说明乳化完全，即可作为首次免疫用抗原。以后每隔 10 天加

强免疫一次，每次抗原量减半，用弗式不完全佐剂进行乳化，共加强免疫 3 次，最后一次免

疫后第十天用颈部取血的方式取得抗血清。用 HiTrap Protein A HP 凝胶柱对抗血清进行纯

化，具体操作按照使用说明进行。然后用间接 ELISA 的方法

[18]

测定该抗体的效价，并且用

Western blotting 方法鉴定该抗体跟重组菌诱导总蛋白和纯化的融合蛋白之间的抗体特异性。

2.2.5 Western blotting 检测

为了研究Bm-WJ在家蚕不同组织和不同发育阶段的表达情况，我们解剖得到了家蚕五龄

幼虫的丝腺、脂肪体、头部、表皮、气门、马氏管、肠、生殖器八个组织。然后将这八个组

织样品和家蚕卵、幼虫、蛹、蛾四个发育阶段的样品分别用液氮充分研磨成粉末，用适量的

蛋白提取裂解液（50 mM Tris-HCl pH 8.0， 150 mM NaCl， 5 mM EDTA， 1 mM DTT， 0.5%

NP-40， 0.5% 脱氧胆酸钠，临用前加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度100 µg/ml）溶解，冰

上放置30 min，12000 rpm，4℃离心15 min，上清即为总蛋白溶液，然后用

Bradford

法对各

个时期和组织的总蛋白进行定量，保证电泳时样品中的总蛋白含量一致。将已经定量的各个

组织和时期的蛋白样品进行SDS-PAGE，用电转仪将总蛋白转移到PVDF膜上，PBS清洗后

用封闭液（含5%牛血清蛋白的PBS）室温封闭2h，PBST洗涤三次后加Bm-WJ抗体（1:500）

4°C孵育过夜，PBST洗涤三次后加荧光标记的羊抗兔二抗（1:1000）37°C避光孵育1h，PBST

洗涤三次后用去离子水漂洗2次，最后用700 nm红外激光扫描仪扫描PVDF膜进行观察。

2.2.6 实时荧光定量 PCR

为了研究 Bm-WJ 在家蚕不同组织和不同发育阶段的转录情况，我们提取了家蚕五龄幼

虫的丝腺、脂肪体、头部、表皮、气门、马氏管、肠、生殖器八个组织和卵、幼虫、蛹、成

虫四个发育阶段的总 RNA，利用 One-step SyberGreen 荧光定量 PCR 试剂盒配制 RT-PCR 反

应体系，在 ABI Prism 7300 Real Time RT-PCR System（Applied Biosystems）进行检测。我

们根据实验需要，用 primer premier 5.0 软件分别设计了基因 Bm-WJ 和内参 18S rRNA 的荧

光定量 PCR 引物，具体引物如下：Bm-WJ 的引物为 5′-GAAATTGCCTGCAGTGCCCCA -3′

和 5′-TATTGATTGCGTAGATTGAATGACA-3′；18S rRNA 的引物为 5′-CGATCCGCCGACG

TTACTACA-3′和 5′-GTCCGGGCCTGGTGAGATTT-3′。RT-PCR 的具体热循环程序如下：

50°C 反转录 3min；95°C 预变性 5min；95°C 变性 15s，58°C 退火 15s，72°C 延伸 30s，共

循环 40 次。最后对仪器自动记录的数据用-∆∆CT 值的方法进行分析

[19]

。

2.2.7 亚细胞定位

家蚕 Bm5 细胞在激光共聚焦显微镜专用培养皿中培养过夜，弃去培养基，用 PBS 洗涤

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