RISC的形成、作用和降解──小RNA调控基因表达的机制及其进展

会审查RISC的生命：RNA诱导沉默复合物的形成、作用和降解Hiro-oki Iwakawa1，* and Yukihide Tomari1，2，*1东京大学定量生物科学研究所RNA功能实验室，东京都文京区，东京113-0032 2东京大学研究生院前沿科学研究科计算生物学与医学科学系，东京都文京区，东京113-0032* 通信：iwakawa@iqb.u-tokyo.ac.jp（H.- o.I.），tomari@iqb.u-tokyo.ac.jp（Y.T.）https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.11.026总结小RNA通过在转录和转录后水平抑制靶基因的表达来调节多种生物学过程为了实现这些功能，小RNA与Argonaute（AGO）蛋白家族的成员一起形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。RISC通过其结合的小RNA定向靶向互补RNA，并通过mRNA切割、降解和/或翻译抑制来抑制它们的表达。许多不同的因素微调RISC的活性和稳定性-从向导-靶RNA互补性到其他蛋白质伴侣的募集到RISC本身的翻译后修饰在这里，我们回顾最近的进展，了解RISC的形成，行动和退化，并讨论新的，有趣的问题在该领域。介绍一个小RNA遇到了它的命运伙伴蛋白Argonaute（AGO），并开始了抑制靶信使RNA（mRNA）表达的旅程。陪伴者将两者结合在一起，各种各样的配角出现在他们的故事中，直到他们被摧毁。这个传奇故事的某些版本已经持续了数十亿年，现在已经在生命之树上分支开来，形成了细胞如何调节基因表达的一个组成部分。小RNA大致分为三类：microRNA（miRNAs）、小干扰RNA（siRNAs）和P-元件诱导的睾丸萎缩（PIWI）相互作用RNA（piRNAs）。miRNA是由动物中的RNase III酶Drosha和Dicer或植物中的DICER-LIKE（DCL）从具有发夹样结构的前体转录物加工而来，并调节内源基因的表达（Song和Rossi，2017;Ha和Kim，2014）。siRNA通过Dicer/DCL从双链RNA（dsRNA）加工而来，并介导靶RNA的切割（Song和Rossi，2017）。piRNA在动物生殖系细胞中在转录和转录后水平上抑制转座因子中起关键作用，而它们的生物发生机制仍然是一个活跃的研究领域（Czech等人，2018年）。这些小RNA中的每一种与AGO蛋白家族的成员一起形成核糖核蛋白复合物，称为RNA诱导沉默复合物（RISC）。真核生物通常具有多个具有不同功能的AGO家族蛋白;因此，每个AGO通常对具有特定特征的小RNA具有其自身的在过去的20年里，RISC的组装、功能和降解机制得到了广泛的研究然而，这些进程中的许多重要问题仍然没有得到解决，30 Molecular Cell82，2022年1月6日，2021年Elsevier Inc.细节不断被揭露。在这里，我们总结了我们目前对RISC从出生到死亡的生活的理解，重点是动物和植物中的miRNA和siRNA途径，并讨论了最近研究中出现的新问题。RISC的诞生为了调节靶基因表达，小RNA和AGO蛋白需要组装RISC（图1）。在加载步骤中，小RNA双链体被掺入AGO蛋白中，形成称为pre-RISC的中间复合物。在成熟步骤中，双链体的过客链从AGO中排出，而另一条链保持与AGO形成RISC结合，并作为其沉默靶RNA的指导。在下面的部分中，我们将回顾RISC“诞生”的机制AGO的结构域和结构性质AGO 蛋白 由四个 结构 域（N- 末端 （N ）、PIWI-AGO-Zwille（PAZ）、中间（MID）和PIWI结构域）和两个接头（L1和L2）组成。L1接头直接连接N和PAZ结构域。L2接头增强N-L1-PAZ结构并将其与MID-PIWI叶连接（Naka-nishi等人，2012;Schirle和MacRae，2012; Elkayam等人， 2012; Wang等人，2008年）。MID和PAZ结构域各自形成一个口袋，其识别分别将引导链（Song等人，2003; Ma等人， 2005; Parker等人，2005年）。PIWI结构域采用RNA酶H折叠（Song等人，2004年）。许多但不是所有的AGO蛋白在PIWI结构域中具有保守的Asp-Glu-Asp-His/Asp（DEDH/D）催化四分体，其进行一些过客链的内切核酸裂解以排出它们，并且随后裂解互补的靶RNA以进行基因沉默（Naka nishiet al. 2012年）。会审查分子细胞82，2022年1月6日31图1. RISC汇编(A) RISC组件的示意图一个空Argonaute（AGO）在Hsp 70/Hsp 90分子伴侣机制的帮助下加载小RNA双链体以形成pre-RISC。然后，1股称为乘客股（蓝色）是从AGO弹出。由AGO 和引 导链 （红色 ）组 成的 复合物 称为 成熟RISC ， 或 简 称 RISC 。 AGO 由 4 个 域 组 成 ： N 、PAZ、MID和PIWI。引导物的50端锚定到 MID结构域中的50结合口袋中，而引导物的30端结合到PAZ结构域中的30在RISC组装过程中，AGO经历动态构象变化。空的AGO最初采用“封闭"形式。伴侣机制的结合使AGO处于在分子伴侣辅助的小RNA装载和passenger排出后，AGO在成熟RISC中采用“半开放”构象。请注意，pre-RISC的一致性尚未直接分析 。 仅 在 果 蝇 Ago2 中 观 察 到 单 分 子 构 象 变 化（Tsuboyama等人， 2018年）。然而，其他AGO也可能经历类似的构象活化，因为Hsp 70/Hsp 90辅助的 RISC 组 装 是 动 物 和 植 物 中 普 遍 存 在 的 机 制（Iwasaki et al.， 2010; Miyoshi等人， 2010; Iki等人， 2010年）。(B) RISC成熟的示意图。插图：小RNA双链体中的错配或过客链的切割促进过客链排出。N和PAZ结构域在RISC成熟中协调起作用。在加载小RNA双链体后，N结构域起楔形作用以撬开小RNA双链体。然后，PAZ结构域锚定引导链的30末端，并充当手柄以进一步剥离过客链。该模型基于TtAGO-引导DNA-靶RNA的三元结构和动植物的生化分析RISC（Wang等人， 2009; Kwak和Tomari，2012; Park和Shin，2015; Derrien等人， 2018; Gu等人， 2012; Matranga等人， 2005; Rand等人， 2005; Miyoshi等人， 2005; Kawamata等人，2009; Yoda等人，2010年）。小RNA装载小RNA装载是由分子伴侣机制介导的复杂的动态过程，所述分子伴侣机制包括两种核心ATP酶，Hsp70和Hsp90，以及它们的共分子伴侣（图1A）（Iwasaki等，2010; Miyoshi等人，2010; Iki等人，2010年）。对于已被充分研究的果蝇Ago2，Hsp70首先结合并瞬时撬开空Ago2的否则封闭的结构。然后，Hsp90加入复合物并稳定Ago2的开放活性构象。最后，Ago2接受小RNA双链体并沉降成半开放形式（Tsuboyama等人，2018年）。除了这些分子伴侣因子之外，果蝇Ago 2还需要Dicer-2/R2D2异二聚体来装载小RNA（Iwasaki等人，2015）。然而，人RISC组装可以用小RNA、AGO和5种分子伴侣因子：Hsp90b、Hsc70、Hop、Dnaja2和p23来重建（Naruse等人，2018年）。小RNA负载的这些Dicer非依赖性和Dicer依赖性机制之间差异的原因尚不清楚。我们推测，空形式的果蝇Ago 2比其他一般的AGO蛋白更小RNA双链体进入AGO的加载方向决定了两条链中的哪一条将成为成熟RISC中的向导。这种链选择是不对称的，主要由以下决定：小RNA双链体两端之间的热力学稳定性差异（Schwarz等，2003; Khvorova等人，2003年）。优选选择其5°在果蝇Ago 2途径中，这种热力学稳定性首先被Dicer-2/R2D2异二聚体感知;R2D2结合双链体的更稳定末端，而Dicer-2结合不太稳定的末端（Tomari等人， 2004），其被认为导致预定向双链体转移至Ago2。相比之下，哺乳动物AGO蛋白本质上感知小RNA双链体的热力学不对称性（Suzuki et al.，2015）。该模型得到了结构研究的支持;为了使小RNA双链体适合AGO的50结合口袋，双链体一端的碱基对必须由于空间位阻而断裂（Parker等人，2005;Wang等人， 2009）;因此，优选地选择具有更热动力学可接近的端部的股线作为引导件。预期相同的机制适用于其它AGO，包括蝇Ago 2，因为50结合口袋是很好地保守的（Bo-land等人，2010年）。除了热力学稳定性之外，由AGO的MID结构域中的核苷酸特异性环识别的50端核苷酸的身份也影响链选择（Frank等人， 2010年）。因此，多种机制决定选择小RNA双链体的哪条链作为引导链。Hsp90Hsp7032分子细胞82，2022会审查图2. RISC目标识别(A) 引导物（红色）和靶标（蓝色）之间碱基配对的示意图。在RISC组装后，引导链被分成4个功能结构域：种子区（g2种子区是靶标识别所需的;中心区对于靶标切割是重要的;补充区稳定靶标结合;尾区调节RISC的功能和命运。种子和补充区域容纳在相应的室中（Sheu-Gruttadauria等人，2019年）。这些腔室彼此相邻，可以通过靶RNA的1 - 15-nt环桥接在t1（t1A）处的腺嘌呤残基增强RISCB通过水介导的与t1A的相互作用结合识别口袋(B) 动物中的典型和非典型靶位点。非典型结合位点在种子区中具有错配（阴影框），并且需要在30互 补 区 中 的 额 外 碱 基 配 对 以 稳 定 结 合 。 ‘‘B’’indicates nu- cleotides other than adenine(A)和（B）代表人AGO2和动物中其它负载miRNA的AGO的靶识别果蝇Ago1）（Bartel，2018）。植物AGO、蝇Ago 2和PIWI-进化枝AGO蛋白需要更广泛的碱基配对以实现稳定的靶标结合（Iwakawa和Tomari，2013; Wee等人，2012; Anzelon等人，2021年）。许多生物体拥有一种以上的AGO蛋白，通常具有不同的功能，强调了AGO和它们结合的小RNA类别之间特异性的重要性。在果蝇中，miRNAs和siRNAs根据其结构差异分别被分为Ago1和Ago2。广泛碱基配对的小RNA双链体如siRNA被Dicer-2/R2D2复合物结合并加载到Ago 2中。相反，中心错配的双链体如miR-NA不能结合Dicer-2/R2D2，而是优先加载到Ago 1中（Foürstemann et al.， 2007; Tomari等人， 2007; Kawamata等人，2009年）。小RNA（在植物和果蝇中）的核苷酸的同一性和大小也影响小RNA分选（Takeda等人，2008; Montgomery等人，2008; Mi等人，2008; Ameres等人，2011年）。相比之下，哺乳动物中的四种AGO蛋白似乎不基于核苷酸同一性或结构特性选择小RNA双链体（Liu et al.，2004; Ender等人，2008年; Azuma-Mukai等， 2008; Hafner等人， 2010），尽管有一些证据可将特定的小RNA分选成特定的AGO（Bur roughsetal.，2011; Yamakawa等人， 2014年）。RISC成熟一旦小RNA双链体与AGO结合，过客链必须被排出以形成成熟的RISC（图1B）。TtAGO（Thermus thermophilusAGO）的结构表明，N结构域破坏了向导序列在 靶 识 别 过 程 中 的 链 （ Wang 等 人 ，2009），这表明N结构域在乘客弹射的初始步骤中起着打开小RNA双链体的楔形物的作用。N结构域的突变损害了miRNA的乘客链排出，人AGO 2、果蝇AGO 1和阿拉伯糖酵母AGO 1中的siRNA双链体（Kwak和Tomari，2012; Park和Shin，2015; Derrien等人，2018年）。PAZ结构域的缺失也损害了passenger链排出（Guet al.，2012）;认为PAZ结构域的枢转旋转（其紧密结合引导链的30末端）促进已被N结构域预先打开的双链体的分离。一些AGO，包括人AGO 2、果蝇Ago 2和植物AGO 1，具有强的切割活性（Hammond等人，2000; Okamura等人，2004; Liu等 人 ， 2004 年 ; Meister等 ， 2004; Baumberger 和Baulcombe，2005），其在与引导链的核苷酸10（g10）和11（g11）相对的位置切割过客链（Matranga et al.，2005; Rand等人，2005; Miyoshi等人，2005年），并促进乘客链的释放。在AGO缺乏强的核酸内切活性或其他因素阻止过客切割的情况下，g2-g8和g12-g15内的错配促进过客链的排出（Kawamata etal. 2009; Yoda等人，2010年）。行动的RISC成熟的RISC结合与其向导互补的靶mRNA（图2），并通过切割它们或招募介导翻译抑制和/或去稳定化的蛋白质来沉默它们的表达，这取决于向导-靶互补性和靶mRNA的表达。一分子细胞82，2022年1月6日33会审查B由每个特定AGO募集的一组其他效应物（图3）。在这里，我们总结了目前的RISC目标识别和调控基因表达的机制的理解。靶mRNA的识别RISC中的小RNA在功能上分为4个结构域：种子区、中心区、补充区和尾区（图2A）。种子区包括从引导链（g2-g8）的50端起的第2至第8个核苷酸，其对于靶RNA的识别是关键的;中心区（g9-g12）对于靶RNA和过客链的切割是重要的;补充区（g13-g17）稳定靶结合;和尾区（g18-g17）稳定靶30e和d）如果对数据集进行重新定义，招募额外的因素，并决定RISC的命运RISC通过将包含g2-g5的种子区的第一区段预组织成溶剂可接近的A型螺旋来发现靶标，从而显著增加靶标结合的速率（Chandradoss等人，2015;Salomon等人，2015）。g2-g5中的碱基配对触发人AGO 2中HLA-7的移动，允许碱基对延伸至g8，其将30互补区（g13-g17）重新定位为接近A-型（Schirle等，2014年）。由于引导链的50末端（g1位置）对接到AGO的50结合口袋中，因此它不与靶链的30尽管如此，在t1（t1A）的腺嘌呤残基通过水介导的与由L2接头和MID结构域形成的口袋的相互作用增加RISC在靶mRNA上的停留时间的AGO（Schirle等人， 2015）。图3. miRNA相关RISC在动物动物中的miRNAs通过多种机制沉默靶基因RISC通过AGO中的色氨酸（W）结合口袋和GW 182中的甘氨酸-色氨酸（GW）重复之间的相互作用结合GW 182(A) GW 182通过募集去腺苷化复合物CCR 4-NOT和PAN 2-PAN 3以及去帽因子（包括去帽酶DCP 2）来使靶mRNA不稳定。最后，XRN1以50到30的方向降解去帽mRNA。(B) 动物RISC通过重组翻译抑制剂如DDX 6、4 E-T和4 EHP抑制翻译起始，这些抑制剂被假设靶向eIF4 E或eIF 4G。动物RISC还诱导PABP（一种翻译增强子）从靶mRNA的poly（A）尾解离此外，RISC可以诱导不依赖于GW182的起始因子eIF4A的解离。这些模型主要基于人类、苍蝇和蠕虫的生化研究（Duchaine和Fabian，2019）。哺乳动物RISC的最高亲和力靶标与g2-g8以及在残基t1处的腺嘌呤具有完美的互补性除了8-mer位点之外，与g2-g8（（图2B）（Bartel，2018）。虽然种子中带有错配的非典型位点可以被RISC结合，并且通常使用交联和其他方法检测（Chi等人， 2009，2012; Hafner等人， 2010; Helwak等人， 2013;Loeb等人， 2012; Grosswendt等人，2014），它们具有低得多的亲和力，并且需要沿着引导物更广泛的碱基配对（Beckeretal.， 2019），基本上不清楚细胞后果。酵母和人RISC之间的结构相似性表明，上述动物miRNA靶识别过程在真核RISC中基本上是保守的（Naka-nishi等人，2012;Schirle和MacRae，2012; Elkayam等人，2012年）。然而，对于稳定结合的引导链和靶RNA之间的互补性的要求在不同RISC中显著不同。例如，中心区和尾区中的错配损害靶与果蝇Ago2的结合，所述果蝇Ago2是抗病毒siRNA效应子（Wee et al.，2012年）。植物AGO 1通常负载50U 21-nt miRNA和siRNA，也需要广泛的碱基配对以稳定结合和切割靶RNA（Iwakawa和Tomari，2013）。单独的种子配对不足以稳定靶结合的事实可能有利于确保这些RISC沉默的保真度。最近来自海绵Ephydatiafluviatilis（Ef Piwi）的PIWI-进化枝AGO蛋白的冷冻电子显微镜结构证明，与人AGO 2相比，Ef Piwi产生较弱的种子，并且需要更长的配对用于靶结合（Anzelon et al.，2021年）。同样的机制可能适用于那些需要一34分子细胞82，2022会审查广泛的互补性，但未来的结构研究是必要的。RISC的靶识别通过翻译后修饰来调节全基因组CRISPR筛选鉴定了ANKRD 52-PPP 6C磷酸酶复合物和CSNK 1A 1激酶作为人 细 胞中 miRNA 介 导 的沉 默 的 调 节 剂（ Golden et al. 2017年）。人AGO 2被认为在PIWI结构域中高度保守的S824-S834簇处经历磷酸化循环，调节其靶结合活性。不可磷酸化的人AGO2显示出显著扩增的靶库，但对单个靶RNA的沉默效率降低（Golden等人， 2017年）。 秀丽隐杆线虫AGO蛋白ALG-1具有相同的保守丝氨酸/苏氨酸簇，并且过度磷酸化突变体包括其与靶mRNA的结合（Que ′ villon Huberdeau等人， 2017年）。因此，靶结合的磷酸化介导的调节可能在动物AGO中广泛保守。除了向导-靶标互补性和AGO翻译后修饰之外，已经报道了许多其他因素来调节靶标识别。高通量生物化学分析显示，种子区内靶RNA的二级结构改变RISC缔合动力学（Becker et al.，2019年）。RNA结合蛋白（RBP）也可以积极或消极地控制RISC靶向。例如，Pumilio-1（Pumilio 1）与Pumilio反应元件（PRE）结合，该Pumilio反应元件与p27 mRNA上的miR-221-和miR- 222-结合位点形成茎环结构，从而打开miRNA结合位点并增强RISC靶向（Kedde et al. 2010年）。还报道了PCBP2和FUS增强miRNA靶向（Lin等人， 2016; Zhang等人， 2018），而其他RBP如Dnd 1、RBM 38、CRD-BP和IMP 2似乎抑制RISC接近其靶位点（Kedde等人， 2007年; Le 'veille'等人，2011; Elcheva等人，2009; Degrauwe等人，2016）。靶位点的位置也影响RISC结合和沉默效率。一般来说，30UTR中的miRNA结合位点比50UTR或开放阅读框（ORF）中的那些更有效（Grimson et al.，2007; Moretti等人， 2010; Lytle等人，2007年）。尽管它们的效率较低，但许多ORF和50UTR位点导致可检测的阻遏（Lytle等人，2007; Baek等人，2008; Hafner等人，2010年）。这些位置效应可以通过RISC执行其功能的时间和移位核糖体以从mRNA中去除RISC的时间之间的平衡来解释，这取决于miRNA结合位点的位置 植物miRNA对位置效应不太敏感，可能是因为它们在核糖体到达之前快速切割靶RNA（Liuet al.， 2014; Addo-Quaye等人， 2008; German等人， 2008;Allen等人， 2005年）。相比之下，动物miRNA需要更长的停留时间，因为它们将许多调节蛋白募集到靶mRNA以实现沉默。因此，它们在核糖体不能到达的30 UTR中更有效。终止密码子下游约15 nt内的靶位点，即终止核糖体占据的区域，对动物miRNA功能不太有效（Grimson et al.， 2007年）。然而，在某些情况下，翻译可能是miRNA沉默的积极影响因素，这归因于核糖体去除RNA二级结构的能力（Ruij-tenberg等人， 2020年）。因此，翻译状态可以动态改变miRNA的靶库和RNA沉默的效率。给 定mRNA 上 的靶 位 点的 数 目也 影响 动 物中 的 沉默 效 率（Doench等人，2003年）。通常，每个结合位点独立地起作用，并且沉默效应是累加的（Grimson等人，2007年）。然而，如果两个结合位点彼此接近，则沉默效率超过预期的抑制（Grimson等人，2007; Saetrom等人，2007; Broderick等人，2011; Flamand等人， 2017年）。生物化学实验表明，两个小RNA结合位点的协同作用由GW 182蛋白（哺乳动物中的TNRC6;蠕虫中的AIN 1/2;见下文）介导，GW 182蛋白通过其N-末端结构域的甘氨酸-色氨酸（GW）重复序列与多种AGO相互作用，并可降低RISC和双靶位点之间的解离速率（Briskin et al.，2020年）。AGO蛋白的AGO和PIWI进化枝通常形成细胞质非膜体，例如P体、应激颗粒、nuage、极性颗粒和P颗粒（Liu et al. 2005;Sen和Blau，2005; Leung等人，2006; Harris和Macdonald，2001; Brennecke 等 人 ， 2007; Batista 等 人 ， 2008; Wang 和Reinke，2008）。这些体的形成是由AGO/PIWI及其相互作用蛋白的液-液相分离驱动的（Sheu-Gruttadauria和MacRae，2018;Suen等人，2020年）。增加浓缩物中蛋白质和RNA的局部浓度必须有利于有效的沉默反应，这是在不同类型的RNA及其结合蛋白中观察到的一个共同主题（Alberti，2017）。此外，AGO蛋白的分子凝聚可能影响它们如何被破坏（见下文）。目标RNA切割靶切割通常需要除了小RNA的种子区之外的中心区的碱基配对（Ding等，2003; Haley和Zamore，2004; Martinez和Tuschl，2004;Schwarz等人，2006; Wee等人，2012; Becker等人，2019年）。靶切割不是动物miR-NA的主要作用模式，因为它们的中心区域很少与结合位点碱基配对（Bartel，2018）。相比之下，植物miRNA具有广泛的互补靶标，并且AGO的核酸内切活性对于靶标抑制和发育调节是至关重要的（Carbonell et al.，2012年）。AGO催化活性对于动物和植物中的siRNA途径都是必需的，这通过当切割活性被抑制时抗病毒防御的丧失来证明（Carbonell等人，2012; van Mierlo等人，2012年）。AGO的PIWI结构域形成RNA酶H样折叠，其可以使用保守的DEDH/D催化四分体在t10和t11之间的位置处广泛切割互补靶RNA，用于RNA骨架的双金属水解（Nakanishi等人，2012年）。虽然g10和g11处的引导-靶碱基对对于靶切割是关键的，但g12和种子区中的错配有时会增强AGO的切割活性。此外，尾区中的错配可以通过减少RNA双链体中的应变并允许RISC-靶复合物呈现更具催化活性的构象来增加单周转切割速率（Becker等人，2019年）。尾错配，常见于经验证的植物miRNA靶标，也增加了多个周转率，可能是通过促进切割产物的释放（Tang et al.，2003;Haley和Zamore，2004; Wee等人， 2012; Salomon等人，2015）。分子细胞82，2022年1月6日35会审查如上所述，并非所有AGO都具有切割活性;例如，脊椎动物具有四种AGO蛋白（AGO 1-AGO4），但只有AGO2具有稳健的切割活性（Liuetal.， 2004; Meister等人， 2004年）。AGO1和AGO 4的切割缺陷是由于不完全的催化四分体和N和PIWI结构域中的结构变化（Faehnle等人，2013; Hauptmann等人，2013年，2014年）。相比之下，AGO3具有完整的DEDH催化四联体，但仅当特异性小RNA缔合时和当靶RNA具有侧翼区时才切割靶RNA（Park等人， 2017年）。 这种有限的切割活性归因于AGO3的N结构域中的短抑制基序（Hauptmann等人，2013; Schurman netal. ，2013）。然而，当引导RNAAGO3短至14 nt，可能通过绕过N结构域的抑制作用而成为一个有能力的切割器（Park等人， 2020年）。尽管动物miRNA的主要作用模式是不依赖于切割的mRNA去稳定化和翻译表达，但抑制具有广泛互补靶位点的几种mRNA需要切割活性（Yektaet al.，2004; Davis等人，2005），以及用于加载有具有非典型二级结构的特异性miRNA如miR-451和miR-486的RISC的成熟（Cifuentes et al.， 2010; Che-loufi等人，2010;Yang等人，2010; Jee等人， 2018年）。翻译抑制和mRNA降解动物miRNA通常不是通过切割而是通过翻译抑制和mRNA降解来抑制靶RNA（图3）。动物中miRNA介导的沉默的最广泛接受的模型是首先发生翻译抑制，然后是靶mRNA衰减（Mathonnet etal.， 2007年; Be 'thune等人， 2012; Djuranovic等人， 2012;Bazzini等人， 2012; Eichhorn等人， 2014年）。然而，最近的报道表明，翻译抑制不仅是mRNA降解的一个步骤，而且本身具有生理学上重要的作用（Mayya et al.， 2021年）。该领域目前的共识是，miRNA介导的mRNA衰变是通过GW 182蛋白募集聚腺苷酸降解酶触发的（Jonas和Izaurralde，2015;Duchaine和Fabian ， 2019 ） ， 但 也 提 出 了 其 他 GW 182 非 依 赖 性 机 制（Iwakawa和Tomari，2015）。下面描述的不同沉默机制不是相互排斥的，而是可以同时发生或以不同的动力学发生。哪种机制是最主要的可能取决于个体靶mRNA的性质、细胞类型、发育时间和其他因素。mRNA衰变miRNA介导的靶mRNA衰变涉及靶mRNA的去腺苷化、去帽和外切核酸降解，其由GW 182蛋白协调（图3A）（Behm-Ansmantet al. 2006; Eulalio等人，2008年）。GW 182具有一个带有GW重 复 序 列 的 N 端 结 构 域 和 一 个 C 端 沉 默 结 构 域 （ Jonas 和Izaurralde，2015;Duchaine和Fabian，2019）。GW 182的GW重复与AGO的PIWI结构域上的双链甘露聚糖结合口袋相互作用（ Behm-Ansmant 等 人 ， 2006; El-Shami 等 人 ， 2007 年 ;Elkayam等，2017年）。GW182作为支架发挥作用，其促进多聚（A）结合蛋白（PABP）从mRNA的多聚（A）尾解离（Fabian等人，2009; Jinek等人，2010; Kozlov等人，2010;Moretti等人，2012），而是促进两个称为CCR 4 - 1的去腺苷化复合物的募集。NOT和PAN 2-PAN 3（Fabian等人，2011; Braun等人，2011;Chekulaeva等人，2011; Chen等人，2009年）。CCR 4-NOT复合物的募集不仅使靶转录物去腺苷化，而且还用作募集去APP因子 （ 例 如 ， DCP 2 ） 和 脱 帽 激 活 剂 ， 包 括 DCP 1 、RCK/p54/DDX 6（果蝇中的Me 31 B、酵母中的Dhh 1和非洲爪蟾中的Xp 54）和4 E-T（真核翻译起始因子4 E [eIF 4 E]结合蛋白）（Jonas和Izaurralde，2015;Duchaine和Fabian，2019）。最后，50至30的核糖核酸外切酶XRN 1介导去腺苷化和去帽化的mRNA的降解（Rewinkel等人，2005; Duchaine和Fabian，2019）。与动物RISC相反，植物RISC不诱导靶mRNA去腺苷化和去稳定化（Iwakawa和Tomari，2013）。尽管一些植物AGO具有结合GW-binding pockets并与一些含有GW重复序列的因子相互作用（El-Shami et al.，2007; Pontier等人，2012; Garcia等人，2012），迄今尚未发现桥接AGO和CCR 4-NOT复合物的GW蛋白。翻译抑制与靶mRNA的降解相比，miRNA介导的翻译抑制更为复杂，且了解较少。已经提出了几种抑制翻译起始的机制，包括PABP置换、靶向eIF4E或eIF4G的翻译抑制剂的募集和eIF4A解离（图3B）。前两种机制是GW182依赖性的，而第三种机制可以在没有GW182的情况下发生。PABP结合到3 -0poly（A）尾上，通过稳定翻译起始复合物eIF4F（包括帽结合蛋白eIF 4 E、支架蛋白eIF 4G和RNA解旋酶eIF4A）与5- 0帽结构的结合，通过其与eIF 4G的相互作用，增强翻译起始。PABP-eIF 4G相互作用被认为促进了促进翻译起始和核糖体再循环的闭环结构（Sonenberg和Hinnebusch，2009）。如上所述，RISC促进PABP从靶mRNA的poly（A）尾解离，从而消除闭环结构并抑制翻译起始（Moretti等人， 2012年）。RISC抑制翻译起始的另一种机制是通过招募靶向eIF 4 E/ 4G的翻译抑制剂（Jonas和Izaurralde，2015;Duchaine和Fabian，2019）。NOT 1是CCR 4-NOT复合物的一个组分，通过GW182与RISC结合，与翻译抑制剂和去帽增强子DDX 6相互作用。这种相互作用促进miRNA介导的抑制，即使去腺苷化被阻断，表明DDX6参与miRNA介导的翻译抑制以及mRNA衰变（Chenet al.， 2014; Rouya等人，2014; Mathys等人，2014年）。最近的研究表明，4 E-T（一种与DDX 6相互作用的eIF 4 E结合蛋白）和帽结合蛋白4 EHP（eIF 4 E2）参与miRNA介导的翻译抑制（Kamenskaet al.，2016; Chapat等人，2017; Jafarnejad等人，2018; Mayya等人，2021），其细节在另一篇综述中进行了探讨（Duchaine和Fabian，2019）。许多证据表明，miRNAs通过从靶mRNA中去除eIF4F组分来抑制然而，精确定位哪个起始因子被移除36分子细胞82，2022会审查变得更具挑战性两项研究表明，eIF4A在果蝇和哺乳动物无细胞系统中通过miRNA靶向而特异性地从50帽结构中解离（EIF4A等， 2014年; Zhao等人， 2014年）。 尽管eIF4A通过miRNA靶向（有或没有GW182）从靶mRNA中特异性地去除，但是当GW182被有力地拴系到靶RNA时，eIF4E和eIF4A都从靶mRNA中去除（Ekalaya等人，2014年）。这些结果不仅表明miRNA可以通过多种途径抑制翻译起始，而且还暗示将蛋白质直接连接到mRNA可能导致与天然miRNA介导的靶向不同的在C.线虫种系，其中miRNA介导的翻译抑制依赖于核心P颗粒组分GLH-1，但不依赖于蠕虫GW 182蛋白AIN-1（Dallaire等人， 2018年）。尽管植物缺乏GW 182同源蛋白，但植物miRNA也可诱导翻译抑 制 （ Chen ， 2004; Brodersen et al. ， 2008; Iwakawa 和Tomari，2013），尽管对机制知之甚少。在体外，拟南芥AGO1-RISC可以抑制靶RNA的翻译起始和延伸，而不促进去腺苷化或mRNA降解（Iwakawa和Tomari，2013）。最近的报道显示，由环境胁迫诱导的植物22-ntsiRNA抑制靶mRNA的翻译（Wu et al.， 2020年）。在拟南芥中，22-nt的小RNA装载到AGO 1和miR 390装载到AGO 7都招募植物特异性的dsRNA结合蛋白SGS 3，当其尾部区域与靶位点的50端碱基配对时，SGS 3结合miRNA的30 这种相互作用导致核糖体在体内和体外在靶mRNA上停滞（Iwa-kawa等人， 2021年）。这可能部分解释了为什么植物小RNA可以在延伸步骤抑制翻译需要进一步阐明植物小RNA影响靶mRNA翻译RISC的命运空AGO一旦RISC形成，小RNA和AGO通常是长寿命的，而每种组分本身 是 相 当 不 稳 定 的 （ 图 4A ） （ Winter 和 Diederichs ， 2011;Vaucheret等人，2004年）。存在两种用于选择性降解未负载的AGO的途径：自噬和泛素-蛋白酶体系统（UPS）。最近的报道显示，一种名为Iruka的内源性RING型E3泛素连接酶识别未负载的果蝇Ago 1并泛素化L2接头中的赖氨酸残基，预计L2接头在miRNA负载状态下是不可接近的（Ko-bayashi et al. 2019年a）。多泛素化的空Ago 1被含缬氨素的蛋白（VCP）识别，其通过Ufd 1-Np 14异二聚体介导选择性自噬，导致自噬降解（Kobayashi et al.，2019年b）。重要的是，Iruka、VCP、Ufd1 或 Npl4 的 缺 失 损 害 RNA 沉 默 并 上 调 miRNA 靶 基 因（Kobayashiet al. 2019a，2019b），表明通过Iruka和VCP机制对果蝇Ago1进行质量控制对于有效的基因沉默至关重要。在植物中，病毒沉默抑制蛋白P0劫持宿主SKP 1-Cullin 1-F-box（SCF）E3连接酶复合物，以优先遍在化AGO 1的空状态（以及可能的其他植物AGO），导致AGO 1通过自噬降解（Bortolamiol等， 2007;Baumberger等人， 2007; Csorba等人， 2010; Derrien等人，2012年，2018年）。在非病毒条件下，F盒蛋白FBW2被认为作为E3酶复合物的衔接子来降解植物中的空AGO，但细节仍不清楚（Earley et al.， 2010年）。RISC的退化在RISC的情况下，小RNA通常被保护免于降解，但它们在某些条件下可以不稳定（Cazalla et al.，2010; Ameres等人，2010年）。选择性miRNA降解机制之一被称为靶RNA指导的miRNA降解（TDMD），其在miRNA以延伸至miRNA的30末端的近乎完美的互补性结合至靶RNA时被触发（图4B）（Ameres等人，2010年）。这种非典型配对通常通过miRNA 3 0末端从PAZ结构域解离而触发miRNA 3 0末端的延伸和缩短，称为靶向加尾和修剪 （ TDTT ） （ Ameres et al. 2010; de la Mata 等 人 ， 2015;Kleaveland 等 人 ， 2018; Marcin