工程6（2020）495意见和评论为基于图像的拟南芥Resistance检测试剂盒Goldi Makhijaa，c，Dinesh S.Pujarab，In-Hyouk Songa，Byoung Hee Youa，Hong-Gu Kangba工程技术系，德克萨斯州立大学，San Marcos，TX 78666，USAb德克萨斯州立大学生物系，San Marcos，TX 78666，USAcCaresoft Global Inc.，Burr Ridge，IL 60527，美国1. 介绍作物改良对粮食安全变得至关重要，不断变化的气候和不断增长的人口[1]。植物病害管理是粮食安全的最重要因素之一。例如，小麦，一种主要的农作物，在历史上一直受到周期性的全面破坏。最近的一个例子是，当一种新的小麦秆锈病从东非传播到中东时，小麦价格大幅飙升，威胁到发展中国家的生计。这个例子强调了学习植物如何抵御潜在病原体和害虫的重要性，以确保粮食资源。抗性性状的鉴定一直是植物病害管理的主要工具之一[3]。例如，一长串对植物中的疾病有效的R（抗性）基因已被表征并用于作物保护[4]。虽然这些R基因在对来自广泛的病原体和害虫的感染做出反应时触发强烈的防御反应，但潜在的信号网络尽管高度复杂，但似乎涉及许多共同参与者。例如，拟南芥PR（NPR1）基因的非表达子已被证明是水杨酸（SA）（一种众所周知的防御激素）的受体[5]，并且是大多数R基因介导的抗性机制所需的[6]。NPR1的缺乏不仅导致拟南芥对病原体的易感性，还导致不同植物物种对病原体的易感性[7]。拟南芥中的许多防御信号组分在作物中也起着重要作用，这突出了详细表征拟南芥中抗性信号途径的重要性[8]。不幸的是，随着这些防御组分的数量增加，由于缺乏可使高通量植物抗性测定自动化的负担得起的表型组学工具，表征所有必要的遗传背景变得更加困难。越来越多的遗传资源，包括自然资源，和人工变异，提供了一个宝贵的机会，以确定重要的农艺性状[9]。虽然由于测序技术的进步，大规模基因分型现在已成为常规，但高通量表型分析远非常规，因为没有固定的程序，而且很少有负担得起的表型。经济学工具[10]。植物中的抗性测定在高通量设置中甚至更具挑战性，因为抗性性状主要通过经由劳动密集型步骤定量感染病原体/害虫来评估为了克服这些障碍，一个假单胞菌（P。将Lactobacillus）菌株工程化以携带发光报告基因，并用于受感染叶片的非侵入性成像，以定量植物中的抗性[11]。该报告菌株允许评估超过100种拟南芥生态型，这导致鉴定了与拟南芥中基础细菌抗性变异相关的两个数量性状基因座[11]。自 动 化 是 高 通 量 表 型 分 析 的 关 键 要 素 Pheno-scope 和PHENOPSIS[12，13]是两种用于大规模表型分析的商业自动化表。然而，这种类型的自动化工具由于其高成本而无法用于传统实验室，这对大规模研究提出了重大挑战。为了克服这一障碍，我们建立了一个经济实惠的自动化工作台，与相机同步，用于大规模基于图像的抗性分析，这证明了自动化在植物表型组学中具有挑战性的领域之一的好处2. 方法2.1. 用于自动化工作台的使用表1和表2中列出的部件组装自动化工作台。结果部分描述了分步组装2.2. 用于使自动化工作台与电子倍增电荷耦合器件相机附录A提供了用C++编写的编程代码，用于使自动化工作台与电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机同步。https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.09.0092095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng496G. Makhija et 其他/工程 沪公网安备31010502000119号·表1用于为x轴装配的机械零件部件名称UPC数量尼龙嵌件六角3铝垫片（6 mm）8193680213492铝垫片（40 mm）8193680213253低切迹螺钉M5（40 mm）81936802206341/400×8mm弹性联轴器8193680209151铝垫片（3 mm）8193680213494偏心垫片（6 mm）8193680210112Xtreme实心V轮套件8193680208094间隔块8193680216912V-Slot®龙门架板通用81936802530 1自攻螺钉8193680211344低切迹螺钉M5（55 mm）8193680218203滚珠轴承688Z 8 mm × 16 mm × 5 mm8193680210282垫片-12 mm × 8 mm × 1 mm8193680207002锁环（8 mm）8193680209912螺杆板NEMA 23步进电机8193680217692低切迹螺钉M5（15 mm）819368021820618盆拟南芥。我们将自动化工作台的装配分为两个部分：①机械部分和②电子部分。3.1. 自动化工作台的组装：机械部分为了支撑和移动18个盆的重量，高刚度和推力是自动化工作台的必要方面精确度对于一致地捕获图像也至关重要。为了实现这些要求，使用预先设计的套件-V-Slot® NEMA 23线性致动器套件（导螺杆），其套件编号为1170-套件，UPC编号为819368022902-用于提供自动化工作台沿x轴的平移。如图如图1（a）所示，该套件具有步进电机、导螺杆、螺母、垫片、轴承和V-Slot ®龙门架板。机芯由丝杆驱动，其运动由步进电机控制用于8 mm公制梯形丝杆的表2用于控制自动化工作台的电子部件8193680218061每一株植物都直接位于相机的下方，以便捕捉到它的图像。这种定位需要工作台沿x和y方向的平移运动。 将先前描述的线性束的复制品反向定位在X轴的顶部上。使用每个轴的V-Slot®机架板组装x轴和y作为示在图1（b）中。拟南芥托盘不能直接放置在图1（b）所示的设计组件上，因为其自身重量会导致相机和植物之间的错位。零件类型零件品牌和型号数量因此，两个V-Slot®线性导轨安装在该组件，如图所示。 1（c），为了保持拟南芥功率电源步进器电机驱动器Arduino控制器24 V 15 A DC通用稳压器1开关电源SainSmart单轴数控雕刻机TB6560 2步进电机驱动板Arduino mega 2560REV3 1托盘在移动过程中保持稳定和平衡图图1（d）示出了支撑18个拟南芥盆的自动化台的三维实体模型。尽管土壤和水的重量相当大，但该台能够平稳地驱动植物（参见附录A中的补充视频）。通用摄影台用于固定相机，其高度可以LCD控制SunFounder IIC I2C TWI 1602串行LCD模块1显示器为Arduino uno R3 mega 2560 16 × 2CNC：计算机数控; DC：直流; LCD：液晶显示。2.3. 植物生长、细菌感染和细菌生长的定量将拟南芥植物在22 °C和60%相对湿度的土壤中生长，光照时间为16小时。用无针注射器以指定的P. 在28 °C下生长2天的甜菜在含有适当抗生素的King's B培养基中培养。在给定时间点收获接种的叶片，然后用于细菌滴度测定，如前所述[14]。2.4. 体内NanoLuc报告基因测定使 用 由 HCImageLive 软 件 （ Hamamatsu ， Japan ） 运 行 的EMCCD相机（C9100- 23 B，Hamamatsu，Japan）来捕获来自感染植物的化学发光。外部边沿触发模式功能用于同步自动化工作台。在成像之前，将植物置于黑暗中30分钟以减少背景发光。用NanoGlo试剂（Promega，USA）喷洒感染的叶子并捕获图像;将相机设置为4的分箱和297的灵敏度增益，光子成像模式（PIM）在1激活，曝光时间为1分钟。3. 一个装配和运行自动化工作台的实例我们的自动化工作台旨在移动传统的Arabidopsis平板，也称为1020温室托盘，手动调整（图1（e））。自动化工作台放在摄像机下面。3.2. 自动化工作台的组装：电子部分两个NEMA 23步进电机用于驱动自动化工作台的X轴和Y轴微控制器-SainSmart计算机数控（CNC）刳刨机单1轴3.5A TB 6560步进电机驱动器板-用于向电机提供电脉冲，并且使用直流（DC）电源放大脉冲一个液晶显示器（LCD）被包括在内，以指示植物在公寓上的实时位置如图2所示，所有组件都是电连接的。Arduino控制器存储了图像捕获操作的整个逻辑，并相应地为步进电机提供必要的电脉冲序列它还在所需的时刻触发了摄像头，并控制液晶显示器显示桌子的位置。3.3. 通过自动化工作台促进基于图像的耐药性测定我们最近开发了一个P。携带最亮的发光报告基因之一NanoLuc荧光素酶[15]，用于植物中基于图像的抗性测定的拟南芥菌株（正在编写的手稿）。为了测试自动化工作台是否可以促进这种基于图像的测定，我们用发光P.当他们被自动化工作台调动时，他们被拍摄下来。EMCCD相机连续九次对这些受感染的植物进行成像，没有中断。 应该注意的是，用发光P. 对1、2和3天的视网膜进行成像（图3）。显示了每个不同时间的代表性图片NEMA 23步进电机8193680212711V-Slot® 20× 60直线导轨（1000 mm）8 mm公制梯形丝杠（290 mm）81936802043481936802034211G. Makhija等人/工程6（2020）495497Fig. 1.带有摄像机和支架的自动化工作台组件。放置两个电机控制的导轨以控制二维运动。一旦（a）第一个轨道被组装好，（b）第二个轨道被放置在顶部。（c）安装导轨用于支撑，（d）植物生长平台。(e)将组装好的桌子放置在电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机下。图二、移动组件时涉及的每个电子元件的物理连接在图3（b）中。为了确保这种基于图像的抗性测定与其常规对应物一样定量，绘制了来自两种方法的值，如图3（b）所示，其揭示了一种基于图像的抗性测定。强线性相关这些结果表明，基于图像的测定在自动化表的辅助下以最少的手动输入产生了高度定量的数据。498G. Makhija et 其他/工程 沪公网安备31010502000119号图3.第三章。基于图像的耐药性测定结合自动化表产生的定量数据与其常规对应物相当（a）基于图像的测定（X轴）与常规测定（y用105CFU·mL-1荧光标记的P. 你好在指定的感染后一天（dpi），用NanoGlo底物喷洒感染的植物，并使用EMCCD相机成像，如X轴所示对相同的感染的叶进行常规的叶研磨测定，其中如y轴所示测量细菌滴度（b）有光和无光的代表性图片在没有光的情况下拍摄的来自感染植物的发光以伪彩色显示以更好地区分。CFU：菌落形成单位; RLU：相对光单位。4. 结论和观点我们开发了一种定制的自动化工作台，可促进高通量耐药性检测。该表有两个电机控制的T形槽金属杆。该运动与EMCCD相机同步，可以不间断地对植物进行成像。这种自动化工具，结合最近开发的发光P。如果手动进行，同样的抗性测定通常需要几个小时，因为它涉及几个劳动密集型步骤。我们基于图像的植物抗性分析利用EMCCD相机，可从昏暗的亮度中捕获图像这种高通量友好的方法与自动化表相结合时，可以在迄今为止植物抗性分析的最短时间内进行（不到几分钟而不是几个小时）。除了在提高高吞吐量方面的作用外，这种快速的速度还为配备高灵敏度成像传感器的EMCCD相机提供了额外的好处，该传感器旨在放大非常微弱的光信号。EMCCD相机的灵敏度会随着时间的推移而降低，这一过程称为增益老化，导致传感器灵敏度变差[16]。严重的增益老化使得EMCCD相机无法用于基于图像的抗性测定，并且根据我们的经验修复此老化问题非常昂贵。使用自动化工作台进行无中断成像可提供尽可能短的运行时间，此外还可减少因偶尔用户错误而导致的室内灯光下不必要的曝光，因此有助于更长时间地保持相机的高植物防御信号传导已被深入研究，导致许多明确定义的信号传导途径的鉴定[17]。随着越来越多的防御信号传导组分被表征，分析更大的植物组的需要继续增长。然而，依赖于病原体的手动计数的常规抗性测定通常不利于高通量实验设置。因此，个别研究的重点是在一些遗传背景下的抗性变化。出于同样的原因，很少测量遗传同质系内的抗性性状分布。越来越明显的是，真核基因组是高度动态的，特别是在压力下[18，19]。这种活力的促成因素之一是转座因子的活性增加，可以改变基因组[20]。因此，我们设想，一旦大规模的抗性研究成为植物病理学领域的标准，防御信号因子之间的相互作用，甚至同源遗传背景中的抗性变异将被揭示。在这项研究中提出的自动化表可容纳一个传统的拟南芥托盘。这张桌子可以很容易地向上扩展，通过更换一个酒吧和一个电机与其他有足够的能力。大多数实验室在对工厂进行大规模成像时，自动化选项有限。尽管先进的自动化工具在增强表型分析能力方面具有巨大潜力，但低成本和/或DIY表型分析解决方案（如本研究中提出的自动化表）将降低进入门槛[21]，这将进一步推广高通量方法。因此，我们希望我们负担得起的自动化表将鼓励更多的实验室致力于大规模的抗性测定，以更好地表征日益复杂的植物防御信号。确认感谢Angela H。Kang对本手册的评论和John Word对设计自动化表的反馈/帮助。这项工作得到了国家科学基金会的支持（IOS-1553613，Hong-Gu Kang）。附录A.补充数据本文的补充数据可以在https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.09.009上找到。引用[1] 测试员M，Langridge P. 在不断变化的世界中提高作物产量的育种技术。Science2010;327（5967）：818-22.[2] SokoT，Bender CM，Prins R，Pretorius ZA. 面包小麦不同抗秆锈病水平的产量损失。Plant Dis2018;102（12）：2531-8.[3] Bent AF，Mackey D.激发子、效应子和R基因：新的范式和一生的问题。植物病理学年鉴2007;45：399-436。[4] 放大图片作者：Martin GB，Bogdanove AJ，Sessa G.了解植物抗病蛋白的功能。Annu Rev Plant Biol2003;54：23-61.G. 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