长读段DNA甲基化测序和Strand-seq检测染色体亲本来源及遗传背景验证

短文使用长读段DNA甲基化测序和Strand-seq进行亲本来源检测和图形摘要亮点d基因组印记可以帮助推断同源物的d印记DNA甲基化必须与染色体长度单倍型相d该方法对具有不同遗传背景的五个三人组进行了验证d未来，原住民父母分阶段将改善级联基因检测作者Vahid Akbari，Vincent C.T.放大图片作者：Kieran O'Neill，Louis Lefebvre，Kasmintan A. 施拉德，Peter M.作者声明：Steven J.琼斯通信plansdor@bccrc.ca（P.M.L.），sjones@bcgsc.ca（S.J.M.J.）简言之Akbari等人提出了一种鉴定从母亲或父亲遗传的同源染色体的方法，而不使用来自父母的数据。该方法依赖于在母本和父本印记基因座处的定相DNA甲基化，以及DNA序列的染色体长度定相对5个三体的测试表明，该方法可以正确推断所有常染色体的起源亲本，SNV的错配错误率为0.31%。Akbari等人，2023，细胞基因组学3，1002332023年1月11日-2022年作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100233会会开放获取短文使用长读段DNA的亲本来源检测和染色体规模单体型分析甲基化测序和Strand-seqVahid Akbari，1，2，5Vincent C.T.汉伦，3，5基兰Peter M. Lansdorp，2，3，*和Steven J.M. 琼斯1,2,6*1加拿大2加拿大不列颠哥伦比亚大学医学院医学遗传学系3Terry Fox Laboratory，BC Cancer，Vancouver，BC，Canada4分子肿瘤学系，BC癌症，温哥华，BC，加拿大5作者贡献相等6引线触点* 通信：plansdor@bccrc.ca（P.M.L.），sjones@bcgsc.ca（S.J.M.J.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100233总结人类基因组中的数百个基因座具有根据其起源的亲本而差异甲基化的等位基因这些印记基因座通常在组织、个体和种群之间表现出很小的变化。我们表明，这样的基因座可以用来区分所有人类常染色体的母系和父系同源物我们将甲基化检测纳米孔测序与Strand-seq数据中的远程相位信息相结合，以确定具有不同遗传背景的五个三人组中DNA序列和DNA甲基化的染色体长度单倍型的起源亲本。对于所有常染色体，均正确推断出来源的亲本，SNV的平均错配错误率为0.31%，插入或缺失（indels）的平均错配错误率为1.89%因为我们的方法可以确定遗传病等位基因是来自母亲还是父亲，我们预测它将改善许多遗传病的诊断和管理。介绍尽管定相通常被定义为将等位基因与母本和父本同源物区分开的任务，但实际上，目前大多数定相方法完全忽略了亲本信息。相反，他们将来自每个染色体或亚染色体相位块的等位基因分组为两个单倍型（对于二倍体），其对应于不同的同源染色体，但不分配起源亲本（PofO）。这些单倍型只能在某些类型的三重信息可用的情况下被分配为PofO，例如通过将先前发现的母亲或父亲的等位基因与杂合基因座处的孩子的等位基因进行从这个意义上说，真正的相位信息在很大程度上是目前的基因组方法所无法达到的，这些方法没有结合来自至少一个与孩子相邻的父母的序列数据。1-4这种模式的一个显著例外是由母系和父系遗传的等位基因之间在印记差异甲基化区域（iDMR）的DNA甲基化的一致差异提供的亲本信息。这种差异甲基化要么在配子中建立并逃避受精后的表观遗传重编程，要么在受精后建立，5，6并持续到成年。iDMR可靠地抑制邻近基因或基因簇处的母本或父本等位基因的表达，并且至关重要的是，可以使用独特的PCR方法在细胞系或新鲜样品中检测到iDMR。通过纳米孔测序（Oxford Nanopore Technologies）的5-甲基-胞嘧啶的离子电流特征。7-尽管使用纳米孔读数的定相可以实现兆碱基规模的相位块，但不能获得完整的染色体单倍型，并且每条染色体以几个相位块表示，其中沿着染色体的块的父系和母系起源之间可能有切换。9相反，一些定相技术缺乏亲本信息，但产生跨越着丝粒、重复区域和纯合性运行的相位块。单细胞模板链测序（Strand-seq）是一种文库制备方法，在BrdU存在下培养一轮DNA复制的子细胞中捕获亲本DNA模板链。13来自Watson模板链的读数以负方向映射到参考基因组，并且来自Crick模板链的读数这种方法能够构建全局的染色体长度单倍型。由于Strand-seq相位块通常是稀疏的（即，它们不对所有单核苷酸变体[SNV]进行定相），Strand-seq通常用作scaf- fold，在其上读取或亚染色体相位阻断来自Cell Genomics3，100233，January 11，2023？ 2022作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取短文2Cell Genomics3，100233，2023（图例见下页）Cell Genomics3，100233，2023年1月11日3会开放获取短文结合其它测序技术，有效地将它们相对于彼此定相。14-17确定生殖系变体的PofO可以通过变体策展、有效筛选遗传疾病的亲属来帮助临床遗传学，并且当致病性变体具有PofO效应时，也就是说，当患者遗传性副神经节瘤-嗜铬细胞瘤综合征，由于SDHD或SDHAF 2中的致病性变体）。1823.如果由于父母不在、去世或拒绝基因检测而导致PofO信息缺失，则必须向家庭双方提供级联基因检测，直到确认隔离这对患者和家庭来说可能是昂贵和负担沉重的，加剧了级联基因检测已经很低的接受率。消除测试家族一侧的需要是定义致病性变体的PofO的明显益处和主要临床效用，并且更广泛地，建立具有基因组变异的准确亲本分离的染色体长度单倍型具有广泛的应用。我们报道了当纳米孔甲基化和iDMR与Strand-seq染色体长度单倍型整合时，沿着每个人自体染色体全长的等位基因可以被分配给母本或父本同源物（图1）。该方法不需要亲本序列数据（三重信息）或SNV连锁分析，而是依赖于所有人常染色体具有至少一个已知亲本来源的iDMR的事实。所需的唯一输入是新鲜全血或其他可培养的活细胞样本。我们针对来自瓶中基因组联盟（GIAB）、人类基因组结构变异联盟（HGSVC）和1000基因组计划（1KGP）的五个金标准三重体验证了杂合SNV和插入或缺失（indel）的PofO分配16，26，27通过追踪致病性变异，通过针对选择的家庭成员的测序工作，我们的方法有可能改变级联遗传检测并改善遗传性疾病的筛查结果Nanopore和Strand-seq使染色体规模的单体型分析成为可能我们使用了五个人类基因组来证明我们的方法，包括NA 12878;来自GIAB的HG 002和HG 005;来自HGSVC的HG 00733;以及来自1 KGP的NA 19240。对于所有样品，我们使用24-38μm深度的纳米孔测序数据图S1显示了42-220个Strand-seq文库，每个样品具有2.78-9.46μ m的将纳米孔原始信 号碱基调用并映射到人参考基 因组GRCh38。使用Clair 328从纳米孔读数调用SNV和插入缺失每个个体的SNV调用集包括五个相应的地面实况调用集中的几乎所有SNV（平均值[M]：97.98%，标准偏差[SD]：1.67%，范围：95.51%对于SNV和插入缺失，我们在具有最大纳米孔覆盖率的个体中恢复了最大比例的地面实况变体，而我们在具有最小覆盖率的个体中恢复了最小比例。这表明，包括更多的纳米孔数据将是解决插入缺失的高假阴性率的一种方法。在iDMR可用于将PofO分配给同源物之前，必须构建染色体长度单体型这是因为iDMR仅覆盖常染色体人类基因组的一小部分（在本研究中估计为0.014%），并且相对于变体不需要定相虽然单独的纳米孔读数可以用于对每个样品的几乎所有被调用的变体进行定相，但所得的相位块相对较短（N50 M± SD = 4.85±0.00000）。3.66 Mb），不跨越完整的染色体，并且不全部包含iDMR（ 图S4和 S5）。 因此 ，我 们首 先对 纳米 孔SNV 应用Strand-seq定相了真实和纳米孔调用集之间60.62-然后使用链seq定相SNV来定相纳米孔读段（成功完全定相的具有至少MAPQ 20的读段的分数，M± SD：71%± 9.6%），其进而用于对所有变体进行再定相，并获得含有几乎所有杂合SNV和大多数插入缺失的密集的染色体规模单体型（表1和S1）。以这种方式组合Strand-seq和纳米孔允许我们对存在于真实和纳米孔调用集中的99.39%-99.91%的杂合SNV和96.41%-98.77%的杂合indel进行定相我们的定相方法使用GRCh38参考基因组，并且我们没有进行任何种类的从头iDMR将PofO分配给单体型iDMR处的PofO特异性DNA甲基化提供了确定同源物的PofO的独特信息图1.原产地来源（PofO）定相方法概述(A) 工作流程的输入是来自单细胞Strand-seq文库的纳米孔长读取和数据纳米孔数据用于调用变体，其中一些变体以反转感知的方式与Strand-seq然后，这些定相的变体用于对纳米孔读数进行定相，纳米孔读数用于对更多变体和DNA甲基化进行定相。最后，iDMR的DNA甲基化状态用于鉴定每个同源染色体的PofO。(B) 在不检查DNA甲基化的情况下，可以将Strand-seq和纳米孔读数组合以构建染色体长度单倍型，14，16，但是每个同源物的分配（即，染色体长度单倍型）与单倍型1或单倍型2（HP 1或HP 2）之间的差异相对于其PofO是随机的，如这幅漫画所示然而，iDMR可用于区分母本和父本同源物。棒棒糖标记了本研究中使用的所有144个母体iDMR（在母体同源物上甲基化）和所有48个父体iDMR的位置。关于相对于细胞条带显示的iDMR名称和位置，请参见图S7。4Cell Genomics3，100233，2023会开放获取短文表1.杂合变体的定相以及与地面实况调用集的比较杂合子SNV公司简介公司简介HG00733NA12878NA19240地面实况呼叫集中的2,117,5251,922,6662,168,5122,027,0972,787,148纳米孔和地面实况2,100,3261,915,8212,071,1562,009,2632,688,200链序转换率0.02020.00780.00870.0020.0055Strand-seq开关/翻转率0.01120.00440.00490.00120.003Strand-Seq错配率0.01360.0060.00670.00140.0048正确定相的链序号1,496,1731,516,7271,255,4861,906,6191,903,540链序号不正确分阶段20,5609,1558,4572,7309,239组合的Strand-seq和纳米孔转换率0.00160.00110.00270.00080.0029组合的Strand-seq和纳米孔开关/翻转速率0.0010.00070.00160.00050.0016组合的Strand-seq和纳米孔错配率0.00540.00240.00340.00070.0035组合的Strand-seq和正确定相的纳米孔数2,076,2041,903,6422,061,7002,001,4122,676,235组合的Strand-seq和纳米孔数目不正确分阶段11,2564,6347,0171,4899,414杂合插入缺失公司简介公司简介HG00733NA12878NA19240地面实况呼叫集中的326,220250,169286,492292,829335,801纳米孔和地面实况215,614195,590150,941186,625199,359组合的Strand-seq和纳米孔转换速率0.04090.03970.02370.03340.0323组合的Strand-seq和纳米孔开关/翻转速率0.02130.02060.01240.01720.0167组合的Strand-seq和纳米孔错配率0.02430.02180.01330.01740.0177正确定相的组合的Strand-seq和纳米孔数目202,815184,615147,100178,390193,356错误定相的组合的Strand-seq和纳米孔数目5,0614,1061,9863,1613,477我们只包括在真实的callset中的双等位基因杂合变体（0/1，1/0，0| 1或1| 0），以与定相误差率计算保持一致。参见表S1。由染色体长度单倍型表示，而不使用亲本序列数据。我们汇总了来自先前全基因组研究6，29染色体X被忽略，因为通常认为其不具有iDMR。我们将来自定相纳米孔读数的DNA甲基化信息与印迹间隔处的已知PofO信息组合以将PofO分配给每个同系物（参见STAR方法）。平均而言，5.7个iDMR（中值：5，SD：5.2，范围：1平均而言，7%iDMR与大多数PofO分配冲突。然而，因为iDMR通过每个样品中的差异甲基化程度加权，所以冲突的iDMR仅代表PofO贡献值的3%（x1;参见STAR方法;表S4）。在这项研究中，我们检查了5个个体中的220个常染色体同源物（5个个体322个常染色体32倍性），并将推断的PofO与地面实况阶段变体调用集中的三重分配的PofO进行了比较。所有220个同源物被正确地分配PofO，即，染色体长度单倍型被正确地鉴定为母本或父本，并且具有很少的定相错误（SNV的染色体水平错配错误率，M± SD：0.34%± 0.53%，范围：0.03%Cell Genomics3，100233，2023年1月11日5会开放获取短文图2.用于HG002中PofO分配的父亲和母亲iDMR处的CpG甲基化母体甲基化iDMR为红色且向上，而父体甲基化iDMR为蓝色且向下。条形表示在每个iDMR处每个单倍型的单倍型之间具有甲基化差异R0.35（差异甲基化）的CpG的分数（单倍型1的HP 1染色体本身根据姬姆萨显带（白色、灰色和黑色）着色，着丝粒为红色，近端着丝粒染色体的柄为蓝灰色。另见图S8插入缺失，M± SD：1.93%± 0.58%，范围：0.98%大约一半的iDMR在至少两项先前的研究中报告，而其余的仅在一项研究中报告，并通过在来自119份血液和60份组织样本的179个WGBS数据集中观察到的部分甲基化得到证实（见STAR方 法 ） 。 单 一 研 究 iDMR 的 一 个 潜 在 弱 点 是 ， 其 中 38 个（19.8%）来自先前的12个三人组研究，其中包括本文研究的相同五个三人组，32并且当在新个体中检查时，这些iDMR中的一些可能提供误导性或不充分的PofO信息（即，如果他们没有真正的印记）。我们通过仅使用发现在至少两项研究中：220个常染色体同源物中的208个被正确地分配了PofO（94.5%），而5号染色体没有被分配给NA19240的PofO，12号染色体没有被分配给任何个体的PofO，因为它没有iDMR。这表明PofO定相不依赖于表征不佳的iDMR，可能是因为所有常染色体具有至少三个iDMR（在192个的完整集合中），除了具有一个iDMR的染色体17和具有两个iDMR的染色体3。这种冗余有助于保持稳健的PofO分配，即使当一些推定的iDMR提供弱的或冲突的亲本信息时。在一些样本中的一些iDMR中，例如在NA12878中4号染色体上的TRPC 3处，我们检测到亲本等位基因上的轻微超甲基化，据报道该等位基因是未甲基化的：这可能是由于甲基化调用的不准确性或6Cell Genomics3，100233，2023会开放获取短文图3.杂合（het）-SNV的PofO分配的每染色体结果PofO可以分配给所有同系物。在HG 002的情况下，具有不正确PofO的小部分变体是Strand-seq或纳米孔数据中的零星定相错误或参见图S12。纳米孔读数的定相，或者它可以反映随机等位基因甲基化而不是印记。这样的甲基化差异可以想象地将错误的PofO分配给同源物。在这种情况下，相同染色体上的额外iDMR能够实现正确的PofO分配，尽管具有最低的置信度评分（57.5%）。为了进一步确认PofO定相提取了可靠的亲本信息，我们计算了每个孩子的推断的亲本单倍型与其亲本的真实变体基因型之间的孟德尔错误率局部定相误差由HG 002在染色体8上的大的常见倒位处的升高的孟德尔误差率（SNV的错配率为99.86%，并且在chr 8：8120810- 12362538处的倒位内的插入缺失的错配率为97.05%后者实际上是横跨着丝粒伸展的1，000个SNV的单个箱，这在图S13中强调了其重要性。在全球范围内，母亲-母亲和父亲-父亲比较的孟德尔错误率较低（M ± SD：0.27% ± 2.69%;对于1，000个变体的非重叠箱计算），而对于母亲-父亲和父亲-母亲比较，它们较高（代表错误分配的PofO; M ± SD：25.75%± 14.14%）。对于母亲-母亲和父亲-父亲比较，任何染色体的最高平均误差率为2.29%，用于HG 002中的8号染色体。 这是不到八分之一的最低平均错误率为母本-父本和父本-母本比较中的任何染色体（NA 12878中21号染色体为19.69%），表明PofO分配对所有染色体都是正确的。讨论我们表明，由SNV和插入缺失的染色体长度单倍型表示的同源染色体可以在不使用亲本序列数据的情况下分配PofO。长纳米孔读数提供DNA序列信息以及PofO信息，其形式为在已知iDMR处母本和父本等位基因之间的DNA甲基化差异。Strand-seq测序提供了稀疏的全局单倍型信息，其对变体和纳米孔读数进行定相以重建单个同源物。然后可以基于一个或多个嵌入的iDMR的一致性来确定每个同源物的PofO（图1）。PofO定相有可能解决遗传疾病诊断和管理中的即时临床需求。这些措施包括通过将变异共分离到具有和不具有相关疾病表型的家族的每一方来改善变异的治疗和疾病发生率的估计，确定在从头变异的背景下哪个父母可能具有嵌合体的风险，以及建立对具有已知PofO效应的基因中的致病性变异的适当筛选建议-如SDHD和SDHAF 2所示。18Cell Genomics3，100233，2023年1月11日7会开放获取短文图4.孟德尔错误率显示PofO定相正确推断亲本单倍型(A) 将HG005（儿童）的推断的母体单倍型与HG007（母亲）的真实变异基因型进行比较孟德尔错误率在所有染色体上都很(B) 将HG005（儿童）的推断的父系单倍型与HG006（父亲）的真实变异基因型进行比较。(C) 将HG005（儿童）的推断的母体单倍型与HG006（父亲）的真实变异基因型进行比较。如果PofO被错误分配给所有染色体，这是预期的模式。(D) 我们人工产生了染色体和区域，在HG005的母系单倍型与HG007的比较中具有不正确的PofO分配缺乏这样的区域是PofO定相方法正确区分母本和父本同源物的证据。我们切换了1号、2号和7号染色体的母本和父本单倍型，以模拟错误的iDMR推断，并通过减少BreakpointR步骤中的箱大小，在15号染色体上产生了较大的切换错误33另见图S13这为干预可采取行动的遗传疾病提供了机会。联系、咨询和检测亲属对患者和医疗保健系统来说是一个重大的后勤和经济负担，特别是考虑到成人发病情况时，父母的测试通常是不可能的。级联遗传学检测可能会受到家庭内部沟通有限和家庭结构破裂的阻碍，并且在少数民族人群中的吸收率较低25个PofO分相站，8Cell Genomics3，100233，2023会开放获取短文在整个家庭中进行级联基因检测的方法，使最佳级联基因检测率的目标触手可及。35重要的是，PofO定相以高度确定性推断患者父母的致病性变异状态的能力可能会更加强调警告风险个体可采取行动的基因组发现的责任，这些发现可能是整个基因检测过程中在专性携带者的背景下，类似的问题对于临床遗传学已经是熟悉的，但是因为这种方法仅需要测试单个人以重建来自每个父母的完整基因组贡献，如果PofO定相由于前所未有的规模而被整合到主流临床遗传测试中，则将存在伦理考虑。其他测序技术或许可以提供PofO定相所需的DNA甲基化、DNA序列和远程相位信息，或者可以使用不同的方法来组合它们。例如，PofO可以被分配给从头无三重二倍体组装体15、36，而不是小变体的染色体长度单倍型。SMRT测序（Pacific Biosciences）现在提供准确的DNA甲基化以及DNA序列，37可能是纳米孔数据的替代品，提供更好的indel检测，并且可能使用Hi-C36的远程定相来代替Strand-seq，尽管如果在着丝粒发生相位转换，16则缺乏iDMR的染色体臂（16 q，17 q，18 p和20 p）不得分配给PofO。PofO定相的测序成本相对较低，本研究中使用的纳米孔和Strand-seq覆盖率仅为24 ×3。作为PofO分配基础的DNA甲基化信息是稳健的，并且可以很容易地从纳米孔序列数据中提取，而以前罕见的Strand-seq文库现在可以原则上，通过远亲的血统相同的基因组区域考虑到PofO定相的简单性和准确性，目前缺乏用于从基因组数据中提取PofO信息的无trio替代方案，以及该方法值得注意的该研究除了一些推定的iDMR可能实际上没有被印迹的可能性之外（参见结果），真正的iDMR可能显示出生物学变异性，这可能会阻止新个体或具有比本研究中使用的细胞系更少或不同的体细胞iDMR的其他组织或细胞类型中的一些染色体的PofO分配尽管每当只有一个等位基因被甲基化时，iDMR处甲基化的父系或母系起源是一致的，但印记甲基化可以是可变的，因为两个亲本等位基因在一些组织和个体中可能具有相似量的DNA甲基化。在极少数情况下，表位突变或基因组印记疾病也可能改变iDMR的DNA甲基化。41尽管冗余iDMR（见结果）通常应允许PofO分配，即使在由于存在这种有限的个体间和组织间变异性，最终，我们的方法必须在来自不同遗传群体的另外的三联体上进行测试，以确定哪些染色体对于PofO定相是麻烦的。表征人类DNA甲基化的进展可以通过鉴定iDMR贫乏染色体上的额外iDMR（例如，染色体17），通过去除假iDMR，甚至可能通过使女性中的X染色体能够进行PofO分配。42即使当同源物被分配了总体上正确的PofO时，局部定相误差也可能导致一些变体的不正确的PofO分配。然而，本研究中构建的染色体长度单倍型是高度准确的，SNV的平均错配错误率为0.31%，indels的平均错配错误率为1.89%尽管我们在地面实况数据集中仅鉴定了64.01%的插入缺失，但这反映了当前纳米孔技术的局限性，并且通过添加短的Illumina读数可以直接改进。28，43我们观察到SNV和插入缺失的罕见转换错误，主要发生在着丝粒和倒位（例如，HG 002中8号染色体上的倒位引起最大的错配错误率;图3和S13;表S1），但这些通常含有很少的变体。着丝粒处的定相错误可能是由于重复序列中的未对齐读取，而倒置处的错误是由于序列方向的变化破坏了Strand-seq用于定相的方向信息。11与反相相关的相位误差可以通过新的StrandPhaseR函数部分解决，该函数可以对已知反相内的变量进行重新相位调整。44当iDMR落在反转内时，这是必不可少的iDMRRIMBP3和CDRT 15 P6）或当感兴趣的基因落入倒位内时（例如，转化chr7：5850673-6795880中的PMS 2基于DNA甲基化的（典型的）印记已经在所有胎盘哺乳动物中描述，并且已经为许多物种建立了iDMR的基因组图谱，特别是小鼠和灵长类动物。10，45-47虽然我们的方法可以潜在地扩展到其他生物体，但它将限于具有已知iDMR的染色体（例如，而不是小鼠中的染色体4、5、13、14、16和19这将主要需要调整用于链测序制备的细胞培养和流式细胞术条件以适合非人细胞。48STAR+方法本文件的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：d关键资源表d资源可用性B电极导线触点B材料供应情况B数据和代码可用性d实验模型和子系统d方法样本B纳米孔测序和数据B纳米孔数据分析B链序列定相和反转校正BiDMR选择Cell Genomics3，100233，2023年1月11日9会开放获取短文B染色体尺度单倍型和PofO检测B孟德尔误差d量化和统计分析补充信息补 充 信 息 可 以 在 www.example.com 上 找 到 https://doi.org/10.1016/j 。xgen.2022.100233。致谢我们感谢Yanni Wang和Daniel Chan帮助我们制作Strand-seq li-chip。我们非常感谢与David Porubsky就反转感知分阶段进行的讨论。我们感谢MartinKrzywinski和Katherine Dixon在图形摘要方面所做的工作V.A. 承认不列颠哥伦比亚大学四年博士奖学金的资助Lansdorp实验室的工作由Terry Fox研究所的计划项目补助金（#1074）资助;加拿大卫生研究院的项目补助金（#PJT-159787）L.L.感谢加拿大卫生研究院的项目资助（#PJT-165992）KAS感谢加拿大研究主席计划和加拿大卫生研究院的资助。S.J.M.J.感谢加拿大研究主席计划和加拿大创新基金会的作者贡献概念化和方法，所有作者;软件、验证、可视化和写作和V.C.T.H.;写作申报利益作者声明没有竞争利益。投稿时间：2022 - 05修订日期：2022受理时间：2022发布时间：十二月21，2022引用1. 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