槐叶萍酚类化合物的柱层析与高效液相色谱分析及其药理活性.

埃及基础与应用科学杂志5（2018）197完整文章柱层析和高效液相色谱法分析槐叶萍酚类化合物T.G. Gini，G.杰亚·乔蒂植物生物学和生物技术系，洛约拉学院（马德拉斯大学），斯特林路，Nungambakkam，钦奈600034，泰米尔纳德邦，印度阿提奇莱因福奥文章历史记录：2018年1月7日收到收到修订版，2018年5月16日接受，2018年在线发售2018年保留字：抗氧化剂酚类化合物柱色谱分离自由基A B S T R A C TSalvinia molesta，俗称巨型Salvinia，是一种属于Salviniaceae科的漂浮蕨类植物。本研究采用柱色谱法分离蕨类植物提取物的活性组分，并采用反相高效液相色谱法测定活性组分中的酚类化合物。与研究中的其他提取物相比，发现乙酸乙酯提取物具有显著的药理活性，因此尝试对乙酸乙酯提取物进行分级。通过两种不同的流动相进行分析，流动相包括溶剂A（乙腈）和溶剂B（0.1%磷酸水溶液）以及溶剂A（甲醇）和溶剂B（4%乙酸）。HPLC分析表明存在具有特定保留时间的酚类化合物，即抗坏血酸、槲皮素、没食子酸、间苯二酚、儿茶酚、香草醛和苯甲酸。检测到的化合物具有抗氧化和抗肿瘤活性。本研究的结果表明，S. Molesta作为一种可能的抗氧化剂的来源，其可以被分离并用作开发抗氧化剂药物的主要候选物，所述抗氧化剂药物有助于阻止或限制由自由基引起的损害并对抗氧化应激，从而预防多种慢性和变性疾病。©2018 曼 苏 拉 大 学 。 由 爱 思 唯 尔 公 司 制 作 和 主 持 这 是 一 篇 基 于 CC BY-NC-ND 许 可 证 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍酚类化合物在植物界普遍存在。它们合成数千种不同的化学结构，并以羟基化芳环为特征。这些化合物是源自植物中戊糖磷酸、莽草酸和苯丙酸途径的次级代谢产物[1]。这些是最广泛存在的一类植物化学物质，在植物中具有重要的生理和形态学意义[2]。由于酚类化合物的抗氧化特性，许多研究旨在表征酚类化合物的健康促进活性。它们可用于治疗和管理癌症、心血管和神经退行性疾病或作为抗衰老或化妆品的组分[3]。酚类化合物的抗氧化活性主要是由于它们的氧化还原电位，这使它们能够作为还原剂、氢原子或电子的供体、单线态氧猝灭剂或金属螯合剂[4酚类化合物表现出广泛的生理特性，例如抗过敏、抗微生物、抗血栓形成、抗炎、抗关节炎、*通讯作者。电子邮件地址：ginigeorgehc@gmail.com（T.G. Gini）。解热、镇痛、抗氧化、心脏保护、免疫调节和血管舒张作用[7酚类黄酮化合物的这些活性可能是由于没食子酸、鞣花酸、抗坏血酸、槲皮素、单宁酸、香草醛、间苯二酚、儿茶素等的存在。[12现代研究表明蕨类植物具有抗微生物、抗氧化、抗增殖、抗炎、止咳、抗肿瘤、抗HIV、酶调节和刺激、激素作用、干扰DNA复制和生理作用等生物学特性[15，16]。 Iqbal Choudhary等人[17]首次从水生蕨类植物S. 骚扰的; 分离的化合物是两种糖苷，6-O-（3，4-二羟基苯甲酰基）-b-D-吡喃葡萄糖酯和4-O-b-D-吡喃葡萄糖-3-羟基苯甲酸甲酯，以及五种已知的化合物，苯甲酸甲酯、次没食子酸、咖啡酸、芍药苷和吡库苷。它们在非生理测定中表现出有效的自由基清除活性这些化合物具有有趣的特性，值得进一步研究。根据这些数据，本研究的目的是压裂-S. 使用柱色谱法对Molesta进行分离，并通过具有光电二极管阵列检测器（PDA）的RP-HPLC定量存在于级分中的酚类化合物。这https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2018.05.0102314- 808 X/©2018曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbas198T.G. Gini，G. Jeya Jothi/埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）197-203×××该研究首次采用两种不同的流动相定量测定了蕨类植物提取物中的七种抗氧化酚化合物。2. 材料和方法2.1. 化学品和酚醛标准品己烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、丙酮、香草醛-硫酸喷雾剂、乙腈、磷酸、乙酸、苯并二氢吡喃水、没食子酸、邻苯二酚、苯甲酸、间苯二酚、抗坏血酸、香草醛、槲皮素、硅胶、海砂。所有上述化学品均为分析级，购自Hi media，Pvt. Ltd.，印度孟买2.2. 植物材料植 物 S. 从 Kalliyad 和 Kaiyamkulam ， Kaithachira ， Thrissur ，Kerala，India的稻田、河流和池塘收集小虫。标本由Dr. G. JeyaJothi，分类学家，Loyola学院，印度泰米尔纳德邦钦奈该植物的凭证标本（编号：LCH-130）已保存在洛约拉学院植物标本馆供进一步参考。将植物材料在流动的自来水下清洗三至四次，之后将其在室温下阴凉干燥三周。将干燥的植物材料粉碎成细粉，通过筛子（40目）并储存在密封容器中[18]。2.3. 植物提取物通过浸渍进行从植物材料中的提取。四种不同的溶剂，即己烷，乙酸乙酯将50 g粉末状植物材料浸泡在塞住的容器中的200 ml己烷中，并在室温下以120 rpm置于定轨振荡器上72小时。然后将混合物加压并通过Whatman No.1滤纸过滤，并使用旋转蒸发器在减压下浓缩。对其他三种溶剂遵循相同的程序。使用每种溶剂一式三份进行浸提工艺。将干燥的粗提物储存在琥珀色小瓶中，并置于4 °C的冰箱中[18，19]。2.4. 乙酸乙酯萃取物的柱层析分离乙酸乙酯萃取物（EAE）经硅胶柱层析分离植物成分。用硼硅酸盐材料制成的用丙酮充分冲洗色谱柱，并在填充前完全干燥。在玻璃棒的帮助下，将一块玻璃棉放置在柱的底部将海砂（50沙滩派对-以防止柱干燥。采用从低极性到高极性的溶剂（即正己烷到甲醇）梯度洗脱法分离EAE组分。以不同的比例。将流速调节至5 ml/min，并为每个级分收集40 ml溶剂。2.4.1. 馏分的TLC分别收集级分并进行TLC（20 × 20 cm铝片，涂有硅胶60 F254）以检测植物化合物的存在。TLC板用香草醛-con喷雾。将15 g香草醛溶于250 ml乙醇+2.5 ml浓H2SO4中，在100 °C热风烘箱中干燥20合并具有相同Rf值的级分，并使用旋转蒸发器浓缩至干测量级分的干重通过HPLC进一步分析浓缩级分和EAE中抗氧化剂酚类化合物2.5. 馏分和EAE的HPLC分析EAE和S.通过两种方法使用两种不同的流动相来测定molesta，所述流动相是基于在特定保留时间和双波长检测中溶剂系统的不同等级来选择的[20]。所有样品的分析使用Shimadzu LC-10 AT VP，Luna 5 uC18反相分析柱（250 × 4.6 mm），二元梯度模式，SPD-M10 A VP光电二极管阵列检测器（PDA），进样体积20 ml，总流速1 ml/min，柱温箱温度25 ℃，检测波长280 nm。将55 mg EAE和各级分溶于3 ml甲醇中进行分析。用于流动相的溶剂预先通过微孔过滤，并在使用前脱气。槲皮素，抗坏血酸，苯甲酸，没食子酸，香草醛，间苯二酚和邻苯二酚被用作标准溶液的酚类化合物的定量。2.5.1. 方法A采用方法A对抗坏血酸、苯甲酸、没食子酸、香草醛、间苯二酚和邻苯二酚进行HPLC分析采用两种溶剂的梯度洗脱定量测定抗坏血酸、苯甲酸、没食子酸、香草醛、间苯二酚和邻苯二酚：溶剂A（乙腈）和溶剂B（0.1%磷酸水溶液）[21]。梯度洗脱程序以92%的溶剂B开始，并在该浓度下保持0-35分钟。45分钟2.5.2. 方法B采用方法B进行槲皮素的HPLC分析。使用两种溶剂的梯度洗脱进行定量表1S. 分子级分使用溶剂将样品冲洗干净通过关闭旋塞阀将己烷倒入柱中直至3/4水平使用200 g硅胶（60二氧化硅洗脱液数量（等份，每份40 ml）溶剂系统馏分名称馏分产率（g）用己烷制备浆液，并从塔的顶部倾倒约2/3的塔，同时排出溶剂以帮助适当填充塔。将海砂添加到二氧化硅浆料的顶部至Icm高度，并且用溶剂冲洗砂粒。将20 g EAE与最少量的己烷混合，并从柱的顶部沿着侧面倾倒下来，并用溶剂冲洗。将海砂添加到提取物的顶部至Icm高度。浸提液上方6 cm处的溶剂水平1（《古兰经》90：10）165（60：40）376（30：70）532（0：100）584（90：10和80：20）级分A六点零六分馏分B 1.24馏分C 2.22级分D2.03馏分E 3.62T.G. Gini，G. Jeya Jothi/埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）197-203199表2存在于EAE和S的馏分A中的酚类化合物的保留时间。性骚扰乙酸乙酯提取物酚类化合物保留时间区域高度浓度保留时间区域高度浓度抗坏血酸2.87552,90016,88184.446抗坏血酸2.90929,38110,03146.901没食子酸6.09733532270.534没食子酸–––间苯二酚12.85016381540.625间苯二酚–––儿茶酚16.200559,22226,58024.276邻苯二酚15.96618,1298690.787香草醛28.254294,22014,32422.544香草醛28.116198,708958615.225苯甲酸39.809517,86519,835348.303苯甲酸40.074302,3387069203.345槲皮13.69460,04897195.526槲皮素14.00460,47313,2695566表3S馏分B和C中存在的酚类化合物的保留时间。 性骚扰槐叶萍馏分B槐叶萍馏分C酚类化合物保留时间区域高度浓度酚类化合物保留时间区域高度浓度抗坏血酸2.87942,56112,36867.941抗坏血酸2.88830,57610,51248.810没食子酸5.97772895161.162没食子酸5.79515181590.242间苯二酚12.62928411751.083间苯二酚12.74630741971.172儿茶酚15.84978,36935423.402儿茶酚15.428488,42323,86321.202香草醛27.8531,838,37687,042140.860香草醛28.104192,99510,77514.788苯甲酸40.71058,049268439.042苯甲酸––––槲皮13.85972,02810,0796.629槲皮13.714621,92882,69557.238表4S的馏分D和E中存在的酚类化合物的保留时间。性 骚扰槐叶萍组分D槐叶萍组分E保留时间区域高度浓度保留时间区域高度浓度抗坏血酸2.86230,46710,42648.634抗坏血酸2.86867,44322,903107.661没食子酸–––没食子酸5.99415,29312542.437间苯二酚12.46955,965214721.343间苯二酚12.58568875792.627邻苯二酚15.7322,048,513104,86088.926邻苯二酚15.849888,98646,23638.591香草醛28.579302,74716,27523.197香草醛28.78284,59048806.481苯甲酸39.91889566506.024苯甲酸40.55712,75211138.577槲皮素13.95890,99912,9758.375槲皮素13.656128,31328,60911.809Fig. 1. S. EAE中存在的酚类化合物的HPLC图谱。性骚扰图二. S. EAE中槲皮素的HPLC图谱。性骚扰200T.G. Gini，G. Jeya Jothi/埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）197-203图三. 存在于S的级分A中的酚类化合物的HPLC图谱。性骚扰见图4。存在于S. 性骚扰图五. 存在于S的级分B中的酚类化合物的HPLC图谱。性骚扰见图6。存在于S的级分B中的槲皮素的HPLC图谱。性骚扰见图7。 存在于S的级分C中的酚类化合物的HPLC图谱。性骚扰T.G. Gini，G. Jeya Jothi/埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）197-203201见图8。存在于S的级分C中的槲皮素的HPLC图谱。性骚扰见图9。 存在于S的级分D中的酚类化合物的HPLC图谱。性骚扰见图10。存在于S的级分D中的槲皮素的HPLC图谱。性骚扰见图11。 存在于S的级分E中的酚类化合物的HPLC图谱。性骚扰图12个。 存在于S的级分E中的槲皮素的HPLC图谱。性 骚扰槲皮素：溶剂A（甲醇）和溶剂B（4%乙酸）[22]。用100%溶剂B开始梯度洗脱程序，并在该浓度下保持0随后用50%的溶剂B处理4-10分钟，然后总运行时间为22分钟。202T.G. Gini，G. Jeya Jothi/埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）197-2033. 结果S.使用TLC测试Molesta EAE以检测各种植物化合物，并用香草醛-con喷雾。H2SO4喷雾干燥，在100°C的热风烘箱中干燥20将显示相同Rf值的植物化合物合并成单一级分。合并后获得的活性级分总数如下：洗脱液1-164等份，每份40 ml，在溶剂系统H：EA中（100：0和90：10）形成级分A;在溶剂系统H：EA中洗脱165-375等份，每份40 ml（80：20、70：30和60：40）形成级分B;在溶剂系统H：EA中洗脱376-531等份，每份40 ml（50：50、40：60和30：70）形成级分C;在溶剂系统H：EA中洗脱532-583等份，每份40 ml（20：80、10：90和0：100）形成级分D，并且在溶剂系统EA：MEOH（100：0、90：10和80：20）中的洗脱物584-650等份（每份40 ml）形成级分所得馏分的产率示于表1中。S. 分析了molesta馏分和EAE中的七种酚类化合物，抗坏血酸、槲皮素、没食子酸、间苯二酚、邻苯二酚、香草醛和苯甲酸。存在于每个级分和EAE中的酚类化合物示于表2、3和4中，其中峰显示不同的保留时间（RT）。EAE中存在的酚类化合物（图 1和2）为香草醛（ 28.254 min ） 、 苯 甲 酸 （ 39.809 min ） 、 槲 皮 素 （ 13.694min）、抗坏血酸（2.875 min）、没食子酸（6.097 min）、间苯二酚（12.850 min）和邻苯二酚（16.200 min）。槲皮素（14.0分钟）、抗坏血酸（2.909分钟）、邻苯二酚（15.966分钟）、香草醛（28.116分钟）和苯甲酸（40.074分钟）存在于级分A中（图1A和1B）。第3和第4段）。抗坏血酸（2.879 min）、槲皮素（13.859min）、没食子酸（5.977 min）、间苯二酚（12.629 min）、邻苯二酚（15.849 min）、香草醛（27.853 min）和苯甲酸（40.710min）存在于级分B中（图1A和1B）。5和6）。没食子酸（5.795min）、抗坏血酸（2.888 min）、槲皮素（13.714 min）、间苯二酚（ 12.746 min）、儿茶酚（ 15.428 min ）和香草醛（ 28.104min）存在于级分C中（图1A 和1B ）。第7和第8段）。儿茶酚（15.732 min）、抗坏血酸（2.862 min）、间苯二酚（12.469min）、槲皮素（13.958 min）、香草醛（28.579 min）和苯甲酸（39.918 min）存在于级分D中（图1A和1B）。 9和10）。级分E中存在间苯二酚（12.585 min）、邻苯二酚（15.849 min）、香草醛（ 28.782 min）、苯甲酸（ 40.557 min ）、槲皮素（ 13.656min）、抗坏血酸（2.868 min）和没食子酸（5.994 min）（图1A和1B）。第11和12段）。4. 讨论在S. Molesta，Li et al. [23]使用生物活性导向的乙醇提取物分级分离得到50种化合物，包括17种松香烷二萜（1，172939）、4个脱辅基类胡萝卜素（42和23）、两种单萜（5和46）、两种茉莉酸酯（33和34）、两种类固醇（40和41）和两种香豆素（47和48）。所有的松香 烷 型 二 萜 均 从 S. 其 中 ，salviniol（1）是一种罕见的具有新的ferruginol-薄荷醇偶联骨架的双萜类化合物，salviniside I（2）和salviniside II（3）是一种新的具有独特的10元大二聚体结构的苯并呋喃葡萄糖结合物。另一项研究表明，柚苷是S.通过HPLC鉴定并定量了梨木虱，然后是杨梅苷以及芦丁、表儿茶素、儿茶素、槲皮素、山柰酚和香草醛。还发现这些化合物具有清除自由基的潜力[24]。Cary和Wehrman [25]的一项研究表明，S. 在高磷、高氮浓度下，小蠹生长最快（2-由于这种植物可以从水生环境中吸收氮和其他矿物质，因此推测这种植物含有营养生物质，可以作为替代的非常规植物蛋白质来源。它还具有高粗纤维、单宁、木质素和灰分含量，这可能限制其在非反刍动物饲养操作中的使用[26]。 根据Moozhiyil和Pallauf的研究[27]，S.与陆地牧草相比，小鼹鼠在所有生长阶段的比例都相对较高（幼鼠：32.2%;中等：37.5%;成熟：36.8%）。木质素含量高达13.7%，粗灰分平均为17.3%，粗纤维平均为35.2%。根据上述研究结果，单宁水平随着植物成熟而增加。本研究鉴定了七种酚类化合物，分别为抗坏血酸、槲皮素、没食子酸、间苯二酚、邻苯二酚、香草醛和苯甲酸。因此，可以得出结论，该植物是一种可能的天然抗氧化剂，可以用作合成抗氧化剂药物的主要候选者，这些药物可以用于治疗许多氧化应激相关疾病。5. 结论本文报道了在S. 性骚扰乙酸乙酯提取物具有显著的药理活性，因此采用不同极性的不同溶剂进行硅胶柱色谱分离研究发现，S.Molesta是一种水生蕨类植物，具有很好的药用特性，并且由于存在大量酚类化合物，因此是一种有效的天然抗氧化剂。因此，需要进一步的研究来纯化这些酚类成分，以用作开发新型抗氧化药物的先导化合物。利益冲突我们声明我们没有利益冲突。确认本研究由印度新德里少数民族事务部大学资助委员会Maulana Azad国 家 奖 学 金 计 划 （ F1-17.1/2012- 13/MANF-2012-13-CHR-KER-7693）提供资金支持。我们感谢dr.Jayaraj，CIU，KFRI，Peechi，Thrissur，India，帮助我们进行HPLC分析。我们非常感谢CinziaForni 教 授 （ 意 大 利 ） 、 Ignatius Mary 博 士 （ 法 国 ） 和 T.V.Poonguzhali博士（钦奈）提出的宝贵建议和意见。引用[1] 放大图片作者：Randhir R，Lin YT，Shetty K.酚类化合物，其抗氧化剂和抗微生物活性在黑暗发芽胡芦巴芽响应肽和植物化学诱导剂。Asia Pac J Clin Nutr 2004;13：295-307.[2] 布拉沃湖多酚：化学，膳食来源，代谢和营养意义。Nutr Rev1998;56：317-33.[3] 布代AM。酚类化合物的研究进展与现状植物化学2007;68（22-24）：2722-35。[4] 雅各布·RA 综合抗氧化系统。Nutr Res1995;15：755-66.[5] AfanasevIB，Dorozhko AI，Brodskii AV，Kostyuk VA，Potapovitch AI. 芦丁和 槲 皮素 抑 制 脂 质过 氧 化 作 用的 螯 合 和 自由 基 清 除 机制 。 生 物 化 学药 理 学1989;38：1763-9.[6] Amarowicz R，Pegg RB，Rahimi-Moghovic P，Barl B，Weil JA.加拿大大草原植物的自由基清除能力和抗氧化活性。食品化学2004;84：551-62.[7] Benavente-Garcia O，Castillo J，Marin FR，Ortuno A，Del Rio JA. 柑橘类黄酮的用途和性质。 农业食品化学杂志1997;45：4505-15.T.G. 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