·工程6（2020）533研究绿色植保创新-文章甘油诱导的鼠李糖脂促进伯克霍尔德氏菌降解二苯并噻吩。 C3卡米拉Ortega Ramirez，Abraham Kwan，Qing X.李彦宏夏威夷大学分子生物科学与生物工程系，美国，檀香山，96822阿提奇莱因福奥文章历史记录：2018年12月23日收到2019年5月20日修订2019年7月23日接受2020年1月25日在线提供关键词：生物降解生物修复生物表面活性剂生物转化甘油微生物代谢鼠李糖脂A B S T R A C T在高度城市化的地区，人类活动造成的污染损害了土地的完整性，减少了可用于农业活动的土壤二苯并噻吩（DBT）是一种常见于城市地区的杂环人类接触的可能性及其健康风险使DBT成为一种令人关注的化学品;因此，需要对其进行环境管理。我们利用甘油刺激伯克霍尔德氏菌。C3为降解DBT，在①DBT生物降解动力学方面②细菌生长;③鼠李糖脂（RL）生物合成;在最佳甘油与DBT摩尔比下，DBT的生物降解速率常数增加了18倍，在第1天相对于单独使用DBT的培养物，DBT的生物降解提高了25%-30%。这种增强与细菌生长和RL生物合成的增加相关。蛋白质组学研究揭示了参与RL生物合成的上游和主要步骤的酶。在添加甘油和DBT的培养基中鉴别出RL同源物Rha-C10-C10、Rha-Rha-C10-C10、Rha-Rha-C10-C12和Rha-Rha-C12-C12，而在不含甘油或添加RL抑制剂的培养物中仅鉴别出Rha-C12-C12。研究表明，甘油通过增加RL合成和细菌生长来增强DBT的生物降解。这些结果保证了进一步研究甘油对环境的生物刺激作用，以推进生物修复技术，并增加农业土壤的可用性。©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍土壤和水是农业实践的基本自然资源。在高度城市化地区，人类活动造成的污染损害了农田和水流的完整性，导致土壤功能下降和食品安全问题。北非和南亚等地区使用了90%以上的可用土地[1]。在中国，污染水用于土壤灌溉导致土壤污染[2]。土壤生物修复有助于恢复土地，以便重新利用和种植作物。生物修复利用微生物代谢从环境中去除污染物[3，4]。多环芳烃（PAHs）是人类活动产生的一类典型污染物[2]。二苯并噻吩（DBT）是一种主要的含硫PAH[5]，通常用作评估PAH土壤污染的模型化学品[5]。DBT是一个*通讯作者。电子邮件地址：qingl@hawaii.edu（Q.X. Li）。疏水性化合物，水溶性为7.9l mol L-1，DBT的亲脂性使其能够在环境中浓缩并通过食物链进行生物降解，从而产生食品安全和生态毒理学风险[7]。研究发现，斑马鱼胚胎暴露于DBT的剂量依赖性会破坏心脏功能，较高剂量与形态异常和死亡率相关[6]。一项研究表明，DBT及其代谢产物在T47 D人乳腺癌细胞中起雌激素化合物的作用[8]。DBT在沉积物和城市化地区的高检测频率、人类暴露的可能性和健康威胁使其成为一种令人关注的化学品;因此，需要对DBT进行环境管理[5，8]。疏水性污染物（如DBT）的生物修复经常受到微生物丰度低和化学生物利用度差的限制，导致生物降解动力学低[9]。除了分解代谢酶[10-https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.01.0062095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng534C.A. 奥尔特加·拉米雷斯和 其他/工程 6（2020）533···××·×·化学溶解和生物利用度[15，16]。细菌中生物表面活性剂和分解代谢酶的产生[17-Burkholderiasp. C3是一种从多环芳烃污染场地分离的多环芳烃降解细菌[21]。它含有负责降解多环芳烃（如菲）的双加氧酶基因[22，23]。本研究旨在探讨甘油作为共底物刺激菌株C3降解DBT。我们的初步研究表明，甘油可以增强DBT的生物降解，不像其他测试的底物（例如，葡萄糖）。在培养过程中，当补充甘油时，观察到明显的DBT溶解，泡沫形成和早期的DBT降解C3。这在单独补充DBT的培养物中未观察到。这种差异表明表面活性剂的分泌。甘油容易进入b-氧化和从头脂肪酸合成（FAS II）的脂质代谢途径，影响鼠李糖脂（RL）生物表面 活 性 剂 和 聚 羟 基 链 烷 酸 （ PHA ） 的 产 生 [24 ， 25] 。 关 于Burkholderiasp.产生RL的报道很少。据我们所知，这是第一次报道甘油诱导RL生物合成和DBT生物降解之间的直接关联。我们的研究表明，甘油的生物刺激可以导致有效的降解通过增加疏水性污染物的生物利用度来减少环境中的DBT。因此，本研究所研究的技术可能适用于生物修复疏水性污染物，如杀虫剂。2. 材料和方法2.1. C3培养和DBT生物降解将试管在450°C下烘烤3小时。将溶解在丙酮中的DBT置于试管中，然后在氮气（N2）下完全蒸发丙酮。接下来，加入5 mL基本培养基（MM）[26]和适当体积的50%甘油水溶液DBT的最终浓度为0.54 mmol L-1（100 ppm（1 ppm = 10- 6）），而甘油的最终浓度为0、0.05、0.5、5、50、200或500 mmol L-1。将在30 °C下在富含Luria-Bertani（LB）的培养基中生长过夜的C3细胞0.05外径600还制备了含甘油但不含DBT的培养物。在RL生物合成抑制实验中，2-溴己酸（HEX）和2-溴辛酸（OC）各自的终浓度为2 mmolL-1。将培养物在旋转振荡器中在30 °C下以200转/分钟孵育。高压灭菌的C3细胞用作对照。2.2. DBT的提取和分析提取DBT，并根据参考文献（2005年）进行分析[27]. 总之，在用HCl将培养物酸化至约pH 2-3后然后在配备有Aqua C18柱（150mm × 4.60 mm，5μ m粒度; Phenomenex，Inc.，USA），并在245 nm处检测。流动相为60%乙腈水溶液（ACN）。2.3. 数据计算绘制时间进程点，平均值条的标准误差代表三种或六种生物学特性复制品。降解曲线用一级动力学方程C/C0×e-kt拟合，其中k是DBT生物降解速率常数，C是在时间t测量的浓度，C0是初始浓度（表1）。DBT半衰期（t1=2）使用t1=2¼min2min=k计算。使用IBM SPSSStatistics 19进行统计测试进行的检验是Tukey2.4. 蛋白质提取在第2天从培养物中收集C3细胞，用过滤和灭菌的蒸馏水洗涤三次，然后根据报告的方法[28]进行蛋白质提取，并稍作修改。通过混合9mL的裂解缓冲液制备裂解缓冲液。9 mol L-1尿素溶液加1 mL 10蛋白酶抑制剂溶液。蛋白酶抑制剂溶液由Sigma fast蛋白酶抑制剂片剂（Sigma-Aldrich，USA）制备。以5850g（g= 9.8m·s-2）离心完全除去培养基后，将细胞沉淀重悬于700μ L裂解缓冲液中。该细胞将悬浮液加入到300μ L溶胞缓冲液中，用0.5 mm（直径）玻璃珠（BioSpec Products，USA）以2：3预填充的螺旋盖小瓶。通过在微型珠粒打浆机（BioSpec Products，USA）上以最大速度进行珠粒打浆60秒和在冰上进行珠粒打浆60秒的六个循环来破坏细胞膜。在通过以20 - 820g离心15分钟除去细胞碎片后，使上清液通过Amicon Ultra-0.5 mL离心过滤器（3 K截止值; Millipore，USA）以在过滤器上浓缩蛋白质。然后用500μ L Milli-Q（mQ）水洗涤过滤器2.5. 用于液相色谱质谱分析的将36μ g的蛋白质量上样到12%十二烷基硫酸钠凝胶用考马斯蓝染色以显现蛋白质条带。将每个凝胶泳道分级（约1 mm3），用2 5mmol·L-1碳酸氢铵（NH4- HCO3）/5 0% ACN洗涤，直至碎片变澄清。在56 °C下还原二硫苏糖醇30 min和在环境温度下碘乙酰胺烷基化20 min之前，用100% ACN使凝胶片脱水。用胰蛋白酶/ Lys-C混合物（质谱级，Promega，USA）在37 °C下进行凝胶内蛋白质消化16- 18 h。用Pierce C18tips（Thermo Scientific，USA）脱盐和浓缩蛋白质，然后在Bruker nanoLC-amaZon speed离子阱质谱仪（MS）系统上分析。在C18分析柱（0.1 mm 150 mm，3μ m，200μ m，Bruker，USA）上分离肽，在2 min运行延迟后，用0.1%甲酸中的5%至65% ACN梯度洗脱80 min洗脱90分钟后，将流动相更换为含有0.1%甲酸的95%ACN并保持10分钟，然后用含有0.1%甲酸的5%ACN平衡柱流速为800 nL min-1。 MS参数设定为毛细管电压1600和毛细管温度149.5 °C。从质荷比（m/z）400至3000的测量扫描将动态排除设置为重复相同的前体离子两次，然后排除它0.8分钟。2.6. 蛋白质数据库和数据库检索用DataAnalysis软件（Bruker，USA）将原始文件（文件类型BAF）转换为吉祥物通用格式（.mgf）高峰C.A. Ortega Ramirez等人/工程6（2020）533535·¼××××········×··×表1DBT的生物降解速率常数和半衰期的提高依赖于甘油浓度。底物速率常数（d-1）R2半衰期（d）N倍数变化a0.5mmol·L-1 DBT 0.025 ±0.01 0.63 27.5 30 00.05mmol·L-1甘油和0.5mmol·L-1 DBT 0.064 ±0.01 0.84 10.8 15 1.60.5mmol·L-1甘油和0.5mmol·L- 1DBT 0.359 ± 0.09 0.90 1.9 15 13.2b5 mmol·L-1甘油和0.5mmol·L-1 DBT 0.390 ± 0.0 5 0.99 1.8 15 14.5b50 mmol·L-1甘油和0.5mmol·L-1 DBT 0.479 ± 0.02 0.99 1.5 30 18.0b200 mmol·L-1甘油和0.5mmol·L-1 DBT 0.229 ± 0.02 0.99 3.0 15 8.1b500 mmol·L-1甘油和0.5mmol·L-1 DBT 0.113 ±0.00 1.00 6.1 15 3.50.5 mmol·L-1DBT（C3细胞）0.002 ±0.01 0.31 287.6 27-0.950 mmol·L-1甘油和0.5 mmol·L-1DBT（C3细胞）0.009 ±0.00 0.99 70.44 15-0.6指数衰减方程了c0e-kt 用于拟合a相对于0.5 mmol L-1DBT的速率常数。b这些甘油浓度下的生物刺激具有统计学显著性（Tukey HSD; LSD; Bonferroni;P 0.001）。挑选算法是Apex。绝对强度阈值设定为100。规范和同种型蛋白质序列（492个条目）数据库为FASTA格式，并从UniProt知识库下载（2016年4月4日上午9：35以伯克霍尔德氏菌属（UniProt taxonomy：32008）为固定检索词，不同蛋白质名称为可变检索词，构建数据库使用MyriMatch搜索引擎进行数据库检索[29]。配置如下：仪器类型为离子阱，前体质量为自动，酶为胰蛋白酶/P（允许识别胰蛋白酶/Lys-C混合物酶），平均前体容限为1.5m/z，片段容限为0.5m/z，单前体容限为10 ppm。修饰如下：脲甲基（固定）和蛋氨酸氧化（可变）。2.7. 数据归一化用IdPicker软件获得在每个处理中鉴定的蛋白质的光谱计数。处理为：（A）0.54 mmol L-1DBT;（B）50 mmol L-1甘油;（C）50 mmol L-1 甘 油 +0.54 mmol L-1DBT; （ D ） 50 mmol L-1 甘油+0.54 mmol L-1DBT +2 mmol L-1OC。将肽与其MS/MS光谱匹配的过滤器如下：最大错误发现率（FDR）为1%，每个肽和每个匹配至少有一个光谱为了使肽与蛋白质匹配，允许最少两种不同的肽和光谱以及最少两种额外的肽[30，31]。数据根据参考文献中的假设进行标准化。[32]-即，MS/MS强度等于1且不考虑肽长度。 应用log（归一化计数+1），并将归一化数据与原始数据进行比较。使用DEseq进行方差分析（ANOVA，p值0.05）以搜索具有统计学显著性的蛋白质丰度变化[33]。计算了甘油DBT相互作用项的p值和对数倍数变化（FC），并在表2中显示了每种蛋白质。 log FC表示甘油DBT相互作用项的效应量。 当log FC上调时，表明甘油DBT相互作用对含有这种相互作用的处理的蛋白质丰度具有积极影响（即，处理（C）和（D））。2.8. RL提取和定量根据参考文献[34]提取RL。总而言之，在第2天通过以5850g离心10分钟并以0.2μ m孔径过滤除去细胞。将介质用乙酸乙酯萃取三次。合并提取物并在温和的氮气流下干燥，然后将残留物重悬于0.5 mL甲醇中。将相同的程序应用于RL标准品（50lg·mL-1），溶于5或MM中的50 mmol L-1甘油。使用苔黑酚测定法定量RL [35]（0.19%苔黑酚（w/v）在53%硫酸（v/v）。一收集250μL等分试样的样品，干燥，并重新悬浮于250μ L水中。向100μ L RL提取物或不同浓度的RL标准品中加入900μ L地衣酚溶液。 将混合物在室温下孵育30分钟。80 °C。在421 nm处读取吸光度。RL标准曲线在0 ~ 5 0 0lg·mL-1范围内，制备了一种新型的生物活性炭。将再悬浮于甲醇中的剩余250μL用于在配备有AquaC18柱（150 mm 4.60 mm，5μm粒度; Phenomenex，Inc.，美国），参考文献[34]。在4-5 min（F1）和5-6 min（F2）收集两个RL级分，并在45 ℃下干燥至完全。 将级分重悬于10μL 10%ACN/水中，并用Pierce C18尖端（Thermo Scientific，USA）脱盐。生产商方案修改如下：未使用三氟乙酸。将F1和F2样品与C18尖端结合10次，用5%ACN洗涤5次，并用10μ L 70%ACN洗脱。将样品完全干燥，45°C，并重悬 于21L 含 有 40mg·mL-1 的 2 ， 5- 二 羟 基 苯 甲 酸 （ DHB ） 基 质 的50%ACN中将总共1μL基质点在靶板上并风干，然后点样1μ L样品/基质混合物2.9. RL识别RL同系物在基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI/TOF）ultraflexIII质谱仪（Bruker，USA）上进行鉴定，质谱仪按照已公布的程序以正反射模式运行[36]。用聚合度（DP）系列校准仪器：麦芽三糖水合物（DP 3，MW：504.44g·mol-1）、麦芽四糖（DP 4，MW：666.57 g·mol-1）、麦芽五糖（DP 5，MW：828.71 g·mol-1）和麦芽六糖（DP 6，MW：990.85 g·mol-1）[37]。将每种DP系列的500lmol·L- 1等分试样溶于mQ水中。将总共5μ L的每个DP系列与20μ L的DHB基质混合至62.5μ mol L-1的最终浓度。将该混合物的2μL等分试样点在MALDI靶板上并使其风干。测量m/z范围为300-1200，每次激光发射50次离子被抑制在下面使 用 Flexi Analysis 和 Compass Isotope Pattern 软 件 （ Bruker ，USA）进行质谱分析。使用根据报告的RL[38]创建的计算机数据库分配RL峰，误差质量为0.5 Da。使用Agilent 6520 A液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪（LC-Q-TOF-MS）系统（Agilent Technologies ，Canada）进行样品的MS/MS分析。将RL样品（20μ L）在Luna C18柱（100 mm 2.0mm，3μ m粒度）（Phenomenex，Inc.，USA）中，在15分钟内从5%ACN在5 mmol L-1甲酸铵水溶液缓冲液（pH 3.3）中开始至95%ACN，然后保持10分钟。536C.A. 奥尔特加·拉米雷斯和 其他/工程 6（2020）533·················表2在伯克霍尔德氏菌中鉴定的介导RL生物合成的蛋白质孵育第2天的C3UniProt ID蛋白质描述相对丰度（按处理对数列出）FCp值 A B C DU1 XYV 8 HAA合酶（RhlA）0.85 - 0.86 1.09 1.52 0.090A0 A0 B6 RU 44鼠李糖基转移酶1（RhlB）1.46 1.02 - 1.28-0.57 0.407C4I4U9 RhlB 0.85 0.81 - 1.34-1.20 0.274Q3 JLM 3 * 鼠李糖基转移酶2（RhlC）1.00 0.43-4.34 0.001aA2RWE5 RhlC 0.94 0.43-4.34 0.001aE1 TAD 4磷酸葡萄糖变位酶/磷酸甘露糖变位酶（AlgC）0.45 0.62 0.97 0.54 0.68 0.360B4 ECS 6dTDP-葡萄糖4，6-脱氢酶（RmlB）-0.13 0. 24 0.27 0.84 0.503H6 TI 92 dTDP-4-甘露糖-3，5-差向异构酶（RmlC）1.13 - 0.58 1.24 0.91 0.233Q2 SYI 1 dTDP-4-鼠李糖还原酶（RmlD）1.22 0.60 1.10 1.52 2.73 0.030aQ63 S87b-氧代酰基-ACP合酶2（FabF）-0.62 1. 38-0.78 0. 235A0 A0 D5 VAR 9 3-氧代酰基-ACP-还原酶（FabG）1.32 1.06 1.36 1.45-0.58 0.328A0 A0 D5 VAC 6 3-羟基-ACP-脱氢酶（FabZ）0.98--1.10 1.39 0.140K8 R 0 G3酰基辅酶A脱氢酶（FadE）--0.69 - 1.99 0.089Q3 JVY 2烯酰辅酶A水合酶/3-羟酰辅酶A脱氢酶（FadB）-1.15 1. 14--0.20 0.768结果表明：（1）DBT处理组（A组）：0.5mmol·L- 1DBT;（ 2）甘油处理组（B组）：5 0mmol·L-1Glycerol;（ 3）甘油+0.5mmol·L- 1DBT;在每个处理中分析三个生物学重复。显示了每种处理的平均标准化值。log FC代表甘油×DBT相互作用项。ACP：酰基载体蛋白; CoA：辅酶A; HAA：3-羟基链烷酸。a各处理间相对丰度变化差异显著（p0.05）。流动相流速为0.3mL min-1。在运行之间将柱平衡10 min。电喷雾电离接口设置为负模式。毛细管电压为4000 V。碎裂器和撇渣器电压为180，80 V，分别。当系统处于MS/MS模式时，干燥和雾化气体是氮气，而氦气是碰撞气体。气体温度为350 °C。干燥气体流速为10 L min-1。雾化器压力为25 psi（1 psi = 6.895 kPa）。通过m/z50-1700扫描获得全扫描数据。MS/MS模式中的碰撞能量为20 eV。3. 结果和讨论3.1. 甘油生物刺激增强DBT生物降解，伯克霍尔德氏菌C3生长采用生物刺激法研究甘油对伯克霍尔德氏菌C3降解DBT能力的影响。使用DBT和甘油的共底物实验既没有表现出碳分解代谢物抑制现象，也没有表现出拮抗作用，这在其他共底物混合物中已有报道[16，39，40]。结果表明，甘油的生物刺激支持C3细胞生长，同时增强DBT生物降解，如图1所示。实验结果表明，甘油与DBT的摩尔比和培养时间对DBT的生物降解有促进作用。当用0.5、5、50和200 mmol L-1甘油刺激培养物时，观察到显著差异（Tukey HSD; LSD; Bonferroni;p0.001）。在这些浓度下，甘油在培养一天后使DBT的生物降解提高了25%-30%。在甘油（50 mmol L-1）与DBT摩尔比为92.6：1的培养物中，菌株C3降解100%的0.54 mmol L-1（100 ppm）DBT。这将最佳甘油浓度用于蛋白质组学和质谱实验。在该浓度下，DBT的半衰期降至最低-从27.5天降至1.5天，DBT降解速率常数增加了18倍（表1）。在高压灭菌细菌的对照培养物中观察到可忽略的降解，如表1中的负倍数变化所示。与DBT生物降解动力学相似，添加50 mmol L-1甘油，C3降解92%的在含0.5 mmol L-1甘油的培养物中，第10天 0.54 mmol L-1 DBT然而，在该甘油浓度下，C3生长保持在0.05 OD600，这表明生物量的增加，质量不是DBT生物降解增强的唯一原因，还涉及其他分子机制。统计分析表明，DBT生物降解在第7天和第10天之间无显著差异（图基HSD;LSD;邦弗罗尼;p0.05）。因此，建议在测试条件下进行7天的生物降解。DBT作为唯一碳源不支持菌株C3细胞生长。每10天孵育后，OD600保持在0.05，与初始接种物相等（图1）。在单一碳源的液体培养中，PAH生物降解取决于细菌菌株、PAH结构和PAH浓度。例如，菌株C3在第7天降解94%的40 ppm DBT[22]第20段。我们的结果表明，C3降解11%-12%的100 ppm DBT在第7天。在此浓度下，DBT对细菌没有明显的益处，甚至观察到生物降解效率的降低。这一发现得到以下事实的支持：与仅在甘油中生长相比，在甘油-DBT混合物中C3细胞生长受到抑制。例如，0.54mmol·L-1DBT与50 ~ 500 mmol·L-1甘油的混合物在培养1d后开始抑制生长，OD 600最高可达0.30。DBT在低浓度甘油（0.05~50 ~ 500 mmol L-1甘油的生长抑制作用可能与DBT、DBT代谢物或两者的毒性有关。据报道，多环芳烃3.2. RL生物合成途径在伯克霍尔德氏菌属中被激活。C3甘油是假单胞菌类RL生产的良好碳源[38]。它可以被代谢同化到影响PHA颗粒形成和RL产生的脂质途径中[24，38，43，44]。表2列出了在四种处理中检测到的酶的相对丰度，即（A）0.54 mmol L-1 DBT;（B）50 mmol L-1甘油;（C）50 mmol L-1甘油和0.54 mmolL-1 DBT;和（D）50 mmol L-1甘油，0.54 mmol L-1 DBT，2mmol L-1 OC-以及log FC和p值。 这些酶负责RL生物合成，如图所示。 二、RL的生物合成需要分别由FAS II[45，46]和/或β-氧化[24]途径产生的R-3-羟基癸酰基-ACP或-CoA脂质前体，以及dTDP-L-鼠李糖前体[43]。一旦产生脂质和糖前体，RhlABC介导单或二-RL的形成检测到参与dTDP-L-鼠李糖生物合成的合成代谢酶AlgC 和RmlBCDC.A. Ortega Ramirez等人/工程6（2020）533537×图1.一、伯克霍尔德氏菌降解DBT动力学研究在0.5 4mmol·L- 1DBT和不同甘油添加量（0、0.0 5、0.5、5、5 0、2 0 0和5 0 0mmol·L-1）条件下培养10 d，观察C3的在四个治疗（图2，表2）。RmlD催化从dTDP-4-酮-6-脱氧-L-甘露糖到dTDP-鼠李糖的最后步骤。不同处理组中RmlD相对蛋白丰度的变化显著（p0.05），log FC上调。log FC表示甘油DBT相互作用项的影响其上调表明这种相互作用对含有该术语的处理具有积极影响。催化途径中前一步骤的酶RmlC也被上调。RmlD和RmlC两者的相对丰度表明RL糖前体的合成不受RL生物合成抑制剂OC抑制。在四种处理中检测到来自FAS II和/或b-氧化途径的酶（图2，表2）。FabG是通过FAS II途径催化R-3-羟基癸酰基-ACP合成的最后一步的酶[46]。在所有处理中FabG的相对丰度> 1，表明检测到该蛋白然而，p值高于0.05，意味着它们的相对丰度没有显示出显著差异（表2）。在处理（C）中，FabF催化的前切步骤被上调。β- 氧化酶FadB和FadE在处理（C）中含量丰富（表2）.结果表明，在培养的第2天，FAS II和b-氧化途径的后期阶段在C3中是活跃的。RhlA产生3-羟基链烷酸（HAA），其然后被RhlB用于单鼠李糖脂生物合成[47]。 鉴定了RhlA，log FC显示上调。还鉴定了鼠李糖基转移酶RhlB和RhlC（表2）。RhlB和RhlC分别参与单-鼠李糖脂[48，49]和二-RL[50]的直接形成。表2中鉴定的蛋白质表明甘油诱导脂质前体用于C3细胞中RL生物表面活性剂的生物合成数据显示-利用FAS II和β-氧化途径参与脂质前体的合成。然而，尚不确定哪种途径占主导地位，因为这些途径在细胞中具有其他作用，例如细胞增殖。图二、伯克霍尔德氏菌RL生物合成相关蛋白的鉴定C3.粗体蛋白显示甘油×DBT相互作用项（log FC）上调FadB：烯酰-CoA水合酶/3-羟酰-CoA脱氢酶; FadE：酰基-CoA脱氢酶; FabF：b-氧代酰基-ACP合酶2; ACP：酰基载体蛋白; FabG：3-氧代酰基-ACP-还原酶; RhIA：HAA合酶; HAA：3-羟基链烷酸; RhIB：鼠李糖基转移酶1; RhIC：鼠李糖基转移酶2; AlgC：磷酸葡萄糖变位酶/磷酸甘露糖变位酶; RmlB：dTDP-葡萄糖4，6-脱氢酶; RmlC：dTDP-4-鼠李糖-3，5-差向异构酶; RmlD：dTDP-4-鼠李糖还原酶。538C.A. 奥尔特加·拉米雷斯和 其他/工程 6（2020）5333.3. RL生物合成及其抑制对Burkholderia sp.C3中DBT生物降解的影响DBT具有疏水性[6]，其生物利用度是生物降解的首要要求[15]。当添加甘油时，在培养物中观察到DBT增溶和泡沫形成。这些观察结果表明，剂我们的蛋白质组学结果表明，RL生物表面活性剂的生物合成途径是活跃的C3。因此，使用苔黑酚测定法研究RL与甘油诱导的DBT生物降解增强的相关性[51]。Gutierrez等人[25]表明，溴代链烷酸对RhlA的抑制抑制假单胞菌属物种中RL和PHA的产生，并且这种抑制依赖于图三.在无抑制剂的情况下，用2mmol·L-1的HEX或2mmol·L-1的OC和不同浓度的甘油（0、0.0 5、0.5、5、5 0和2 0 0mmol·L-1）培养Burkholderia图四、伯克霍尔德氏菌分泌的RL的HPLC色谱图C3培养液中加入0.54mmol·L- 1DBT和50mmol·L-1甘油，加入2mmol·L- 1HEX，或(c)2mmol·L- 1 OC培养液中加入0.54mmol·L- 1DBT、2mmol·L- 1HEX或2mmol·L- 1 OC。（g）从HPLC色谱图a，馏分2（F2）中鉴定的4种RL同系物（M1、M2、M3和M4）的MALDI-TOF-MS，和（h）Rha-C10-C10（M1）的LC-Q-TOF-MS 2C.A. Ortega Ramirez等人/工程6（2020）533539········使用溴代链烷酸。文献中也描述了对RL和PHA的抑制[24]。2-因此，使用溴代烷酸（HEX或OC）来探测RLs在菌株C3生物降解DBT中的作用。如果RL在DBT生物降解中起作用，HEX和OC应通过RL生物合成抑制来降低DBT生物降解当菌株C3在甘油/DBT混合物中培养时，相对于在单独的DBT中培养，定量RL分泌的增加。由不同浓度的甘油诱导的RL生物合成和分泌（图3（a））与降解的DBT量密切相关（图3（b）），通过HEX和OC抑制RL生物合成。结果与蛋白质组学研究结果一致; RL生物合成发生在C3中，并且与其生物降解能力密切相关。3.4. RL同源物由伯克霍尔德氏菌C3分泌使用含有Rha-Rha-C10-C10和Rha-C10-C10同系物混合物的RL标准品来鉴定实验样品中的RL。RL同源物在4至6分钟之间洗脱（图4）。实验样品的HPLC色谱图与RL标准品的HPLC色谱图匹配良好（数据未显示）。在0.5mmol L-1DBT和50或0 mmol L-1甘油的实验样品中收集两个馏分F1和F2。还收集来自用2 mmol L-1的HEX或OC抑制剂处理的培养物的级分。添加50 mmol L-1甘油的培养物的提取物在HPLC色谱图上的峰强度比0 mmol L-1甘油HPLC色谱图上的峰强度高约10倍。甘油诱导RL生产的增加。值得注意的是，在OC色谱图处出现多个峰（图1A和1B）。 4（c）和（f））。最强烈的峰被指定为RL同系物。在50 mmol L-1甘油样品中，C3分泌的同系物Rha-C10-C10（M1 +Na+ ）、 Rha-Rha-C10-C10 （ M2 + Na+ ）、 Rha-Rha-C10-C12-（以钠（M3 + Na+）或钾（M3 + K+）加合离子形式鉴定）和Rha-Rha-C12-C12（M4 + Na+）。在0 mmol L-1甘油样品和含HEX或OC抑制剂的样品（50或0 mmol L-1甘油）中鉴别出单鼠李糖脂同系物Rha-C12-C12（数据未显示）。采用MS/MS确证峰M1和M2。Rha-C10-C10的质谱如图所示。 4（h）。观察到C10酰基链和鼠李糖片段（Rha）的损失它的结论是，甘油支持C3细胞的生长，并通过RL介导的机制增强DBT的生物降解。我们的研究结果表明，甘油的利用可以导致持久性有机污染物的有效生物降解-包括有机氯农药和多环芳烃-在受污染的土壤中，因此可以用于恢复土地功能，使其可用于农业目的。这种生物刺激策略可以与合适的微生物聚生体的生物扩增组合应用。我们的研究结果表明，甘油可能会引发一个优越的反应，在细菌种群的混合物的PAH降解剂和RL生产商。需要对细菌种群和细胞呼吸进行初步分析，并随着时间的推移对PAH生物降解进行监测，以便对生物修复场地进行适当评估。4. 结论RL的两亲性表明RL生产者和PAH降解者具有多种功能。一些功能与疏水化学增溶、化学吸收和生物同化有关。我们的研究表明，在一天的培养后，甘油生物刺激的DBT生物降解增加了30%。这种增强与伯克霍尔德氏菌C3的二-RL生物合成增加和细菌生长有关。在此外，我们还报道了2-溴链烷酸在伯克霍尔德氏菌中用于RL生物合成抑制的用途据我们所知，这是第一份将甘油补充与DBT生物降解和RL生物合成相关联的报告。结果表明，这里描述的生物刺激策略，以提高生物修复效率和促进这种过程的潜在实用性。确认这项工作部分得到了海军研究办公室的资助N 00014 -12-1-0496和西部农业健康与安全中心的资助（NIOSH资助2U 54 OH 007550）。作者感谢Margaret R博士。贝克感谢她对MALDI/TOF的帮助。遵守道德操守准则卡米拉Ortega Ramirez，Abraham Kwan和Qing X。李先生声明彼等并无利益冲突或财务冲突须予披露。命名法ACN乙腈辅酶AFabZ3-羟基-ACP-脱氢酶 FDR错误发现率HEX 2-溴己酸HPLC高效液相色谱HSD诚实显着差异LSD最小显著差异DHB二羟基苯甲酸DP聚合度OC 2-溴辛酸DBT二苯并噻吩FAS II从头脂肪酸合成FadB烯酰辅酶A水合酶/3-羟酰辅酶A脱氢酶FabFb-氧代酰基-ACP合酶2 ACP酰基载体蛋白FabG3-氧代酰基-ACP-还原酶 RhlAHAA合酶HAA 3-羟基链烷酸RhlB鼠李糖基转移酶1RhlC鼠李糖基转移酶2AlgC磷酸葡萄糖变位酶/磷酸甘露糖变位酶 RmlB dTDP-葡萄糖4，6-脱氢酶RmlDdTDP-4-甘露糖还原酶MALDI/TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间LC-Q-TOF-MS液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪MM基本培养基MS质谱法PAH多环芳烃PHA多羟基链烷酸RL鼠李糖脂引用[1] Kampman B，Brouwer F，Schepersa B. 2020年农业土地的可用性和需求：对原料驱动因素和需求以及农业土地可用性的全球分析。Delft：CE Delft;2008.[2] Gereslassie T，Workineh A，Liu X，Yan X，WangJ.土壤中多环芳烃的发生及其生态和人类健康风险评估540C.A. 奥尔特加·拉米雷斯和 其他/工程 6（2020）533来自中国中部的武汉。Int J Environ Res Public Health 2018;15（12）：E2751。[3] LimMW，Lau EV，Poh PE. 石油污染土壤修复技术综合指南--研究现状与未来发展方向。 Mar Pollut Bull2016;109（1）：14-45.[4] Andreolli M，Lampis S，Poli M，Gullner G，Biró B，Vallini G.内生细菌Burkholderia fungorum DBT1 可 以 提 高 多 环 芳 烃 的 植 物 修 复 效 率 。Chemosphere2013;92（6）：688-94.[5] 李明，王天贵，西蒙内特，史松，张玲，杨芳。原油、煤和沉积物萃取物中二苯并噻吩及其甲基化同系物和苯并萘噻吩的定性和定量分析。JChromatogr A 2012;1233：126-36.[6] Incardona JP，Collier TK，Scholz NL.在暴露于多环芳烃的鱼胚胎中，心脏功能缺陷先于形态异常。毒理学应用药理学2004;196（2）：191-205。[7] Seo JS，Keum YS，Li QX.芳香族化合物的细菌降解。Int JEnviron Res PublicHealth 2009;6（1）：278-309.[8] Brinkmann M，Maletz S，Krauss M，Bluhm K，Schiwy S，Kuckelkorn J，等. 杂环芳烃在重组反式激活试验中代谢后显示雌激素活性。环境科学技术2014;48（10）：5892-901。[9] 李锋，朱玲，王玲，詹艳.节杆菌在表面活性剂增强的疏水性有机化合物生物降解中的基因表达。环境科学技术2015;49（6）：3698-704。[10] [10]杨文辉，杨文辉，杨文辉，杨文辉，杨文辉. 鞘氨醇单胞菌降解多环芳烃的两种芳香环羟化双加氧酶的鉴定和功能分析。应用环境微生物学2004;70（11）：6714-25.[11] SingletonDR，Hu J，Aitken MD. 一种新的芘降解β-变形菌中多环芳烃环羟基化双加氧酶基因的异源表达。应用环境微生物学2012;78（10）：3552-9.[12] EibesG，Cajthaml T，Moreira MT，Feijoo G，Lema JM. 丙酮介质中锰过氧化物酶降解蒽、二苯并噻吩和芘的研究。Chemosphere2006;64（3）：408-14.[13] SzulcA ， Ambroz_ewiczD ， SydowM ， Zhawniczak ， Piotrowska-CyplikA ，Marecik生物强化和生物表面活性剂添加对柴油污染土壤生物修复效率的影响：实地研究期间的可行性。J Environ Manage 2014;132：121-8.[14] Noordman WH，J
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