电化学活性细菌固定化用于毒性传感的丝网印刷电极技术研究

环境科学与生态技术3（2020）100053原创研究电化学活性细菌在丝网印刷电极上的固定化用于快速原位毒性生物传感N. Uriaa，b，*，E. Fisetc，1，M. AllerPelli te roa，F. X. M unoza，K. Rabaeyc，d，F.J.delCampoaaInstitutdeMicroelectro`nicadeBarcelona，IMB-CNM（CSIC），08193，EsferaUAB，08193，Bellaterra，Barcelona，SpainbArkyne Technologies SL（Bioo）ES-B90229261，Carrer de La Tecnologia，17，08840，Viladecans，Barcelona，Spainc微生物生态学与技术中心（CMET）eFBEe根特大学，比利时dCAPTURE，比利时A R T IC L EIN F O文章历史记录：2020年4月14日收到，修订版，2020年2020年7月7日接受保留字：微生物传感器微生物生物电化学系统细菌固定化丝网印刷电极侧向流平台毒性传感器A B S T R A C T微生物生物传感器是一个很好的替代传统方法的毒性监测，这是耗时和不够敏感。然而，细菌通常通过生物膜形成连接到电极，由于缺乏均匀性或设备生产时间长而导致问题。合适的固定技术可以克服这些挑战。尽管如此，它们的反应可能比生物膜电极慢，因为细菌在生物膜形成过程中会逐渐适应电子转移。在这项研究中，我们提出了一种可控和可重复的方法来制造细菌修饰的电极。该方法包括使用纤维素基质的固定步骤，然后在铁氰化物和葡萄糖的存在下进行电极极化。我们的工艺流程短，可重复，并使我们获得具有高电流响应的即用型电极。固定化的电化学活性细菌的极好的保质期被证明长达一年。在第一个月的初始50%活动损失之后，在接下来的11个月内没有观察到进一步的下降。我们使用细菌修饰的电极制作了一个横向流动平台，用于使用甲醛（3%）进行毒性监测。它的加入导致了59%的电流下降约20分钟后，有毒输入。本文提出的方法提供了开发高灵敏度、易于生产和长保质期的基于细菌的毒性检测器的能力。©2020作者（S）。出版社：Elsevier B.V.我代表中国环境科学学会哈 尔 滨 工 业 大 学 、 中 国 环 境 科 学 研 究 院 。 这 是 一 篇 基 于 CC BY-NC-ND 许 可 证 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍在过去的几十年里，环境污染已经成为世界主要关注的问题之一。许多有毒化合物，主要来自工业、家庭和农业活动，正在释放到我们的环境中。因此，早期检测和监测有毒物质的流入已成为迫切需要[1]。目前可用的方法没有一个是理想的。依赖于分离技术的分析方法，例如与质谱检测系统耦合的气相色谱或高效液相色谱，广泛用于天然药物的毒性分析。*通讯作者。巴塞罗那微电子研究所微纳米系统系（IMB-CNM，CSIC），西班牙贝拉特，08 190。电子邮件地址：naroa@bioo.tech（N. Uria）。网址：https://www.capture-resources.be1现地址：BOSAQ，Technologiepark 82 bus 7（www.bosaq.com）。水[2]。然而，它们是昂贵的，需要复杂的样品预处理和分离，并且需要训练有素的技术人员[4]。替代的生物监测方法[4e7]似乎没有提供比这些上述技术更大的改进，因为它们通常涉及长的检测时间和低的再现性、稳定性和灵敏度，并且它们可能具有执行挑战性或不适合在线监测应用。生物电化学系统（BES）基于酶或微生物生物电催化剂[8，9]。更具体地说，微生物BES依赖于电化学活性细菌（EAB）与电极自由交换电子的能力。因此，由微生物电极产生的电流密度与EAB的代谢速率成正比。毒性化合物的存在诱导了导致电流密度变化的功能障碍（即，通常是损失）。这种传感模式是不特定的，虽然BES的生物传感能力还没有得到充分的研究，但它们相对容易实现，使它们可能非常有用。它们也可以补充经典的https://doi.org/10.1016/j.ese.2020.1000532666-4984/©2020作者。由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表环境科学与生态技术期刊主页：www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.com2N. Uria et al./Environmental Science and Ecotechnology 3（2020）100053þ×--水质量保证的分析技术[10]，特别是作为低资源环境中的快速方法。在大多数报告的情况下，提出用于感测的微生物电极被阳极异养EAB氧化有机物定殖以产生电流[11]。 怎么样，Pre'v o teau等人。 [12]have还提出了在缺乏或缺乏有机化合物的富氧环境中用于毒性检测的自养阴极。细菌和电极之间的有效电子转移对于增加电流密度以及改善响应有毒输入的测量范围一种方法是通过氧化还原介体[13E16]。氧化还原介体促进微生物和电极之间的电子转移[17e20]。铁氰化物是最常用的氧化还原介体，因为其毒性低，在水中的溶解度高，并且因为它能够在毒性测定中使用高度浓缩的细菌[17，19]。此外，我们决定使用细菌菌株，如大肠杆菌（E.coli），因为您可以使用大量的生物传感生物体，而不需要细胞外电子转移（EET）的固有能力，因为您可以使用介体。然而，BES文献中的结果是高度可变的，在某些情况下[21]，由于生物膜形成条件[22]，对任何有毒输入都没有显著的反应。生长条件影响生物膜的组成、密度、孔隙率和胞外聚合物（EPS）含量。这些因素影响生物传感器对给定有毒化合物的灵敏度[23]，并影响基于BES的生物传感器的成功[21]。除此之外，自发的生物膜生长导致更长的设备生产时间[24e 26]，并且通过改变工作电极施加的电势，参比电极生物污染和系统不稳定的风险更高[27]。强制固定技术可以克服这些问题中的一些已经报道了不同类型的细菌固定化，例如吸附[28，29]、多孔基质内的截留[29，30]、自聚集（天然[29，31]或使用交联剂[29]）和屏障后的细胞容纳[29，32e34]。其中，细胞包埋法可能是最合适的选择，因为它是一种具有成本效益和简单的方法。该技术基于将细胞固定在多孔基质内，以防止其扩散到周围介质中，同时仍允许营养物和代谢物的质量转移[34]。固定化技术通过控制工作电极上细菌的沉积，消除了生物膜形成的需要。然而，在生物膜形成过程中，细菌逐渐适应直接电子转移[35，36]，导致更快的电极动力学[35]。这在细胞的受控固定期间不会发生，这需要新的策略来减少细菌适应电极所需的时间并获得大而稳定的读出电流[34，37]。三电极配置微生物生物传感器中的参比电极能够控制施加到微生物修饰电极的电势，其成为电流型微生物生物传感器[27，38]。三电极系统可以避免2电极BES系统固有的不稳定性，其可能遭受电极电位漂移并提供更稳定的电流响应。因此，有助于检测影响电极处微生物活性的有毒物质[27]。有一些研究涉及在三种电极配置中开发微型生物传感器[25，39e41]。在所有情况下，由于需要在工作电极上形成和稳定天然生物膜，这些生物传感器需要7天至1个月的长启动时间本研究的目的是开发一种制造细菌修饰电极的方法，作为长电极的替代品。时间所需的自发生物膜生长，但不影响传感器的响应时间。基于控制E. 使用纤维素作为固定化基质的大肠杆菌。为了减少生物传感器的启动时间，该过程伴随着施加0.3 V（vs Ag）的电势。我们证明了这些传感器在有毒生物传感中的潜在用途，以及细菌修饰电极储存长达一年后的长期设计并测试了一种基于丝网印刷三电极电池和侧流膜的一次性微型微生物传感器作为生物传感平台。2. 材料和方法2.1. 试剂和细菌培养六氰高铁酸钾（III）、葡萄糖、甲醛（ACS试剂37%wt.在H2O中）、黄原胶、2-羟乙基纤维素和聚（乙烯亚胺）溶液（PEI）从Sigma-Aldrich获得Ashland（Ashland，USA）提供了Gafquat™755 N。所有溶液均采用M9基本培养基[42]作为溶剂。E.从美国典型培养物保藏中心获得的大肠杆菌ATCC 10536在8 mLLuria-Bertani（LB）肉汤（Sigma-Aldrich）中于37 ℃生长过夜。菌落形成单位在37 ℃下孵育平板过夜后，平板计数每毫升（cfu$ mL-1培养物的细胞数平均浓度为108 cfu mL-1。2.2.电极制造使用Vectorworks 2016（Tech-limits，ES）设计芯片布局。该设计由中心2.5 mm直径的工作电极石墨盘组成，石墨辅助电极和银伪参比电极包围，如图S1（补充材料）所示。电极直接丝网印刷在0.5mm厚的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基底（Autostat，MacDermid，UK）上，使用定制的手动印刷机，使用20个20 cm筛孔90线$cm-1。对于导电油墨，折断距离为0.5mm，而对于介电涂层，折断距离为1mm。银膏Electrodag 725A（Henkel，ES）用于印刷伪参比电极、轨道和接触垫 。 使 用 碳 糊 C2030519P4 （ Gwent Electronics materials Ltd ，UK）印刷工作电极和辅助电极。UV可固化电介质Electrodag PF-455B（Henkel，ES）层用于使接触垫和电极之间的导电轨道绝缘并限定电极面积。2.3.固定矩阵分析2.3.1.电化学表征黄原胶、2-羟乙基纤维素、聚（乙烯亚胺）溶液（PEI）和Gafquat™ 755 N糊剂使用DropSens mStat 8000多稳压器和DropView 8400软件（DropSens，ES）进行电化学表征。为此，使用不同糊剂浓度（2、5、10%wt.）在0.5 V和0.6 V（相对于Ag）之间的100 mL六氰合铁（III）酸钾（5 mM）液滴中 以20 mV s-1的扫描速率运行。2.3.2.细菌活力试验ELISA 96 微 孔 板 （ Nunc-ImmunoMicroWell 96- 孔 板 ，SigmaAldrich）用E. 以终浓度为103 cfu mL-1的大肠杆菌悬浮于100mL的LB生长培养基中，以葡萄糖（20 mM）为碳源，N. Uria等人 /环境科学与生态技术3（2020）1000533þþþþ不同的浓度（2、5和10重量%）。通过使用ELISA读数器（MultiskanEX，Thermo Scienti fic）测量550 nm处的吸光度来监测生长。在16小时内获取吸光度值，给予足够的时间观察吸光度值的稳定，从而观察细菌生长的稳定。将结果与空白样品进行比较。空白由100mL LB生长培养基和葡萄糖组成，不同糊剂以最大浓度作为无生长对照，样品以最大浓度作为无生长对照。E.大肠杆菌在含有葡萄糖的LB生长培养基中无任何糊状物作为最大生长对照。所有条件均一式三份进行研究2.3.3.分布分析与E.大肠杆菌的细菌和不同的固定化糊剂在2%的最终浓度制备。一滴每种细菌-糊状混合物5 mL，含有约10 7E. 将大肠杆菌细胞沉积在工作电极上并在室温下干燥1小时。 此后，按照制造商推荐的方案，将Hoechst 33342荧光染料（Thermo Fisher Scienti fic/ES）用于样品。共聚焦显微镜（Leica TCS SP2 AOBS，DE）证实了不同基质中的微生物分布。2.4.细菌修饰电极的制备和测试研究了两种不同的细菌修饰电极制备方法，并使用清洁水样进行了测试。2.4.1.策略1：固定化前细菌的细胞外电子转移适应大肠大肠杆菌过夜培养物中补充铁氰化物（5mM）。 12 h后，E.大肠杆菌进行定量，得到的浓度值为10 8个细胞$mL-1。然后，加入1mL E.使用OrtoAlresaBiocen20Eppendorf离心机离心（4500G，15分钟）大肠杆菌培养物，并悬浮于50 mL纤维素糊（2%wt.）中。假设固定在工作电极上的细菌细胞数为约107，通过滴注将5 mL该悬浮液滴沉积在工作电极上。将固定有细菌的电极在室温下干燥1小时。通过用一滴100mL含有20 mM葡萄糖作为碳源和5 mM铁氰化物作为氧化还原介体的溶液再水化电极来测试细菌修饰的电极。2.4.2.策略2：固定化过程中细菌的细胞外电子转移适应在该策略中，E. 大肠杆菌在不存在铁氰化物的LB中生长过夜。 在细菌固定化之后，按照先前在策略1中解释的相同过程，在电极上添加一滴100 mL补充有葡萄糖（20 mM）和铁氰化物（5 mM）的M9培养基。施加0.3 V（相对于Ag）的固定电位，直至液滴干燥。通过用100 mL蒸馏水对电极进行再水化来测试细菌修饰的电极。在这两种策略中，通过测量E.大肠杆菌在0.3V（相对于Ag）下通过计算机控制的CH Instruments 1030A多电位仪固定在工作电极上。细菌可以利用葡萄糖作为碳源，将亚铁氰化物还原为亚铁氰化物在0.3 V（相对于Ag）时，亚铁氰化物被氧化回铁氰化物，给出了微生物还原能力的定量信息。因此，当不存在细菌时，获得的氧化电流接近于零。请注意，铁氰化物是铁/铁电对中最稳定的物质，其自发转化为亚铁氰化物可以忽略不计[43]。2.5.细菌修饰电极长期稳定性测试使用第2.4.2节中解释的极化下的干燥过程对40个电极进行改性。此后，将电极储存在4° C的冰箱在一年多的不同时间间隔，电极用水再水合。研究了这些储存的改性电极在0.3 V（vs Ag）固定电位下的电流响应。 改良电极活性降低的百分比测量为在固定期间和在4° C下储存之后在电极与水再水合期间2.6.中毒性休克监测用100mL蒸馏水对细菌修饰的电极进行再水化，并施加0.3V（vsAg）的固定电位在稳定化时间之后，滴加10 mL甲醛（30%）。添加以达到3%的最终甲醛浓度电流变化（DI）和抑制比（IR）提供了传感器对毒性响应的估计值[10]。DI对应于暴露于毒性剂之后的电流降的值，遵循等式（1）：去甲-I毒性1/4大肠埃希菌-I空白对照-I毒性输入后大肠埃希菌-I毒性输入后空白对照（一）其中，Inor是在暴露于有毒物质之前产生的电流，由控制信号归一化，Itox是在引入有毒物质之后的电流输出[10]，由控制信号归一化另一方面，IR被定义为在暴露于毒性剂之前标准化为稳定电流的电流下降的百分比[10]，并按公式（2）计算：IR% ≤100 × 100× 100Inor-Itox≤=Inor≤（2）2.7.侧流生物传感平台设计及毒性试验监测包括电极在内的横向流动平台的设计和印刷遵循先前在材料和方法章节“电极制造”中描述的相同程序。该芯片具有两个工作电极，每个工作电极的面积为0.01 cm2，两个辅助电极和工作电极之间共享的公共参比电极。将电极印刷在PET基底上。纸通道由激光切割Fusion 5（GEHealthcare，ES）片组成。使用具有不同厚度和表面性质（即，亲水性覆盖物）。此外，包含弹簧加载连接器的定制保持器促进了实验。对电极进行如下修改：E.将大肠杆菌细胞重悬于50 mL 2-羟乙基纤维素（2%）中，将一滴5 mL该糊状物-细菌混合物沉积在一个工作电极上，并在室温下干燥1小时。另一个工作电极用作空白，沉积干燥的5mL不含细菌的羟乙基纤维素（2%）然后，将Fusion 5纸通道放置在芯片上。将补充有葡萄糖（20 mM）和铁氰化物（5 mM）的100 mL M9溶液置于平台入口以流动直到电极通过毛细作用。同时，计算机控制的CH Instruments 1030A多电位仪施加了0.3V（相对于Ag）的固定电位。4N. Uria et al./Environmental Science and Ecotechnology 3（2020）100053-þþ对于细菌毒性休克监测，在入口处引入最终浓度为3%的100mL甲醛的蒸馏水通过施加0.3V（相对于Ag）的固定电位来测量细菌修饰电极对毒性的反应3. 结果和讨论3.1. 固定矩阵分析研究了在不同浓度下应用于洗涤剂、粘合剂、食品添加剂、水处理剂或化妆品等产品中的不同糊剂Gafquat [44]（一种带正电荷的聚合物）、Xantham Gum [45]（一种由细菌野油菜黄单胞菌产生的多糖）、聚乙烯亚胺（PEI）[46]（一种阳离子聚合物）和2-羟乙基纤维素[47]（一种源自纤维素的多糖）用于将细菌固定在工作电极上。该基质必须限制微生物细胞，同时允许反应产物（碳源和氧化还原介体）自由通过，而不会损害微生物。在电化学响应、细菌活力和细菌分布方面分析了用于将细菌固定在电极上的糊剂gafquat、黄原胶、纤维素和PEI。用不同浓度（2、5和10%wt.）修饰的电极在铁氰化物（5 mM）中的循环伏安法的糊状物与未改性的电极进行比较 图图1显示了每种糊剂的这些伏安图的示例。 此外，图S2和S4（补充材料）提供了关于对每种改性材料进行的伏安图的更详细信息-电极和相同电极之间的可变性。当使用裸丝网印刷电极时，峰的铁氰化钾出现在氧化峰和还原峰的电位分别为0.18 ± 0.01 V（vs Ag）和0.09 ± 0.01V（vs Ag），电流峰值分别为587.27 ± 2.14和737.6 ± 42.1 mA cm-2，电极间的变异性小于12%（图1）。 S4）。研究了不同浆料改性后铁氰化物氧化还原的变化。当电极被不同的聚合物覆盖时，观察到氧化还原峰，但取决于覆盖工作电极的糊剂，峰电位和电流具有温和的影响。一般来说，电极的修饰产生了向负电压的伏安图偏移。此外，在用相同糊剂改性的电极之间发现的变异性很高，尤其是在黄原胶和PEI改性电极的情况下。这些电极显示出高于50%的峰电位变异性，在PEI改性电极的情况下甚至更高（图S3）。因此，只有纤维素改性电极与非改性电极保持相似的峰值电位，电极之间的变异性低于16%。黄原胶修饰的电极（图 图la）显示铁氰化物氧化-还原峰的低电流密度。与未改性电极相比，当5%的基质浓度对应于高达80%的减少。这表明介质不能容易地通过基质扩散。通过截留进行固定可显示截留材料引起的扩散阻力，这可能导致灵敏度降低[24，48]。此外，测试的浓度对于Gafquat糊剂来说太高，高于所有的10%浓度。Gafquat糊剂在该浓度下的高粘度阻止其用作免疫抑制剂。bilisation矩阵PEI修饰的电极显示出电流氧化的增加，密度与的增加浓度与2%wt时为672.87± 86m A cm-2。在10%wt时为797.5± 43 mAcm-2（图1 b，Fig. S3）。在这些电极中，在200 ℃处的额外氧化峰是由氧化峰的氧化产物组成的。出现0.4e0.5V（vsAg）纤维素对铁氰化物的电化学响应（图1）。 1 c）和Gafquat修改（图。 Id）电极在电流密度方面没有变化，并且双极之间的再现性良好（图S4）。仅当浆料浓度增加时，在纤维素改性的电极中观察到电流降低密度略有降低（图1）。 S3）。所用的糊剂必须在不影响细胞活力的情况下捕获细菌。为了证明这一点，E。在不同浓度的每种基质（2、5和10%wt.）存在下进行大肠杆菌生长试验。与E.大肠杆菌生长无糊状物，如图所示。凌 晨 2结果表明，E.大肠杆菌的生长在不同的糊剂之间和浓度之间。总的来说，E. 当将糊状物添加到生长培养基中时，大肠杆菌生长较慢。PEI的细菌生长接近于零，对于所有分析的浓度，生长减少约90%这与其他研究结果一致，其中研究并证明了PEI在高浓度下的抗微生物化学活性[49，50]。E. 大肠杆菌生长的Gafquat的存在下，虽然它减少了31.9 ± 6.5 e 46.6 ±1.6%。Gafquat是一种成膜阳离子聚合物，主要用于个人护理。它已被用于酶生物传感器[44]，但没有它作为生物杀灭剂的记录。在纤维素的情况下，观察到生长的最小减少与所用浓度成比例。因此，浓度为10、5和2%时，生长分别降低37.6± 9.6%、22±3.6%和14.9± 8%。由于基质的密度，在E. 大肠杆菌样本与黄原胶糊。因此，发现重复之间具有高变异性的生长降低，在5和50%作为生长曲线的替代，E.用Gafquat进行大肠杆菌生长培养。 结果表明，该聚合物对大肠杆菌的生长影响不大。大肠杆菌活力，显示生长减少约20%（数据未显示）。通过共聚焦显微镜分析基质内细菌细胞的分布有趣的是，图2b显示了E的不同分布。每一个paste里面都有Gafquat糊剂（图2b，图像G）导致更厚的基质，其中大部分细胞靠近电极表面。PEI矩阵（图2b，图像P）导致了类似的分布，大部分E。大肠杆菌细胞在基质的底部。纤维素和黄原胶糊（图2b，图像C和图像X）产生细菌细胞在基质上的均匀分布。基于膏状电极的电化学响应，E.大肠杆菌的生长结果和细菌在基质中的均匀分布，选择纤维素作为细胞包埋材料。此外，纤维素具有良好的水溶性、高化学稳定性和生物相容性[51]。由于在2%和5%浓度之间几乎没有观察到差异，因此在以下固定实验中选择2%纤维素。3.2.细菌修饰电极制造在选择包埋基质后，按照不同的策略制备目标是制造能够产生快速可测量信号的电极 图图3a显示了所研究的两种策略的比较。在第一种方法中，细菌在固定化之前在铁氰化物的存在下生长。在使用电极之前加入铁氰化物和葡萄糖 第二种策略包括在铁氰化物和葡萄糖的存在下极化固定化后的电极。在这种方法中，细菌修饰的电极在再水化后立即准备使用。N. Uria等人 /环境科学与生态技术3（2020）1000535Fig. 1.改性电极的电化学分析。用不同浓度（2、5和10%wt）的不同糊剂改性的电极在铁氰化钾（5 mM）中的循环伏安法。a. 黄原胶（X），b.聚（乙烯亚胺）溶液（P），c.2-羟乙基纤维素（C），d.Gafquat™755N（G）。图2.固定糊剂内的细菌活力和分布。 a. E. 在不同浓度（2、5和10%wt）的固定化糊剂的存在下，对大肠杆菌培养物进行了测定。B.共焦图像。最终浓度为2%wt的固定糊剂内细菌的侧视图。X：黄原胶，P：聚（β-乙烯亚胺）溶液，C：2-羟乙基纤维素和G：Gafquat™755 N。3.2.1.铁氰化物策略中的固定前增长图3b比较了在固定电位下获得的电流两株E. 大肠杆菌培养物生长过夜，不含铁氰化物（第一张图）。在计时电流分析之前，E.大肠杆菌细胞计数，在两种培养基生长之间没有观察到差异，6N. Uria et al./Environmental Science and Ecotechnology 3（2020）100053þ图三.固定化战略。a.细菌修饰电极制造研究方法的方案。第一种固定化策略：E.大肠杆菌细胞用铁氰化钾（Fe3O4）培养过夜。细菌通过滴铸在纤维素基质中而被固定。第二种固定策略：E.大肠杆菌细胞在无Fe ~（3+）存在下生长过夜。工作电极用纤维素和细菌糊修饰。之后，加入含有Fe2O3和葡萄糖的液滴，并在施用时干燥。0.3V（相对于Ag）电位。B. 通过不同固定策略获得的电流输出结果 用E. 大肠杆菌在悬浮液中生长过夜，而不使用FeCl 3和使用FeCl 3悬浮液（n 1/3），并且在固定在工作电极上之后（n 1/3）遵循第一策略。第二张图是在按照第二种策略制造细菌修饰电极期间记录的0.3V（相对于Ag）下的计时电流图，第三张图是用水将其再水化后的计时电流图。没有E coli（n 1 3）和E. coli（n 15）。铁氰化物测量30 min后，两个样品之间获得的电流密度相差93.19 ± 16.2 mA cm-2（图3b，第一张图）。在铁氰化物存在下过夜生长的细菌培养物产生了更高的电流（153.83± 0.9 m A cm-2），相比之下，在测量的前5分钟，没有铁氰化物的细菌样品生长（34.43 ± 1.2 m A cm-2）已经产生了更高的电流。接下来，将用铁氰化物生长的细菌离心，以便在将它们附着到纤维素基质中的工作电极之前将它们从培养基中分离出来。图3b（第一幅图）显示了细菌修饰的电极响应（灰线）。固定后，电流下降至无适应细胞值29.4±0.6mAcm-2，30 min后仍未恢复（37.59 ±0.28mAcm-2）。悬浮细菌与铁氰化物（绿线）一起生长获得的高电流水平是由于亚铁氰化物在培养基中积累这种亚铁氰化物是由细菌活性过夜产生的，因为培养基的细菌分离和随后的固定化导致电流下降。3.2.2.电极极化策略图图3a示出了第二固定策略。在这种情况下，E.在葡萄糖和亚铁氰化物的存在下，将大肠杆菌固定化，并将0.3V（vs Ag）施加到电极上，直到水滴完全干燥。 图图3b（第二和第三曲线图）示出了在该过程期间获得的电流。选择适当的传感器极化电位至关重要。在计时电流分析期间回收的存储电荷的百分比在很大程度上取决于所使用的电势是否足够高以氧化系统中存在的所有氧化还原化合物。在我们的情况下，考虑到我们的E.大肠杆菌修饰电极（补充材料图 S5）并选择足够高的电位以足够高的速率氧化介质中存在的亚铁氰化物。细菌在葡萄糖存在下还原铁氰化物，铁氰化物在极化过程中在电极处再次氧化，产生电流增量。因此，电流从约12.35± 4.2mAcm-2逐渐增加到170 min后的最大值111.6± 8.5mAcm-2，此时由于液滴干燥，此外，E.还分析了在不存在葡萄糖的情况下的大肠杆菌修饰的电极。低电流密度为8.7 ± 4.04 m A cm-2，接近空白电极获得的电流密度（1.14 ± 1.6 m A cm-2），证实细菌修饰电极获得的电流是由于细菌还原铁氰化物所致。之后，测试了细菌修饰的电极。在该策略中，电极用E.大肠杆菌与N. Uria等人 /环境科学与生态技术3（2020）1000537þþþþþ-------þþ葡萄糖和铁氰化物。只有蒸馏水是必要的使用。然后，细菌修饰电极和空白电极（仅用纤维素修饰的电极和用E.大肠杆菌，但不含葡萄糖）再水化，并施加0.3V（相对于Ag）的电流密度。图3b（第三幅图）显示，细菌修饰的电极在较短的时间内产生较高的电流密度。因此，测量38分钟后达到63.74± 8 mA cm-2的值，而在先前实验中获得的电流水平不超过31.6± 6m A cm-2。此外，空白电极维持较低的电流密度，不含E的电极为4.41 ±3.5mAcm-2和15.3±3.92mAcm-2。coli和无葡萄糖。这些结果表明，细菌修饰电极制造的策略使我们能够在更短的时间内获得更高的电流。3.3.改善固定条件通过测试不同的温度、施加的电势和细菌浓度，进行实验以在电流输出方面改善固定化条件（图1）。 4）。图4a显示了在室温和37 ° C（E的最佳生长温度）下进行的一系列计时电流测量。杆菌在37摄氏度下保存的样品显示，电流下降，因为较高的温度导致电极上的溶液更快干燥。同样，样品在37℃时也能更快地获得最大电流，更具体地说，55 min，而在室温下保持的样品的情况下，增加较慢，并且需要140min才能达到最大电流密度。 因此，E. 大肠杆菌修饰的电极显示，在37摄氏度时性能提升。这些电极获得更高的电流值（131.07± 8.03m A cm-2）与空白（11.71± 2.7m A cm-2）相比，仅需55 min，保持了测量的重现性。同样，室温下的大肠杆菌修饰电 极 在 140 min 后 达 到 最 大 电 流 密 度 时 ， 与 空 白 样 品 仅 显 示 出78.2±14.1m A cm-2的差异，液滴开始干燥。因此，我们认为，在最佳生长温度（37℃）下进行的高代谢细菌活性可以提供良好的电流信号并减少测试时间。无论温度如何，不含E.在室温和37 ℃条件下，大肠杆菌对样品进行55 min 的 电 流 测 量 ， 得 到 的 电 流 值 分 别 为 14.26 ± 4.8 和 11.7 ±2.7mAcm-2，表明温度对测量结果没有影响。在37摄氏度下制备细菌修饰电极的过程中，施加了0.2 V和0.3 V（相对于Ag）之间的不同电位，以研究它们对电流产生的后期影响（图1）。 4 b）。未分析高于0.3 V（相对于Ag）的电位，因为在0.1 - 0.2 V（相对于Ag）之间观察到铁氰化物的氧化还原峰（补充材料图S5）。因此，在高于0.3V（相对于Ag）的电流施加电位中的增加可应归因于37℃时细菌在电极上的固定而不是细菌产生的亚铁氰化物在工作电极上的氧化。当施加的电位接近0V（vs Ag）时，空白电极和大肠杆菌修饰电极之间未观察到差异。相比之下，施加0.1 V和0.3 V（相对于Ag）时，相对于空白观察到电流的显著差异，约为55e 59 m A cm-2。与铁氰化物和细菌样品伏安图中观察到的氧化和还原峰相匹配的电位（补充材料图S5）。而空白样品的变异性很大，当电位为0.1V（vsAg）时，电流密度值为60.1± 22.8mAcm-2见图4。细菌修饰电极制备条件的研究。a.温度：室温和37 ℃下记录的0.3V（相对于Ag）B.施加电势：通过计时电流法技术施加不同电势40分钟后获得的电流密度值。C.细菌浓度：使用不同的细菌浓度记录在0.3V（相对于Ag）下的色谱安培图，覆盖工作电极。没有E coli，n2，E. 大肠杆菌n1/4 6。另一方面，0.3 V（vs Ag）下的空白样品显示出较小的变异性（41.64± 5.6mA cm-2）。因此，我们选择0.3 V（相对于Ag）作为最佳极化电位。8N. Uria et al./Environmental Science and Ecotechnology 3（2020）100053þþþþþ固定在工作电极上的细菌浓度是另一个需要考虑的关键因素固定化的细菌数量代表了两个限速因素之间的折衷，即碳源和介质扩散到细菌糊基质中，以及测量的每单位体积细菌细胞数量的信号依赖性（细胞密度）。在我们的例子中，电极被修改为大约10 7E。 coli细胞。 假设一个E. 大肠杆菌细胞长2 mm，直径1 mm，工作电极面积约为0.05 cm 2，10 7E.大肠杆菌细胞可以在电极表面堆积成至少两层细菌。为了验证所使用的细菌浓度不限制电流信号，分析了在将细菌浓度降低一半和一个数量级后获得的响应，并显示在图1中。 4杯在这些实验中，我们观察到，固定在工作电极上的细胞数量减少导致电流从最大值131.07± 8.03 mA cm-2（由用约107个大肠杆菌细胞修饰的电极获得）下降到38.85± 10 mA cm-2。2当细菌细胞数量减少一半时。此外，当工作电极用106 个细胞修饰时，E. coli，其电流密度值很低（11.53 ± 4.6mAcm-2），与空白电极的差异很小或可以忽略。3.4.毒性试验对于冲击监测，E. 在甲醛（3%）存在下，对固定在工作电极上的0.3V（vsAg）的大肠杆菌进行了分析。当细菌与有毒化合物接触时，微生物的死亡或活性降低导致测量的氧化电流下降。选择甲醛进行毒性分析，因为它是一种常用的消毒剂和杀生物剂，使我们能够观察到对细菌代谢活性的抑制[52]。此外，在葡萄糖饱和条件下分析电极，以确保底物浓度的变化不会引起电流信号的变化。因此，将大肠杆菌修饰的电极和空白电极用水再水合，并施加0.3V（相对于Ag）的恒定电位，以获得120.46 ± 4.3和26 ± 5.9 mA cm-2的大肠杆菌电流。大肠杆菌修饰的电极和空白电极，分别（图。 5a）。然后，加入最终体积浓度为3%的甲醛图5a显示了细菌修饰电极的电流输出受到添加这种有毒物质的影响。来自大肠杆菌修饰电极的电流密度从加入甲醛2 0 min后，抑制率为12 0.48± 4.3 ~ 5 2± 7.45mAcm-2，抑制率为6 9.5 ± 0.4%。电流的减少也可能是由于亚铁氰化物的稀释，亚铁氰化物以前是由细菌还原铁氰化物产生的，而不是由于对大肠杆菌的毒性作用。然而，加入的甲醛的量仅为10mL，这只能产生约10%的电流减少。同样地，由空 白 电 极 提 供 的 电 流 也 降低 ， 但 小 于 10% （ 从 26± 5.84 至 23.7±8.07mAcm-2）。3.5.细菌修饰电极对于实际应用，固定化程序必须允许在长期储存和操作期间保持微生物活性和稳定性[53]为此，为了确定细菌修饰电极的储存稳定性，使用极化下的干燥过程对然后，制备空白电极和细菌修饰电极，获得10.9± 2.4和124.65± 39.2 mA cm-2的电流输出，分别然后将电极储存在4° C的冰箱中，使用.通过用水再水合，在一年内的不同时间间隔研究了这些储存的改性电极在0.3 V（vs Ag）固定电位下的电流响应。图5b显示了固定化细胞在储存时的表观生物活性衰减。然而，尽管2个月后的结果表明初始电流减少了约50%，但在1年后没有观察到进一步的损失（减少了约10%）。44.8±3.6%）。此外，尽管这种信号降低，但双极仍然显示出与不含细菌的空白的差异图5c显示了使用甲醛（3%）和两个细菌修饰电极和一个储存一年的空白电极的毒性测试。电极用水再水化，并记录0.3 V（vs Ag）下的电流30 min。细菌修饰电极再水化期间的输出电流值（平均58 ±1 m A cm-2）低于固定过程中获得的电流值。然而，甲醛的加入导致10分钟后两种细菌修饰电极的电流下降约27±3.03%。同样，空白电极的电流值没有发生任何变化加入甲醛的时间首先取决于测量的稳定性，其次取决于样品体积，因为存在蒸发的风险最后，在加入甲醛20分钟后计算出的抑制率为60.59± 4.36%，这略低于最近制备的电极获得的值（69.5 ±0.4%）。这一观察结果表明，在储存后，电极对毒性的反应略有降低这些实验结果表明，我们的细菌修饰电极是稳定的，固定在电极上的细菌在长期储存后仍能存活。3.6.用于毒性监测图图6a和图6b示出了能够执行差分测量的横向微流芯片。该芯片的特征在于具有两个工作电极和两个辅助电极的两个独立的电化学电池，所述两个工作电极和两个辅助电极共享相同的伪参比电极以及由侧向膜制成的简单的“Y“通道。在这种芯片设计上进行了固定细菌的实验为了执行差分信号，细菌仅固定在第一个工作电极上，而双工作电极仅用纤维素作为空白进行修饰接下来，将纸通道放置在芯片上，并通过入口加入含有亚铁氰化物（5mM）和葡萄糖（20mM）样品通过两个通道均匀分布，并通过毛细管力自发地到达两个工作电极施加0.3V（相对于Ag）的恒定电势50分钟。在图6c中，对于具有细菌的工作电极，可以观察到120mAcm-2无差异在没有细菌的情况下的电流密度来自电化学系统的电流密度值与前讨论的静态三电极布置的电流密度值一致三电极系统的平均最大电流密度为124.7± 39.2mAcm-2，而侧流装置在平台内的液体干燥之前获得的最大电流密度为120mAcm-2还研究了对甲醛（3%）存在的响应。对于这种情况，甲醛被添加到细菌修饰电极的入口。暴露于有毒化合物导致电流输出显著下降，相当于约20分钟后细菌抑制率为59%，这与图11所示的结果一致。 5.为了测试甲醛是否引起铁氰化物信号的这种电流下降，通过甲醛添加铁氰化物和葡萄糖。N. Uria等人 /环境科学与生态技术3（2020）1000539图五.毒性测定。a.用水再水化修饰电极（无E. coli，n2，E. coliN 1/4 6），并且在加入甲醛后电流降低。B. E.在4 ℃下储存后的大肠杆菌修饰电极（n 1/2）。C.毒性测定使用两个E. coli修饰的电极（R1，R2）和一个不含E. 大肠杆菌（空白）在冰箱中储存1年后。黑色箭头指示甲醛（3%）的添加见图6。a.毒性传感器的制作。第一部分涉及丝网印刷银轨道和连接器，然后是石墨电极。接下来，应用U