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工程16(2022)162研究肝细胞癌-文献miR-516 a-3 p是一种新的肝癌致瘤活性和细胞代谢的陶瑞a,张学友b,c,石峰b,c,黄海涛b,c,詹少伟b,c,谢海洋b,c,周林b,c,郑树森b,c,刘晓波,齐玲b,c,刘a浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院外科b浙江大学医学院附属第一医院感染性疾病诊治协同创新中心外科,浙江c浙江省肝胆疾病诊治研究中心器官移植重点实验室,杭州310003阿提奇莱因福奥文章历史记录:收到2020年2021年6月11日修订2021年7月26日接受2021年10月19日网上发售保留字:肝细胞癌MicroRNA簇Exosome多组学A B S T R A C T肝细胞癌(HCC)是目前世界上最致命的恶性肿瘤之一我们先前证实,19号染色体microRNA簇(C19MC)与HCC患者的肿瘤负荷和预后相关在本研究中,我们的目的是探索miR-516 a-3 p-一种由C19 MC的四种致癌前体miRNA(即,mir-516a-1、mir- 516a-2、mir-516b-1和mir-516b-2)。在我们的HCC患者队列中,与邻近非肿瘤组织相比,miR-516 a-3 p在肿瘤miR-516 a-3 p的高表达与晚期肿瘤阶段显著相关,区分高HCC复发率和死亡率,并独立预测预后不良。我们进一步发现miR-516 a-3 p在体外增强HCC细胞的增殖、迁移和侵袭力,在体内促进肿瘤的生长和转移。在癌细胞中,miR-516 a-3 p可以通过外泌体或细胞外囊泡递送,并增加受体细胞的致癌活性此外,我们对miR-516a-3p促进致癌性的潜在机制进行了全面的转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析。 MixOmic DIABLO分析显示蛋白质组学和代谢组学数据集之间具有密切的相关性和很强的聚类一致性。我们进一步证实了六种蛋白质(即,LMBR 1、CHST 9、RBM 3、SLC 7A 6、PTGFRN和NOL 12)作为miR-516 a-3 p的直接靶点和作为miR-516-3 p介导的代谢调节的中心参与者整合的多组学和共富集途径分析表明,miR-516 a-3 p调节HCC细胞的代谢途径,特别是嘌呤和嘧啶代谢。总之,我们的研究结果表明,miR-516 a-3 p通过调节细胞代谢并通过外泌体递送系统影响邻近细胞来促进HCC细胞的恶性行为因此,我们建议miR-516 a-3 p作为HCC治疗的新分子靶点©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版,高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。1. 介绍肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,预后差[1]。HCC的发病率比其他任何癌症都增长得更快,值得高度关注[2]。在过去的几十年中,HCC的死亡率在女性和男性中都有所增加。手术是HCC的重要治疗手段[3]。尽管靶向药物治疗[4]、局部消融[5]、经导管动脉*通讯作者。电 子 邮 件 地 址 : shusenzheng@zju.edu.cn ( S.郑 ) ,Lingqi@zju.edu.cn(Q.Ling)。化疗栓塞[6],甚至肝移植[7],HCC的预后仍然很严重。因此,深入研究肝癌的发病机制,探索其可能的治疗靶点是当务之急MicroRNA(miRNAs)是一类长度为18-25个核苷酸的小分子非编码RNA目前,miRNA簇被定义为从相同方向或相邻基因组转录的一组前体miRNA(pre-miRNA)[9],在癌症调控中特别有吸引力。它们的调节和表达具有高度的一致性[10]。此外,它们可以靶向相同的基因或途径,https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.07.0202095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页:www.elsevier.com/locate/engT. Rui,X.Zhang,S.Feng等人工程16(2022)162163××·×由于相同或相似的种子区域的影响[11,12]。染色体19 microRNA簇(C19 MC)作为最大的miRNA簇,包含46个pre-miRNA[13]。在我们之前的研究中,通过挖掘癌症基因组图谱(TCGA)ymiRNA谱,我们证明了在HCC组织中前50和前100个差异上调的miRNA中,分别有37个(80.4%)和45个(97.8%)属于C19 MC[14]。这些结果与其他研究[15-17]的结果一致然而,目前还缺乏关于C19 MC成员对HCC作用机制的功能miRNA有可能在不同的细胞类型之间转运,包括癌细胞和相邻细胞,这可能影响受体细胞的生物学[18]。外泌体或细胞外囊泡是细胞间通讯过程中最常研究的miRNA载体,并有助于恶性肿瘤行为的转移[19]。一些报告表明,C19 MC通过外泌体转移到其他区域。外泌体介导的C19 MC在人胎盘滋养层中的转移用于病毒抗性已受到广泛关注[20,21]。Bullerdiek等人[22]还提出了外泌体衍生的C19 MC可能作为治疗肿瘤发生的靶点的假设。然而,通过外泌体转移C19 MC调节肿瘤细胞的实验证据仍然不清楚。因此,我们的目的是探索生物功能转移C19 MC在HCC中的表达。在这项研究中,我们发现C19 MC的四种致癌前体miRNA(即,mir-516 a-1、mir-516 a-2、mir-516 b-1和mir-516 b-2)共剪接命名为miR-516 a-3 p的相同成熟miRNA。我们评估了miR-516 a-3 p在我们的82例HCC患者队列中的临床价值。我们在体外和体内研究了miR-516 a-3 p对HCC恶性行为的影响,并通过exosomes研究了miR-516 a-3 p的细胞间转运。我们还进行了多组学(即,转录组学、蛋白质组学和代谢组学)分析以系统地探索miR-516 a-3 p介导的致癌性的分子机制2. 材料和方法2.1. TCGA数据分析如前所述分析TCGA数据[14]。简言之,从TCGA数据库获得HCC患者和非肿瘤对照的miRNA序列和临床数据利用edgR软件包对测序结果进行标准化,筛选差异miRNA。根据受试者工作特征(ROC)曲线计算各miRNA的截断值,将各miRNA的表达水平分为高表达组和低表达组。 采用单因素Cox比例风险回归分析筛选HCC OS的危险因素采用卡方检验分析肝癌组织中miRNAs表达与临床病理特征的关系。2.2. 代谢组如前所述进行代谢组学[23]。对于代谢物提取,将5 X 106(每个样品)miR-516 a-3 p转染的SNU-449(n= 8)及其对照用于代谢组学分析。提取所有样品的代谢产物,并转移至高效液相色谱仪进行分析。yhttps://portal.gdc.cancer.gov/根据制造商的说明书,使用串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析进行质谱分析。对于代谢物鉴别,使用MSconvert软件(ProteoWizard,USA)将原始质谱(MS)数据转换为mzXML,并使用XCMS软件包从软件中提取。根据各离子的保留时间(RT)和质荷比(m/z)数据,利用软件包meta X对MS 1谱进行了鉴定。特别是,MS2光谱与内部标准光谱库匹配。然后鉴定MS2谱的代谢物,并使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库和人类代谢组数据库(HMDB)进行注释。使用MetaboAnalyst 4.0μ M对已鉴别代谢物进行途径富集[24]。2.3. Proteomics对5 × 106(每个样品)miR-516 a-3 p转染的SNU-449(n= 3)及其对照进行蛋白质组学分析。简言之,用裂解缓冲液从样品中提取蛋白质,然后煮沸并在15 000 g下离心15 min。形成以检测所有样品的蛋白质浓度在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上解析每个样品20μg蛋白质后用考马斯亮蓝染色,进行过滤辅助的样品根据制造商的说明书,用串联质量标签(TMT)(Thermo Fisher Scientific,USA)标记肽。在液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析前,通过高pH(pH 10)Agilent 1260 Infinity II反相(RC)-HPLC系统(Agilent,中国)对TMT-肽进行分级分离。用配备Acclaim PepMap快速分离液相色谱(RSLC)柱(Thermo Fisher Scientific)的Easy-nLC超高效液相色谱(UHPLC)系统(Thermo Fisher Scientific)以300 nLmin-1 的 流 速 分 离 肽 级 分 。 使用 AQ Exactive Plus MS ( Thermo FisherScientific ) 进 行 MS 分 析 。 接 下 来 , 使 用 Mascot 2.6 ( MatrixScience , UK ) 和 Proteome Discoverer 2.1 ( Thermo FisherScientific)检索原始数据,然后与蛋白质用在线数据库KEGG基于正射的注释系统(KOBAS)3.0yy进行差异蛋白的KEGG分析。2.4. 转录组对5 × 106(每个样品)miR-516 a-3 p转染的SNU-449(n= 3)及其对照进行转录组学。简而言之,用TRIzol试剂(Invitrogen,USA)提取总RNA,并且用多聚T寡核苷酸连接的磁珠纯化信使核糖核酸(mRNA)。使用mRNA-seq样品制备试剂盒(Illumina,USA)将mRNA逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库。用AMPureXP珠纯化cDNA,并使用聚合酶链反应(PCR)扩增进行扩增。然后使用Illumina Hiseq X Ten系统(Illumina)对总测序文库进行测序。使用Hisat包通过将读数映射到参考基因组来分配样品的读数。进行StringTie以组装映射的读段。用KOBAS 3.0进行差异mRNA的KEGG分析。http://www.metaboanalyst.cayykobas.cbi.pku.edu.cn.T. Rui,X.Zhang,S.Feng等人工程16(2022)162164×××2.5. 目的基因的蛋白质组学和转录组学分析利用TargetScan y在线分析数据库筛选miR-516 a-3 p的潜在靶基因。所有候选靶标均与来自蛋白质组学或转录组学的下调蛋白或转录物的数据重叠。然后将重叠的蛋白质或转录物设置为miRNA的潜在靶点对目的基因的效应进行了系统分析2.6. 整合多组学与差异变量的传统统计选择不同,使用潜在成分(DIABLO)模型进行生物标志物发现的数据整合分析致力于使用多变量探索方法在多个维度和多个功能水平上选择变量[25]。同时通过L1惩罚选择功能,使构建的信号网络模型更具生物学解释性。因此,DIABLO已被广泛用于分析细胞生物学,探索机制,挖掘途径和构建结构。在这项研究中,将转录物、蛋白质和代谢物的矩阵输入DIABLO,以识别生物相关特征的主要组合该模型由两个组件组成,每个组件包含90个功能,共同选择在所有三种数据类型(2 - 30功能,每种数据类型)。 使用加权基因相关网络分析(WGCNA)R软件包,使用基于模块的方法将组学变量数据集转换为通路数据集。mixOmicsR软件包用于整合和可视化变量之间的相关性。利用igraph R软件包构建了群落结构,以直观地描述变量之间的密集程度和相关性为了构建分支连接网络,使用Metscape 3(来自KEGG和Edinburgh人类代谢网络(EHMN)的内部关系数据库)来整合基因表达(即,转录组学和蛋白质组学)和代谢组学[26]。2.7. 细胞培养HCC细胞系-即SNU-449、Hep G2、HUH-7和LM 3-购自美国典型培养物保藏中心或中国科学院细胞库。培养基用于细胞培养如下:RPMI 1640培养基(GIBCO,USA)用于SNU-449; Eagle最低必需培养基(Thermo Fisher Scientific)用于Hep G2; Dulbecco改良Eagle培养基(Thermo Fisher Scientific)用于HUH-7和LM 3。所有培养基均补充有10%胎牛血清(FBS)(BioIND,China)。将细胞在37 °C下在5%二氧化碳(CO2)下的加湿培养箱中培养。2.8. 细胞转染合成miR-516 a-3 p模拟寡核苷酸、抑制剂寡核苷酸及其对照(RiboBio)用于体外实验。RiboFECT(RiboBio)用于有效地yhttp://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_71/targetscan.cgi? miRg=hsa-miR-516a-3p根据制造商的说明书检测这些RNA寡核苷酸(模拟物为100nM,抑制剂为构建慢病毒载体颗粒(Genepharma,中国)以稳定表达用于体内实验的miR-516 a-3 p抑制剂。简言之,将miR-516 a-3 p抑制剂序列克隆到第三代包装系统载体中。将载体转染到293 T细胞中;然后,从上清液中收集并浓缩慢病毒用1 ×107感染性慢病毒颗粒单位(感染复数= 50)转导2× 105稳定表达miR-516 a-3 p抑制剂的LM 3细胞用21g·L-1的嘌呤霉素(ThermoFisherScientific)作用2周。2.9. 定量逆转录PCR(qRT-PCR)根据制造商的说明书,使用miRNeasy Mini Kit(No.217004,Qiagen,Germany)和Rneasy MinElute Kit(No.74204,Qiagen)从HCC细胞中提取和纯化总RNA和miRNA。为了分离细胞上清液的外泌体RNA,使用anexoRNeasy Maxi试剂盒(No.77164,Qiagen)。使 用 ABulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit ( C10211 ,Ribobio)检测表达。和成熟的miRNAs。简而言之,对于茎环miRNA qRT-PCR,使用特异性逆转录引物分别在42 °C下60分钟和在70 °C下10分钟合成pre-miRNA或miRNA cDNA。然后进行PCR扩增40个循环,每个循环在95 °C下15秒,在60 °C下30秒(对于pre-miRNA,使用55 °C的温度)。使用U6作为标准化对照,并使用循环阈值(CT)值com计算相对表达水平。二维CT方法。miR-516 a-3 p(MQPS 0001726 -1)、miR-516 a-5 p的逆转录引物和PCR扩增引物(MQPS0001727-1),和miR-516b-5p(MQPS 0001730 -1)合成并购自Ribobio。其他引物序列见附录A表S1。2.10. 蛋白质印迹分析如前所述进行蛋白质印迹分析[27]。简而言之,在定量和煮沸后,将所有收集的蛋白质用10% SDS-PAGE凝胶(FD 341 - 100,Fudebio,中国)纯化,然后转移到平衡的聚偏二氟乙烯膜上。然后将膜在室温下封闭1小时,并在4 °C下与一抗孵育过夜。在使用FDbio-FemtoECL ( FD 8380 , Fudebio ) 通 过 增 强 化 学 发 光(ECL)系统(Biotanon,China)进行检测之前,将膜与第二抗兔免疫球蛋白G(IgG)或抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)连接抗体孵育。所有15种抗体均列于附录A表S2中。2.11. 细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和5-乙炔基-20-脱氧尿苷(EdU)测定CCK-8测定和EdU测定用于检测细胞增殖。将已经用miR-516 a-3 p寡核苷酸转染的HCC细胞系接种在96孔板(对于CCK-8)或24孔板(对于EdU)中24小时。加入CCK-8试剂(Dojindo MolecularTechnologies,日本)并孵育1小时(用培养基稀释,1:10),并使用分光光度读数器(Multiskan FC,Thermo Fisher Scientific)检测450 nm处的吸光度。根据制造商的说明书,使用Click-iTEdUAlexa Fluor 488测定试剂盒(Invitrogen)测量细胞增殖用荧光显微镜(Photometrics Prime,USA)拍摄荧光图像T. Rui,X.Zhang,S.Feng等人工程16(2022)162165绿色荧光细胞与蓝色荧光细胞的比例反映了增殖效率。2.12. 实时细胞分析(RTCA)试验进行RTCA以监测细胞指数(CI),其以无标记的实时方式反映细胞增殖和侵袭。使用配备有E-Plate 96的AnxCELLigence RTCA单板(SP)仪器进行细胞增殖。使用配备有CIM-Plate 16(用基质胶预包被)的xCEL-Ligence RTCA双用途(DP)(ACEA Biosciences,USA)仪器来测定细胞侵袭。将已经用miRNA寡核苷酸转染24小时的HCC细胞接种在E-Plate 96或CIM-Plate 16中;然后根据制造商的说明书实时检测CI2.13. 集落形成测定在用miR-516 a-3 p寡核苷酸转染24小时后,将HCC细胞接种在12孔板中,并且每三天更换培养基。两周后,将细胞用多聚甲醛固定并用结晶紫(Sigma-Aldrich,Germany)染色。2.14. Transwell测定Transwell系统(Corning Inc.)用于细胞迁移和侵袭测定。简言之,用miR-516 a-3 p寡核苷酸转染HCC细胞24小时。对于侵袭测定,将Matrigel(BD Biosciences,USA)预包被到装饰Transwell膜的上室中,并与无血清培养基孵育2小时。基质胶不用于迁移试验。转染的细胞在上室中用无血清培养基重悬,板的下室含有血清培养基。培养24h后,用多聚甲醛固定,结晶紫染色.计数染色细胞以评估其侵袭能力。2.15. 双荧光素酶报告基因测定如前所述[27],对六种靶向抗体(LMBR1、CHST 9、RBM3、SLC7A6、PTGFRN和NOL12)的野生型或突变型非翻译区(30UTR)的序列进行了分析分别合成并克隆到pmirGLO载体(Repobio,中国)中。然后使用lipofectamine 3000 ( Thermo Fisher Scientific ) 用 构 建 的 载 体 和miR-516 a-3 p模拟物或对照模拟物共转染293个T细胞。48小时后,用荧光素酶检测所有细胞的双荧光素酶活性。双荧光素酶报告基因测定试剂盒(Vazyme,中国),根据制造商2.16. Cy 3标记的miR-516 a-3 p外泌体转移检测使用两种形式的培养系统来检测miR-516 a-3 p外泌体转移的途径。一种形式是共培养测定。用Cy 3-miR-516 a-3 p模拟物转染后,收获细胞并用无血清培养基洗涤三次。然后将它们接种在Transwell系统的上室中,(0.4μm,聚碳酸酯膜,CorningInc.),与将未处理的HCC细胞预接种在下室中。后24小时后,将下室中的细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次观察细胞表面Cy3红色荧光另一种形式的培养系统是媒介转移。在6-cm培养皿中用Cy 3-miR-516 a-3 p模拟物转染24小时后,将HCC细胞洗涤三次,然后用无血清培养基培养24小时。收集培养基并在4 °C下以3000g离心5分钟以除去细胞碎片。然后将上清液转移并培养到24孔板中,预接种未处理的HCC细胞。24小时后,用PBS洗涤细胞三次,并用荧光显微镜观察。两种形式的培养系统中的每一种都用外泌体产生的抑制剂处理GW4869(20μM,MedChemEexpress,USA)并用作对照。对照组。2.17. 外泌体纯化、鉴定和共培养在HCC细胞(稳定过表达miR-516 a-3 p的SNU-449和未处理的SNU-449)在15 cm培养皿中生长至80%汇合后,用10 mL无血清培养基替换原代培养基。24 h后,离心上清液在 3000g 下 在 4 °C 下 持 续 5 分 钟 , 然 后 用 Millex GV 过 滤 器 单 元( 0.22μm , MerckMillipore , Germany ) 过滤 。 然后 ,使 用exoEasy PCR仪提取并纯化上清液中的外来体。Maxi试剂盒(编号76064,Qiagen),根据制造商的说明书。最后,用400μL洗脱缓冲液洗脱吸收在膜中的外来体。一个exoRNeasy Maxi试剂盒(No.77164,Qiagen)用于分离外泌体RNA为了观察外泌体结构,将外泌体附着到铜网格上并用磷钨酸(2%)负染色1.5分钟。样品干燥15分钟后,用透射电子显微镜(Tecnai G2Spirit 120kV,ThermoFisherScientific)观察铜网格上的外泌体外泌体的流体动力学直径分布通过Nano-Nano 90仪器(Malvern,UK)根据制造商的说明书测量总共测试了五个样品,每个样品测试三次。对于外泌体和细胞共培养,用洗脱缓冲液洗脱外泌体。然后,将125μL外泌体-洗脱液加入含有HCC细胞的6cm培养皿中,并加入2.5mL媒体24小时后收获细胞用于进一步实验。2.18. 患者和标本HCC细胞和匹配的邻近非肿瘤组织获自在中国浙江大学医学院附属第一医院共入组82例HCC患者,其中女性28例(34.1%),男性54 例 ( 65.9% ) , 平 均 年 龄 ( 54.6 ± 12.9 ) 岁 。 其 中 , 44 例( 53.7% ) 具有 美国 癌症 联合 委员 会( AJCC ) 分期 低, 38 例(46.3%)具有AJCC分期高,38例(46.3%)具有乙型肝炎病毒(HBV)感染阳性,44例(53.7%)具有HBV感染阴性。所有患者均经术后病理证实为HCC。本研究方案经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。2.19. 肿瘤模型Balb/c雄性裸鼠(6-8周龄)获自中国科学院上海实验动物中心,并根据国家研究所实验动物护理和使用指南的标准接受护理。在给小鼠注射细胞之前,它们被随机分配到每组。为了使小鼠的痛苦最小化,在处死之前,所有小鼠都被麻醉并通过吸入CO2实施安乐死。动物研究方案由医学院附属第一医院伦理委员会批准。T. Rui,X.Zhang,S.Feng等人工程16(2022)162166×-浙江大学医学院。从主人处获得了动物参与研究的书面知情同意书。如前所述进行肿瘤模型[27]。简而言之,将已筛选稳定表达miR-516 a-3 p抑制剂的LM 3细胞系(2 × 106)及其对照皮下注射到小鼠的右侧腹(6周,每组n= 6)。28天后处死小鼠,收集所有肿瘤标本进行冻存或固定保存。为了进一步评估体内侵袭和转移能力,使用原位HCC小鼠模型(8周,每组n稳定表达miR-516 a-3 p抑制剂的LM3细胞系或其对照(1×106,1:1的Matrigel,50μL)分别移植于小鼠肝右叶。42天后,浸润和转移通过活体生物发光成像进行评估。2.20. 统计分析使用平均值±标准差(SD)或中位数±四分位距(IQR)描述定量变量 。 进 行 学 生分 析 两 组 定 量 变 量 的 比 较 。 单 因 素 方 差 分 析(ANOVA),随后进行事后分析 hoc Bonferroni检验用于两个组采用ROC曲线,计算最佳Youden指数,综合考虑敏感性和特异性,确 定 82 例 HCC 中 miR-516 a-3 p 表 达 的 最 佳 截 断 值 ( DCT=3.979704795)。Kaplan–Meier用对数秩检验评估曲线采用单因素和多因素Cox比例风险回归分析筛选影响肝癌预后的危险因素所有体外实验均独立重复,至少重复三次。使用统计产品和服务解决方案(SPSS)软件(版本19.0)进行统计分析,并将P值0.05设定为显著性水平。* 、**、* 和 * 分别表示P值为0.05、0.01、0.001和0.0001。如上所述进行多组学整合的统计分析3. 结果3.1. miR-516 a-3来源于C19 MC的4种致癌前体miRNA,与晚期HCC呈正相关,并独立预测肿瘤复发和死亡风险使用TCGA数据库,我们先前证明了几个C19 MC成员在HCC中显著上调[14]。在本研究中,我们进一步检索了miRBase数据库y,发现C19MC的四个成员(mir-516 a-1、mir-516 a-2、mir-516 b-1和mir-516b-2)共剪接了一个相同的成熟miRNA,即miR-516 a-3 p(附录A中的图S1)。首先,基于来自TCGA的数据,我们证实了与非肿瘤组织相比,四种pre-miRNA在HCC组织中显著上调(图1B)。附录A中的S2(a))。发现HCC中四种pre-miRNA的高表达与患者存活率差显著相关(图1A和1B)。附录A中S2(b)和(c))。在我们的中国队列中进一步验证了HCC组织中四种pre-miRNA的高表达(附录A中的图S3(a))。我们进一步证明,在四种常用的HCC细胞系中,miR-516 a-3 p比互补链(miR-516 a-5 p和miR-516 b-5 p)显著更高地表达(图1A和1B)。附录A中S3(b)和(c))。我们的研究结果表明,yhttp://www.mirbase.org/miR-516 a-3 p是来自四种pre-miRNA的功能性成熟miRNA(附录A中的图S3在我们的队列中,miR-516 a-3 p的表达在HCC组织中显著上调(图1(a))。我们进一步将肿瘤miR-516 a-3 p表达与HCC特征相关联,并发现肿瘤大小大于8 cm(vs< 8 cm)、多个肿瘤(vs单个肿瘤)和AJCC III-IV期(vs I-II)中肿瘤miR-516 a-3 p水平显著更高(图1A和1B)。1(b)-(d))。此外,与具有低miR-516 a-3 p水平的患者相比,具有高肿瘤miR-516 a-3 p水平的患者显示出显著较低的无肿瘤存活率和较低的总体存活率(图1A和1B)。1(e)和(f))。在多变量Cox分析中,显示肿瘤miR-516 a-3 p表达是HCC复发和HCC死亡率的独立影响因素(图1和图2)。1(g)和(h))。为了预测AJCC分期和miR-516 a-3 p表达的曲线下面积(AUC)分别为0.673和0.641。当两个变量合并时,AUC显示显著增加至0.722(均0.05)(图1(i))。我们进一步证实,肿瘤miR-516 a-3 p高表达也提高了HCC死亡率的预测。当AJCC分期和miR-516 a-3 p表达相结合时,AUC从0.740显著增加至0.792(所有P均<0.05)(图1)。 1(j))。3.2. miR-516 a-3 p在体内外我们进行了一组测试以评估miR-516 a-3 p对体外HCC增殖的影响(图2和图3a)。附录A中的S4和S5)。 所有试验(CCK-8、RTCA、EdU和集落形成)均显示,miR-516 a-3 p过表达显著促进HUH-7和SNU-449细胞的增殖(图1)。 2(a)和图 S4(a)、(c)和(e)),而miR-516 a-3 p的敲低抑制HCC细胞的增殖(图2(b)和图2(c))。附录A中S4(b)、(d)和(f))。 我们进行了Transwell测定,并观察到miR-516 a-3 p的过表达显著增加了HUH-7和SNU-449细胞的迁移和侵袭性(图1A和1B)。 S5(a)和(c),而miR-516 a-3 p的敲低具有相反的作用(图1A和1B)。附录A中S5(b)和(d))。 使用Transwell系统的RTCA进一步验证了miR-516 a-3 p对HCC细胞侵袭的作用(图1A和1B)。 2(c)和(d))。此外,使用稳定表达miR-516 a-3 p抑制剂或其对照的LM 3细胞系建立皮下裸鼠HCC模型皮下注射后四周处死小鼠,测量肿瘤体积结 果 显 示 , miR-516 a-3 p 抑 制 剂 显 著 抑 制 HCC 的 生 长 ( 图 2(e))。与对照组相比,miR-516 a-3 p抑制剂导致较小的肿瘤体积(图2(f))和肿瘤重量(图2(g))。为了评估miR-516 a-3 p在肿瘤转移中的作用,建立了原位HCC小鼠模型。将稳定表达miR-516 a-3 p抑制剂的ALM 3细胞系或其对照植入裸鼠的右肝中六周。应用荧光素酶成像来评估肿瘤的生长和转移;其显示与对照组相比,miR-516 a-3 p受体组在肝脏(原发性肿瘤)和肺(转移性肿瘤)两者中具有较低的肿瘤负荷(图1A和1B)。2(h)-(j)和附录A中的图S6)。3.3. miR-516 a-3 p通过外泌体在HCC细胞中递送并增加受体细胞的致癌活性我们将转染有Cy 3标记的miR-516 a-3 p的SNU-449细胞(供体细胞)与未处理的SNU-449细胞(受体细胞)共培养。我们观察到共培养24 h后受体细胞含有强烈的Cy 3- miR-516 a-3 p荧光(附录A中图S7),这表明miR-516 a-3 p可以在HCC细胞之间转移。T. Rui,X.Zhang,S.Feng等人工程16(2022)162167图1.一、miR-516 a-3 p与HCC恶性程度呈正相关(a)与邻近的非肿瘤组织相比,miR-516 a-3 p在HCC组织中上调(n = 25)(Student配对t检验);(b)-(d)高肿瘤miR-516 a-3p表达与(b)大肿瘤尺寸、(c)大肿瘤数量和(d)高AJCC分期(n = 82)正相关(Mann-Whitney检验);(e,f)Kaplan-Meier和对数秩检验证实高肿瘤miR-516 a-3 p表达区分(e)差的HCC无肿瘤存活和(f)OS;(g,h)多变量Cox比例风险模型证明肿瘤miR-516 a-3 p表达是HCC(g)复发和(f)OS的独立风险因素。(h)(i,j)ROC的AUC显示肿瘤miR-516 a-3 p表达改善了(i)HCC复发和(j)死亡率的预测HR:风险比; AUC:曲线下面积。我们进一步评估了外泌体介导的miR-516 a-3 p在HCC细胞中的传递。我们将GW 4869加入到共培养系统中,观察到受体细胞的Cy3荧光显著减弱(图3(a))。此外,我们将供体细胞在含有GW4869或二甲基亚砜(DMSO)的无血清培养基我们发现,受体细胞的Cy3荧光的摄取也被GW 4869减弱(图1)。 3(b))。接下来,我们从过表达miR-516 a-3 p的SNU-449细胞中分离外泌体(exo516 a-3 p)。通过透射电子显微镜鉴定典型外泌体的直径约为100 nm(附录A中的图S8(a))。使用动态光散射(DLS)描述水合颗粒的分布(附录A中的图S8(b))。阳性外泌体标志物(CD9、CD81、CD63、TSG 101、HSP 70和HSP 90)进一步证实了纯化的外泌体的身份(图1B)。附录A中S8(c))。我们提取了外泌体miRNA,发现与外泌体对照(exoCtrl)组相比,miR-516 a-3 p在exo516 a-3 p中大量富集(图3(c))。exo 516 a-3p的释放被GW 4869显著抑制(图1B)。 3(d))。我们进一步使用Triton X-100破坏外泌体的膜并释放包裹在外泌体中的内容物然后使用核糖核酸酶(RNase)降解外泌体miR-516 a-3 p(图1B)。3(e))。有趣的是,在用来自供体细胞的培养基处理受体细胞后,我们用异硫氰酸荧光素(FITC)-溶酶体荧光标记溶酶体,并发现Cy 3-miR-516 a-3 p与FITC-溶酶体共定位(图1B)。 3(f))。我们进一步评估了外泌体介导的miR-516 a-3 p转移在HCC细胞中的作用。我们将SNU-449和HUH-7细胞与纯化的exo516 a-3 p孵育24小时,发现这些细胞中miR-516 a-3 p表达显著增加(附录A中图S9受体细胞表现出增强的肿瘤恶性,包括集落形成、细胞增殖、迁移,T. Rui,X.Zhang,S.Feng等人工程16(2022)162168图二、Mi R -516 a-3 p在体外和体内促进HCC细胞的恶性化。(a,b)RTCA记录用转染后HUH-7和SNU-449的细胞增殖指数。(a)miR-516 a-3 p模拟物,(b)miR-516 a-3 p抑制剂,或它们的对照(对照);(c,d)CI的变化反映了用miR-516 a-3 p模拟物转染后HUH-7和SNU-449的侵袭。(c)miR-516 a-3 p模拟物或(d)抑制剂;(e)-(g和侵入性(图附录A第9(b)-(e)条)。因此,我们提出外泌体介导的递送在HCC细胞中miR-516 a-3 p诱导的致癌活性中起着至关重要的作用(图1B)。 3(g))。3.4. 多组学网络发现策略揭示了三个“组学”的相对相关性和差异性我们进行了转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析,以绘制多组学miR-516 a-3调控的分子网络。DIABLO方法用于组学研究的模型-用于整合相关生物过程和区分差异表型的多组学方法-被执行以成功地选择代表每个组学的变量(图2)附录A第S10(a)和(b)节)。接下来,我们进行了偏最小二乘判别分析(PLS-DA)并创建了聚类热图,以证明来自数据集的可变表达谱可以区分miR-516 a-3 p过表达的SNU-449细胞与对照细胞(附录A中的图4(a)和图S10(c))。然后,我们构建了一个概述,数据集的相关性,并最终确定了强相关性,这是沿着根据变量相关性分析,Circosplot证明来自三个组学的变量是交叉相关的(图4(c))。从相关圆图中,它提供了更好的可见性的相关程度,我们发现了基于聚类的一致性之间的蛋白质组学和代谢组学数据集。相比之下,转录组学变量相对分离,T. Rui,X.Zhang,S.Feng等人工程16(2022)162169图三. miR-516 a-3 p通过外泌体在HCC细胞之间转移。(a)共培养体系用GW 4869或DMSO处理24 h后,(b)将供体细胞与GW 4869或DMSO一起培养24小时后,将培养基转移到受体细胞中(c)与exo Ctrl外泌体相比,来自exo 516 a-3 p外泌体的miR-516 a-3 p表达水平的实时PCR分析;(d)来自用GW 4869、DMSO或模拟物处理的miR-516 a-3 p过表达SNU-449细胞的外来体的miR-516 a-3 p表达水平的实时PCR分析;(e)来自用RNA酶或RNA酶与Triton X-100组合处理的miR-516 a-3 p过表达SNU-449细胞的外来体的miR-516a-3 p表达水平的实时PCR分析;(f)SNU-449细胞和HUH-7(绿色虚线)用FITC-溶酶体染色并用共聚焦荧光显微镜观察,箭头指示Cy 3标记的miR-516 a-3 p和溶酶体的共定位;(g)示意图表明在HCC细胞中实现了miR-516 a-3 p的外泌体转移。DAPI:4,6-二氨基-2-苯基吲哚; DMSO:二甲亚砜; FITC:异硫氰酸荧光素; RNase:核糖核酸酶;exo 516 a-3p:分离的外泌体;exo Ctrl:外泌体对照。其他两个数据集(图4(d))。这些结果通过成分分析得到进一步验证,当我们将多组学变量的特征转化为可视化社区时。蛋白质组学和代谢组学中的变量紧密地聚集在一起,而转录组学中的变量
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