生物调控网络模型的计算系统生物学建模与形式化方法的研究

理论计算机科学电子笔记180（2007）3-14www.elsevier.com/locate/entcs生物调控网络Gilles Bernotb 弗兰克·卡塞a Jean-PaulCometbFranckDelaplaceb C'elineMüllerb OlivierRou xa一 IRCCyN，UMR CNRS 6597，BP921011rueedelaNo？e，44321NantesCedex3，FrancebLaMI-genopole，UMR CNRS 8042，UEVE，523 Place des Terrasses，91025 Evry Cedex，France摘要本文的目的是重新审视生物调节网络（BRN）模型，该模型是由Ren'eThomas提出的，目的是根据生物的特性进行反应。 我们将为BR N系统中的数据库管理系统提供一个数据库管理系统，以优化由Ren ′eThom a s提供的数据库管理规则。 我们展示了如何使用这个模型来发现BRN的有趣属性，如稳定状态集，循环等，使用分析过渡系统的工具。关键词：生物调控网络，BRN，生物系统1引言生物系统建模。大量表达数据的到来使计算方法成为克服实验数据解释困难的重点。数据并没有提供对生物系统的清晰解释，而是揭示了分析它们的困难。组件的多样性及其相互作用的能力导致应对其复杂性。这开辟了一个研究计算生物系统的建模领域。计算系统生物学[10]试图建立方法和技术，使我们能够理解系统的结构，如基因/代谢/信号转导网络。这种系统的动力学建模是控制、设计和修改系统的第一步，以确保某些期望的特性[4]。正式方法。形式化方法在安全关键系统的验证领域已经使用了十多年。由此产生的技术和工具1571-0661 © 2007 Elsevier B. V.在CC BY-NC-ND许可下开放访问。doi：10.1016/j.entcs.2004.01.0384G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）3场来分析这些系统的行为，使得建模和验证复杂的并发系统（大量的状态）成为可能，即使是连续的信息（密集的时间）或参数。因此，尝试并使用这些技术来建模和分析生物系统是很自然的，特别是当人们想要找到有关其行为的属性时。生物监管网络。生物调控网络（在续集BRN中）模拟生物实体（RNA或蛋白质）之间的相互作用。它们的调节涉及许多复杂的过程，但通常只考虑激活和抑制两种作用来简化调节的复杂性。BRN由图静态表示：顶点抽象基因，边表示它们的相互作用（激活或抑制）。此外，在给定的时间，数值与每个顶点相关联，以描述相应实体的浓度水平本文所讨论的是连续微分方程组的离散化问题[ 5 ]，它面临着用微分方程进行更经典的然后Thomas和Snoussi证明了所有的稳态都可以通过离散方法找到[6]。最近，Thomas和Kaufman证明了离散描述提供了离散方程的定性拟合，其中参数的值有少量可能的组合[9]。Ren′eTommas和co-workers的工作为基因调控及其分析提供了一个新的计算框架[1]。我们的贡献。在本文中，我们提出了一个语义的扩展基因调控模型，R.托马斯的理论在我们的扩展模型中，基因可以在一定水平上是激活剂，在另一个水平上是抑制剂。据我们所知，这是第一次为BRN提出正式的语义。这使我们能够自动导出BRN的行为模型，并使用现有的工具来分析有限状态模型（例如模型检查工具）。论文大纲本文的组织如下：第2节给出了BRN的基础知识。本文的核心是在第3节中，我们给出了一个正式的语义BRN。在第4节中，我们展示了一个小例子，如何使用工具HyTech[2]来分析BRN。2生物监管网络符号给定一个有限集合E，|E|表示E的基数。我们将集合记为2EE.设φ是集合X上的命题逻辑公式，[[φ]表示在φ中的向量集的值集. 通过比较，如果U=0，φ（x）是命题公式，x∈Uφ（x）= true。G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）35生物学的例子通常依赖于区间：整数区间[a，b]代表变量的 集 合 {x∈N，a≤x≤b}，并且wedente[]tem ptyinterva l。生物调控网络的原始模型[3]假设基因产物的实际浓度可以用整数水平近似：连续浓度函数用分段常数函数近似这些恒定的水平给出了基因的表达水平。在我们对生物调控网络的正式描述中，一组V从变量x到y的定向边表示x是y的调节因子（激活因子、抑制因子）。定义2.1 [生物调控网络。] 生物调控网络（BRN）是一个3-upleR =（V，E，π），其中：• V是一组有限的顶点，• EV×V是一组有限的边，• π=（π+，π−）其中π：E<$→2N× 2N分别为激活和抑制与边e∈E相关联的函数。此外，我们假设：E∈E，· π+（e）<$π−（e）/= []：边缘对应于规则。· π+（e）<$π−（e）= []：对于给定的水平，一个基因不能既是激活剂又是抑制剂。注2.2对于v∈V，我们也用v表示基因v的表达水平。π+（x，y）（分别π−（x，y））给出了x激活的区间（分别为抑制）y.注意，π+（x，y）= []（resp. π−（x，y）= []），意味着x永远不会激活（相应地，抑制）y.还要注意，定义2.1排除了π+（x，y）=π−（x，y）= []的边（x，y），这些边在网络中没有可观测的效应。([1、1]、[2，2]）XX y z 示例1示例2Fig. 1. BRN示例例2.3图1给出了BRN的两个例子。 在第一个例子中，V={x，y，z}和π（x，y）=（[1， 1]，[]）：当x的水平为1时，x激活y;π（y，x）= y6G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）3([]，[1， 1]）：当y具有水平1时y抑制x;π（z，y）=（[1， 1]，[]）：z激活y当z为1时。 第二个例子的含义是相应定义的。定义2.4 [激活剂和抑制剂。] 设R=（V，E，π）是一个生物调控网络，我们定义以下集合：(i) R+（x）={y∈V，π+（y，x）/=[]}是x的活化子s的条件，(ii) f∈V，R−（x）={y∈V，π−（y，x）=[]}是f在x的hi位或s中的集合。E x示例2.5对于Figure 1的示例，R +（x）= 1，R−（x）={y}，R+（y）={z，x}，R−（y）= 1，并且R+（z）=1，R−（z）=1。 Inexample2R+（x）=l，R−（x）={y}anddR+（y）={x}，R−（y）={x}.3生物调控网络的形式语义在Ren'eThomas t h e r y中，由“吸引子”的原始概念描述了g e n e s的六个优先级的演化非正式地说，它代表了一个上限或下限，如果BRN的其余部分没有发生变化，则可以达到。因此，浓度演化的计算基于吸引子。它们由一组参数定义。BRN的演化高度依赖于这些参数的选择。在本节中，我们通过一个过渡系统形式化了BRN的状态演化。这种语义还涉及一些演化参数，如[3]中定义的3.1BRN的状态空间定义3.1 [BRN的状态空间。] 设R=（V，E，π）是BRN。变量x∈V的状态空间Sx定义为Sx=[0， maxy∈Vπ+（x，y）<$π−（x，y）]。R的状态空间定义为S（R）= ×x∈VSx。网络R的一个状态是一个映射ν：V→N，使得<$x∈V，ν（x）∈Sx。前面对集合Sx的定义要求0属于状态空间。例3.2对于图1的例2，Sx=[0， 2]，Sy=[0， 1]。3.2BRN的参数正如本节开头所述，BRN的行为取决于一些参数。这些参数起着吸引子的作用，并根据哪些基因激活或抑制基因，给出基因被吸引的表达水平。定义3.3 [BRN的参数。] 设R=（V，E，π）是BRN。集合R的参数的Para（R）定义为：P ara（R）={Kx，A，B|A<$R+（x）， B<$R−（x）}G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）37参数Para（R）的赋值是映射κ：Para（R）→N，使得<$x∈V，A<$R+（x），B<$R−（x），κ（Kx，A，B）∈Sx. 接下来我们用Kx，U，V而不是κ（Kx，U，V），当从上下文的意义是明确的定义3.4 [活动假设。] 设R=（V，E，π）是BRN，κa是Para（R）的赋值. κ满足活度假设i∈V：<$y∈R+（x），<$X+<$R+（x），<$X−<$R −（x），κ（Kx，X+<${y}，X−）>κ（Kx，X+，X−）<$y∈R−（x），<$X+<$R+（x），<$X−<$R−（x），κ（Kx，X+，X−<${y}）κ（Kx，X+，X−）定义3.5 [单调性假设。] 设R=（V，E，π）是BRN，κb是P ara（R）的一个值. K是单调性y分配函数：R+（x），<$X −<$R−（x），<$X J<$R+（x），<$X J <$R −（x），X+<$X J，XJX−+ − + −κ（Kx，X+，X−）≤κ（Kx，XJ，XJ）。+ −活性假设代表一个基因对另一个基因的作用的可观察性。如果没有这种假设，基因激活剂的任何组合都可能对靶基因没有任何可观察到的效应，因为其表达水平将保持不变。那么，似乎很明显，参数的任何估值都应该满足这个性质。单调性是一个生物学上的经验事实，也是由Ren′eThomas导出的。一个新的思维框架并不依赖于这些由生物学激发的假设例3.6在图1的例2中，参数的可能赋值为：Kx，x，x=0，Kx，x，y= 1和Ky，x，x=0，Ky，z，x=0，Ky，x，z，x =1和Ky，x，z，x = 1和K y，x= 1和Ky。Kz，λ，λ=0。不要让这种价值观不符合特定的保护要求Kx，n，n≥Kx，n，y. 如果设Kx，n，n=1，Kx，n，y=0，则满足此条件。3.3BRN的过渡系统让我们考虑一个BRNR=（V，E，π）。 [8，7]国家的演变网络的大小取决于（i）基因的表达水平（ii）一组参数（见Def.3.3）。基因x的表达水平可能降低，如果X+和X−分别是当前激活x的基因集合和当前抑制x的基因集合，则x的值朝着由参数Kx，X+，X−定义的值演变。根据网络中给定的水平，可以定义哪些基因当前激活或抑制x（例如，图1的示例2，当其表达水平为1时，x激活y，当其表达水平为2时，x抑制y，当其表达水平为0时，x对y没有影响。我们根据Def中基因x的激活子和抑制子正式定义了网络的不同配置三点七定义3.7 [BRN的状态约束。] 对于x∈V，X+<$R+（x），X−<$R−（x），我们定义Ax，X+，Ix，X−和Cx，X+，X−为：• Ax，X+=.Σy∈X+（y∈π+（y，x））.Σy∈R+（x）\X+（y∈/π+（y，x））.- 是的 Σ• Ix，X−=y∈X−（y∈π−（y，x））<$y∈R−（x）\X−（y∈/π−（y，x））8G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）3• Cx，X+，X−=Ax，X+<$Ix，X−如果X+中的基因值在它们激活x的区间内，而X-中的基因值在它们抑制x的区间内，则Cx，X+，X-为真。例3.8对于图1的例2，激活和抑制函数是：π+（x，y）=[1，1]，π−（x，y）=[2，2]和π+（y，x）=π，π−（y，x）=[1，1]。 激活子和抑制子集合由R+（y）=x，R−（y）=x和R+（y）= x，R−（x）=y给出。本文给出了一种新的计算方法：Cx，n，n=y∈/[1，1]，Cy，x，n=x∈[1，1]<$x∈/[2，2]和Cy，n，x=x∈/[1，1]<$x∈[2，2]。网络状态演化的另一个特征是，基因x的表达水平是逐步演化的，即它不能在一个步骤中从1到3，它必须从1到2演化一个单位，如果满足某些条件，1将从2到3。这在演化算子的定义中得到了体现：定义3.9 [演化算子F.] 设x∈N，k∈N. 演化算子F由下式定义：⎧x−1i⎨xFk=x+1 ix k我的朋友们注意，在x=k的情况下，x的下一个值将保持等于k。我们现在可以定义一个给出BRN语义的转换系统定义3.10 [BRN的跃迁系统。] 设R=（V，E，π）为BRN，κ为Para（R）中参数的赋值赋值为κ的R的语义是标记转移系统SR（κ）=（S（R），V，→），其中→S（R）×V×S（R）使得：⎧<$$>A<$R+（x），<$B<$R−（x），ν∈[[Cx，A，B]]⎪⎪xJv（x）/=Kx，A，Bν→ν ⇐⇒拉吉⎪∧ν(x) =xFKx,A,B⎪⎩∧∀y/=x,νJ(y)=ν(y)注3.11注意，根据定义3.7，存在唯一的νJ，使得νxJ→ν。转移系统SR（κ）是（部分）确定性的，在这个意义上，对于每个x跃迁都是确定性的。然而，可能存在从状态ν的另一个y-跃迁，因此SR（κ）不是确定性的。非决定论模拟了基因表达水平异步进化的事实还要注意的是，只有当x没有达到它倾向于接近的值（即，Kx，A，B代表右边1 可能是从第二层到第三层是不可能的。⎪G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）39→A和B）。这将使我们能够将网络的稳定状态定义为没有传出转移的状态（死锁状态）。定义3.12 [BRN的稳定状态。] 设R=（V，E，π）是BRN，κPara（R）中参数的赋值和SR（κ）=（S（R），V，→）的语义.一个状态ν∈S（R）是不稳定的i ∈νJ∈S（R），x∈V，使得νxVJ. 状态ν是稳定状态，如果它不是非稳定状态（即稳定状态是死锁状态）。4简单案例研究在本节中，我们考虑图1的示例1。我们使用验证工具Hytech[2]自动计算结果。当然，我们可以选择任何模型检查器来分析我们的模型，但是Hytech使我们能够计算参数上的一些约束，以便满足某些属性（我们将不在本文中Hytech输入文件和结果见附录A。活化剂和抑制剂的组在第4页的实施例2.5中给出。状态空间是Sx=[0，1]，Sy=[0，1]和Sz=[0，1]。 这些参数是Kx，λ，λ，Kx，λ，y（对于x）;Ky，λ，Ky，x，λ，Ky，z，λ，Ky，{x，z}，λ（对于y）和Kz，λ，λ（对于z）。4.1正则稳定化让我们为参数设定以下值：Kx，λ，λ=1Kx，x，y= 0Ky，，= 0Kz，，= 0Ky，x，n = 0Ky，z，n = 0Ky，{x，z}，k=1该等参数满足单调性及活动假设。对于这个例子，我们得到了附录A中图A.1给出的跃迁系统。Hytech输入文件见附录A。我们可以很容易地计算稳定状态和非稳定状态的集合，如输出文件图A.3，附录A，12所示。请注意，循环确实揭示了一个不稳定的平衡状态。4.2无常规稳定化的现在让我们将参数固定为：Kx，λ，λ=1Kx，x，y= 0Ky，，= 0Kz，，= 0Ky，x，n=1Ky，z，n=1Ky，xz，n=110G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）3在这种情况下得到的转捩系统如图A.1右边的附录A所示。同样，用Hytech获得的结果（图A.3右侧，附录A，第12页）表明，在这种情况下不存在规则的稳定状态。请注意，循环实际上是一个稳定状态，在R.Thomas的方法中称为奇异5结论和今后的工作本文给出了生物调控网络的形式化语义。这项工作的主要优点是（i）形式语义使我们能够自动构建网络的（行为）模型（ii）然后可以通过验证工具分析该模型，就像安全关键程序一样（例如，形式语义表征稳定和非稳定状态）。我们未来的工作将包括在网络中添加时间约束，以构建更准确的模型。我们的语义已经准备好扩展时间约束：在这种情况下，我们将导出一个时间或混合自动机模型，并使用工具来分析这种类型的模型，以证明网络的属性确认作者感谢埃夫里（H。Pollard和P. Tambourin）的持续支持。匿名推荐人的评论也很有建设性。引用[1] O. Cinquin和J. Demongeot。正反馈和负反馈在生物系统中的作用。 C. R. ，325（11）：1085 -1095，2002.[2] Thomas A. Henzinger，Pei-Hsin Ho，and Howard Wong-Toi. HYTECH：混合动力系统的模型检测器。International Journal on Software Tools for Technology Transfer，1（1-2）：110[3] M. Kaufman和R.托马斯体液免疫反应多平稳性基础的模型分析。J. Theor Biol. ，129（2）：141[4] H.北野超越细节：遗传学和分子生物学中系统导向方法的兴起。Curr. Genet. ，41（1）：1[5] E.H.斯努西分段线性微分方程的定性动力学：离散映射方法。系统的动力学与稳定性，4：189[6] E.H. Snoussi和R.托马斯所有稳定状态的逻辑识别：反馈回路特征状态的概念。布尔.数学.生物，55（5）：973[7] R.托马斯 包含反馈回路的系统的逻辑分析。 J. Theor Biol. ，73（4）：631[8] R. Thomas，A.M. Gathoye，and L.兰伯特复杂的控制电路。调节温和噬菌体的免疫力。EUR. J.Biochem. ，71（1）：211[9] R. Thomas和M.考夫曼多稳态，细胞分化和记忆的基础I. 二.Chaos，11：170[10] O.沃肯豪尔系统生物学：系统论在生物学中的应用？简介Bioinform。，2（3）：258G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）311A附录在附录中，我们展示了Hytech在生物调控网络分析中的应用。对于第4节的例子，我们使用图A.2的输入文件来建模我们的网络。 过渡系统如图A.1所示。结果见图A.3。yX（1，1，0）zz（0，0，0）yX（0，0，1）X（0，0，1）（1，0，0） （0，1，0）z y（1，0，1）z y（1，1，1）X（0，0，0）Xx（1，0，0）（1，1，1）yy（1，1，0）X（0，1，1）（0，1，1）（0，1，0）图A.1例2.3中BRN的两个跃迁系统，图1例（左）和1例（右）常规稳定zXz（1，0，1）yyzz12G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）3--hytech输入文件vark_x_O_O，k_x_O_y，k_y_O_O，k_y_x_O，k_y_z_O，k_y_xz_0，k_z_O_O：参数r;--参数x，y，z：离散;结束;打印“可到达的状态是：“;在f_reachable endhide打印隐藏k_x_O_O，k_x_O_y，k_y_O_O，k_y_x_O，k_y_z_0，k_y_xz_0，k_z_O_0，k;k：离散的; --k在每个离散的转变上变化k1，k2，k3：参数; --用于检测周期自动机rrbsynclabs：;initial Start;loc开始：while x>=0 y>=0 z>=0 x =1 y =1 z =1 wait {}&&&&&--C_x，O，O -> K_x_O_O当y 1 x > k_x_O_O做{--C_x，O，y当y >= 1 x k_x_O_y时，{--C_y，O，O -> k_y_O_O当x 1 z 1 y k_y_O_O做{&&&&--C_y，x，O -> k_y_x_O_0当x>=1 z 1 y k_y_x_0时，{&&&&--C_y，z，O当x 1 z>=1 y k_y_z_O时，{&&&&--C_y，xz，O当x>=1 z>=1 y k_y_xz_0时，执行{&&&&--C_z，O_O当z k_z_O_O做{端var init_reg，f_reachable，stable_states，non_stable_states，xy_f_reachable，cycle_states： region;init_reg：= loc[rrb]=Start&x>=0 y>=0 z>=0 x =1 y =1 z =1 k_x_O_O=1k_x_O_y=0 k_y_x_O=0 k_y_x_O = 1 k_y_z_O=1 k_y_xz_0=1 k_z_O_O=0;print“initial values for theK_ parameters and x，y，z：“;print omit rrb locations hide k，k1，k2，k3 ininit_regendhide;- -计算状态的可达集. 必须是有限的--即使有一个循环f_reachable：=从init_reg endreach向前到达;如果为空（f_reachable）然后打印“No reachable states.“; else--计算f_reachablexy_f_reachable e：=hidek_x_O_O，k_x_O_y，k_y_O_O，k_y_x_O在x，y上的投影，f_可达端隐层中的k_y_z_0，k_y_xz_0，k_z_O_0，k;--计算非稳定状态的集合，即可达状态--有继任者--定义严格的前置运算符--这里有一个用Hytech做这件事的技巧--集合的前趋集合，包括集合本身）--hide k in pre（Ak=0）k=1 endhide给出严格的前趋&&--A非稳定状态：=f_可达&hide k in（pre（f_reachable k=0）k=1）endhide;&&--打印结果如果为空（non_stable_states），则打印“No nonstable states”;否则print“the reachablenon-stablestates are：“;printthidek_x_O_O，k_x_O_y，k_y_O_O，k_y_x_O，k_y_z_0，k_y_xz_0，k_z_O_0，k在非稳态端部隐藏;结束;stable_states：= f_reachable ~non_stable_states;if empty（stable_states）&然后打印“没有稳定状态. ！！！“;elseprints“The reachablestablestates are：“;printthidek_x_O_O，k_x_O_y，k_y_O_O，k_y_x_O，稳定状态下的k_y_z_0、k_y_xz_0、k_z_O_0、k结束;--现在寻找周期. 容易在hytech与隐藏存在量化（Existential Quantitative）--首先我们定义严格后继函数--这是一个帖子，其中k的变化，其次是达到cycle_states：= x=k1 y=k2 z=k3 f_reachable&&&&从隐藏k_x_O_O，k_x_O_y，在（post（x=k1 y=k2 z=k3 f_reachable k=0）k=1）端隐端达中的k_y_O_0，k_y_x_0，k_y_z_0，k_y_xz_0，k_z_O_0，k;&&&&&--如果为空则打印结果（cycle_states）然后打印“系统中没有无限路径”;否则打印“系统中有一个循环！......这是什么？从这些国家中的任何一个：“;在cycle_states endhide打印隐藏k_x_O_O、k_x_O_y、k_y_O_O、k_y_x_O、结束;图A.2例2.3中BRN的Hytech规范，图1。G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）313K_ 参 数 和 x 、 y 、 z 的 初 始 值 ： k_x_O_O=1k_x_O_y=0&k_y_O_O =0&&k_y_x_O = 0&k_y_z_O = 0&k_y_xz_0 =1&k_z_O_O = 0& x< = 1& y< = 1&z >= 0x >= 0y >= 0z = 1可达性所需的迭代次数：1可达状态包括：位置：开始X =1&y ≥ 0&z< = 1&x >= 0&y< = 1&z >=0，可达到的非稳定状态是：位置：开始x = 0时&y 1&z >= 0&y ≥ 0&z< = 1|y = 1&x = 1&z = 1&z >=0|y = 1&z 1&X 1&z >= 0&x >= 0|z = 1y ≥ 0&x = 1&x >= 0&y = 1可达到的稳定状态是：位置：开始y 10 x&z 1&y >= 0 x = 1z &>=0.......可达性所需的迭代次数：7系统中有一个循环！... 从这些国家中的任何一个位置：开始z = 1&y = 0时x& = 1|z = 1&y = 1x& = 0时|z = 1&y = 1x& = 1|z = 1&y = 0时x& = 0时=================================================================使用的最大内存=0页=0字节=0.00MB花费的时间= 57.24u +6.24s =总计 63.48秒=================================================================K_参数和x、y、z的初始值：k_x_O_O= 1&k_x_O_y= 0&k_y_O_O= 0&k_y_x_O= 1&k_y_z_O= 1&k_y_xz_0= 1&k_z_O_O= 0& x< =1& y< = 1&z>= 0&x>= 0&y≥ 0&z<= 1可达性所需的迭代次数：1可达状态包括：位置：开始x = 1&y ≥ 0&z = 1&x >= 0&y = 1&z >=0可达到的非稳定状态是：位置：开始x = 0时&y 1&z >= 0&y ≥ 0&z = 1|y = 1&x = 1&z = 1&z >= 0|y = 1&z 1&X 1&z >= 0&x >=0|y = 0时&x = 1&= 0|z = 1&y≥ 0&x= 1&x>= 0&y= 1可达到的稳定状态是：位置：开始0年&z 1&x = 1&0 x&z >= 0&y<1|y ≥ 0&z 1&0 x&X 1&z >= 0&y<1.......可达性所需的迭代次数：7系统中有一个循环！... 从这些国家中的任何一个：位置：开始x = 1&y = 0时&z >= 0&z<1|x = 0时&y = 1&z >= 0&z<1|x = 1&y = 1&z >= 0&z<1|x = 0时&y = 0时&z >= 0&z<1=================================================================使用的最大内存=0页=0字节=0.00MB花费的时间= 73.04u +8.10s = 81.14秒=================================================================图A.3Hytech结果，例如图A.2（有（左）和无（右）常规稳定）14G. Bernot等人/理论计算机科学电子笔记180（2007）3