基于表位的炭疽杆菌候选免疫原的生物信息学评价

医学信息学解锁24（2021）100574基于表位的候选免疫原的抗炭疽杆菌埃米尔侯赛因·沙马基、伊马德·科尔德巴赫*伊玛目侯赛因大学，科学学院，生物系，伊朗A R T I C L EI N FO关键词：生物信息学炭疽芽孢杆菌炭疽嵌合蛋白表位疫苗A B S T R A C T炭疽杆菌是一种高度传染性的细菌，并导致炭疽。它感染温血哺乳动物，同样，它的孢子已被武器化并用于生物战，影响了许多人。炭疽的预防仍然是临床医生面临的巨大挑战。疫苗接种是最有希望的方式，新一代基于表位的疫苗受到广泛关注。由于这种重组疫苗直接靶向免疫系统，因此提供了有效和快速的应答。如今，通过计算机工具收集表位信息非常准确和简单。在这方面，各种最好的生物信息学服务器是应用于鉴定潜在的B细胞、T细胞、IFN-γ、IL-10和IL-4表位，而无过敏原性也无毒性作用。的选择高等级表位并通过GPGPG和EAAAK接头彼此融合。他们构建了支架以及L7/L12佐剂和6X His标签。使用生物信息学工具对理化性质、二级和三级结构进行了评价、精炼和确认。IgG1、IgG2、T-利用免疫模拟工具预测细胞因子、辅助性T细胞、INF-γ和白细胞介素而且表位蛋白与受体的分子对接和动力学模拟显示了合适且稳定的结合亲和力。总的来说，工程化的重组蛋白可以有效地被认为是候选免疫原。1. 介绍炭疽是由革兰氏阳性、包囊、孢子形成、杆状和需氧细菌炭疽芽孢杆菌引起的[1]。它主要感染反刍动物和其他温血哺乳动物。在人类感染中，人畜共患病细菌通过与受感染动物、动物产品或废物接触而感染人类[2]。与此同时，炭疽孢子现已发展成为生物武器，并已用于生物战[3]。B.炭疽孢子对环境条件具有极强的抵抗力，甚至可以存活数十年。进入主机后B.炭疽病可经皮肤、胃肠道或吸入途径侵入宿主;后者是最致命的。孢子在血流中扩散并引起临床症状，包括发热、水肿甚至坏死、败血症和静脉塌陷[4，5]。即使有建议-针对保护性抗原（PA）的吸附疫苗（AVA）已经开发出来。它是唯一一种具有研究新药（IND）申请许可证的氢氧化铝佐剂疫苗[7]。同时，BioThrax的缺点是需要重复接种疫苗和每年加强注射。因此，其新一代已被临床研究，使用CpG寡脱氧核苷酸（ODNs）佐剂来实现加速的免疫应答，称为NuThrax [8]。CpG ODN是一种Toll样受体（TLR）激动剂，可以提高抗体反应速度，用于抗感染性疾病和癌症[9，10]。CpG ODN可以是有效的疫苗佐剂，并且当用于对抗感染性疾病或癌症的混合物中时，能够加速抗原特异性抗体和自然杀伤T细胞应答[9，11]。因此，这些可以暗示，PA抗原的重要性和寻找最佳佐剂以开发合适的疫苗。B. 炭疽菌包含两个过程：修补抗生素治疗 像强力霉素 和 环丙沙星由聚-D-谷氨酸（PGA）制成的胶囊和生产几个月后，急性炭疽病造成约50%的死亡率。准确地说，死亡率包括脑膜炎炭疽92%，吸入性炭疽45%，皮肤炭疽2%[6]。目前，BioThrax炭疽细菌对Xins [12]。这些毒力因子是编码为pXO 1和pXO 2的染色体外质粒[13]。pXO 1负责结合细胞受体和产生其他相关的催化剂。* 通讯作者。电子邮件地址：kordkid@ihu.ac.ir（E.Kordbacheh）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100574接收日期：2021年3月6日;接收日期：2021年4月5日;接受日期：2021年4月6日2021年4月16日网上发售2352-9148/©2021的 作者。发表通过 Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuA. Shamakhi和E. 科尔德巴切组分i.即保护性抗原（PA）、致死因子（LF）[12]。起初，PA蛋白附着于细胞外部受体，如（21，22）。医学信息学解锁24（2021）100574毛细血管形态发生蛋白-2（CMG 2）或肿瘤内皮标志物8（TEM 8）[14，15]。随后由弗林蛋白酶切割N-末端蛋白残基，剩余的亚组形成同源七聚体并作为LF锌依赖性蛋白酶的易位LF诱导edama和细胞死亡。因此，许多研究都集中在PA和LF抗原上[16，17]。考虑到合适佐剂的重要性，结核杆菌50 S核糖体蛋白（L7/L12）可用于增强候选疫苗的免疫原性如今，生物信息学方法包括在线工具，数据库，以及分子动力学（MD）模拟器，这将减少亚单位疫苗设计的过程。由于优化的亚基组合，表位定位和相关的免疫学分析将导致明智的序列设计。其他计算机工具可以预测已知蛋白质结构的配体和蛋白质之间的构象相互作用。因此，本研究的最终目的是开发一种新的候选免疫原对抗炭疽杆菌病原体。2. 方法2.1. 抗原回收和试剂卡设计序列分析和目标蛋白序列的收集是计算机疫苗设计的起始步骤。从UniProt数据库中收集PA（UniProt条目：P13423）和LF（UniProt条目：P15917）蛋白序列，并以FASTA格式保存。从GenBank中提取相关DNA序列，登录号分别为AAG24446和AAA79216。对序列进行初步分析以进行表位选择。通过考虑b-单元、t-单元和t-单元，选择具有期望特性的重叠序列。细胞、IFN-γ和IL-10表位是非过敏性和非毒性的。&所选表位通过GPGPG接头组合EAAAK刚性接头用于分离不同的结构域并增加构建稳定性。6-将XHis标签添加到C-末端以帮助有效纯化。将结核分枝杆菌50 S核糖体蛋白（UniProt条目：P9 WHE 3）包埋在盒的N-末端作为佐剂。2.2. 表位筛选2.2.1. B和T细胞表位在这个术语中，Bcepred服务器使用默认阈值研究了具有不同长度的线性B细胞表位[18]。该在线服务器提供了七种不同的算法，然而，考虑了疏水性、灵活性、可及性、极性和暴露表面的组合用于连续表位选择。通过CBTOPE研究非线性B细胞表位，CBTOPE可以通过第一蛋白质结构或序列预测构象表位[19]。为了研究T细胞表位能力，已使用IEDB服务器分析重叠残基[20]。鉴定了所选肽的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T淋巴细胞（HTL）表位。因此，分别预测人等位基因的高结合主要组织相容性复合物I类（MHC-I）和MHC-II表位。在选择完整的人白细胞抗原（HLA）后，挑选MHC-I的最佳超型和MHC-II肽的高总评分用于进一步评估。根据IEDB推荐值设定MHC分子的结合亲和力和HTL表位的半最大抑制浓度（IC 50）截止值，字长为16个残基。2.2.2. IFN-γ和IL-10诱导肽研究了所有挑选的肽的干扰素-γ（IFN-γ）和IL-10表位潜力。通过IFN表位和IL4pred服务器预测盒的这些能力2.2.3. 相关抗原特性通过IEDB服务器中基于网络的工具调查筛选表位的世界人口覆盖率。就种内相似性检查给定肽的表位保守性[23]。为了确定每种肽的抗原特性的总体潜力，我们使用具有默认阈值的VaxiJen v2.0在线服务器[24]。 所有的感受态残基和所获得的设计的嵌合体保存在Notepad++文件中。2.2.4. 不良抗原特性采用AllerCatPro v1.7预测选定表位可能的过敏原性（表1）[25]。这种新型服务器预测过敏根据氨基酸序列和3D蛋白质结构，将其与超过4000种独特的过敏蛋白质序列进行比较。AllerCatPro的总体准确性约为85%，而其他常规方法的准确性范围为51%至73%。 通过包含>800至x肽的ToXinPred研究了作为另一种不期望的性质的ToXicity潜力 [26]。2.2.5. 免疫模拟通过C-ImmSim服务器预测嵌合蛋白的计算机免疫应答谱[27]。此外，C-ImmSim表位检测可以分别通过位置特异性评分矩阵（PSSM）和深度学习技术预测免疫相互作用。它基于哺乳动物反应的三个解剖区域模拟免疫反应：骨髓中产生新淋巴和髓样细胞的区域、初始T淋巴细胞学习以避免自身免疫的胸腺和作为三级淋巴器官的淋巴结。根据目的，每隔四周给药三次。根据文献，考虑了时间步长设置为1、84和168（3次给药，间隔4周）的模拟参数。2.3. 氨基酸组成、理化性质和溶解性使用EXPASy服务器的PredictProtein和Protparam工具计算氨基酸组成、分子量、理论等电子点（pI）、不稳定指数、在不同宿主中的半衰期和总平均疏水性（GRAVY）[28，29]。采用Iupred2A服务器来预测暗示盒的蛋白质结合效力的无序区域[30]。Protein-sol server用于分析嵌合 体 在 过 表 达 时 重 组 蛋 白 溶 解 性 的 能 力 [31] 。 PepCalc 服 务 器（https://pepcalc.com/）是另一种验证蛋白质溶解度的软件。2.4. 蛋白质结构预测2.4.1. 蛋白质二级结构表 位 疫 苗 的 第 二 种 结 构 通 过 104 网 络 工 具 和 RaptorX 服 务 器（ http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred ） 进 行 分 析[32，33]。该ESP4利用了一个自我优化的预测方法，称为SOPMA工具。RaptorX是一种无模板方法，并通过使用名为Deep-CNF（卷积神经场）的新兴机器学习模型进行预测。2.4.2. 蛋白质三级结构通过I-TASSER和RaptorX结构预测服务器构建抗肿瘤剂-表位蛋白三级结构[34，35]。 I-TASSER依赖于序列-结构-功能算法作为分层方法。RaptorX利用来自序列比对的超深度卷积残差神经网络。这些服务器在上一次社区CASP实验中排名很高2表1该列表显示了遇到线性和构象B细胞表位、CTL和HTL表位的候选表位，以及它们的细胞因子诱导、世界覆盖率、变应原性和毒性特性。抗原数量蛋白质序列线性非VaxiJen MHC I MHC II worldIFN-γ IL-10变应原性DNA序列线性评分最佳HLA超型/低百分位数秩TPC（%）IL-4到XLF1KEKEKNKDENKRKDEE* - *7.59*–AAAGAGAAAGAAAAATAAAGATGAGAATAAGAGAAAAGATGAAGAA2.34854.753.0*–2EALSEDKKIKDIYGK***A02、A68HLA-DRB1*03：0160.6*––GAAGCATTATCTGAAGATAAGAAAAAAATAAAAGACATTTATGGGAAA0.75575.632.0*–3LNTIKNASDSDGQDLL***A01HLA-DRB1*0440.8–––TTAAATACCATTAAAAATGCATCTGATTCAGATGGACAAGATCTTTTA0.60081.25.9––4EQNSNEVQEVFAKAFA***A68、A26、A35、HLA-DRB1*0729.8**–GAACAAAATAGCAATGAGGTACAAGAAGTATTTGCGAAAGCTTTTGCA0.7029B5813.0*–0.13PA5GPTVPDRDNDGIPDSL**–A68HLA-DQA 1 *03：01，75.76–––GGACCTACGGTTCCAGACCGTGACAATGATGGAATCCCTGATTCATTA0.27034.3DQB 1 *03：02––44.06ENIILSKNEDQSTQNT***A02HLA-DRB1*04，DRB4*0167.73–*–GAGAATATTATTCTCTCAAAAAATGAGGATCAATCCACACAGAATACT0.85201916.0––7GGSVSAGFSNSNSSTV***A68、A02HLA-DRB1*09：01，91.42–––GGTGGGAGTGTATCTGCAGGATTTAGTAATTCGAATTCAAGTACGGTC1.1868.26DQA 1 *05：01，––DQB 1 *03：017.58QVYGNIATINFENGRV–**A23、A24、A68、HLA-DRB3*0276.54**–CAAGTATATGGGAATATAGCAACATACAATTTTGAAAATGGAAGAGTG0.5790A31、A26、A11、12.0*–A35、B15.029IRDKRFHYDRNNIAVG***A30，HLA-DRB1*04，DRB3*02，33.17–*–ATAAGAGATAAACGTTTTCATTATGATAGAAATAACATAGCAGTTGGG0.4033.89DRB 3*01*–0.5510DFKKYNDKLPLYISNP***A30、A23、A24HLA-DRB3*01，DPA1*02，77.05*––GATTTTAAAAAATATAATGATAAATTACCGTTATATATAAGTAATCCC0.7977.06DPB 1*05*–14.011NPSENGDTSTNGIKKI***A68、A11、HLA-DRB1*13：0240.2–––AATCCTAGTGAGAATGGGGATACTAGTACCAACGGGATCAAGAAAATT1.38470.4139.0*–A. Shamakhi和E. 科尔德巴切医学信息学解锁24（2021）1005743A. Shamakhi和E. 科尔德巴切医学信息学解锁24（2021）1005744+2.4.3. 三级结构精修使用UCSF Chimera v1.15查看嵌合体的最佳预测模型，然后评估拓扑错误[36]。之后，使用3Drefine和GalaxyWEB服务器来优化获得的最佳模型[37，38]。这些服务器的细化方法已在盲CASP 13 - 14实验中成功测试。i3Drefine细化算法执行几个步骤的迭代实现：原子级能量最小化加上氢键网络的优化，即所谓的MESHI力场。此外，GalaxyRefine服务器可以通过侧链重新包装和后续应用MD模拟方法来改善局部和全局结构的质量。2.4.4. 三级结构验证为 了 评 估 原 始 模 型 的 结 构 质 量 和 房 室 的 改 善 ， 应 用 了Ramachandran图、ProSA和SAVESv6.0（https://saves.mbi.ucla.edu）服务器[39，40]。ProSA服务器可以计算蛋白质与预先结构化的天然蛋白质相比的偏差，该偏差具有称为z分数的指数SAVES v6.0服务器使用不同的工具，如ERRAT，VERIFY3D，PROVE和PROTEGO来分析蛋白质结构质量。的拉氏工具计算氨基酸残基的允许二面角（θ和θ）取决于侧链半径的范德华力。2.5. 分子对接分子对接是现代药物设计方法中最有前途的领域之一。因此，首先制备用于对接的蛋白质，并通过CASTp服务器预测空腔或表面可接近的结合口袋，并通过UCSF Chimera v.1.11.2软件进行检查。根据我们的假设，由于该盒包括PA和LF表位，首先炭疽受体（登录号：1SHT）被认为是PA抗原的受体。然后，将PA抗原的剩余部分（登录号n. 1ACC）（所谓的PA63）被认为是LF（Accessions n. 1JKY）受体，因为它在氧化功能中起LF受体的作用。有关服务人员重复了炭疽菌蛋白质与X受体的连接研究。在本研究中，我们使用了HPLCPro v2.0和HADDOCK服务器来模拟受体-配体对接[41，42]。RISTOPro使每个配体和受体蛋白质相互旋转70，000次。该程序利用FFT（快速傅立叶变换）方法PIPER进行刚性对接。随后，服务器基于SDU（基于半定规划的低估）算法和Monte-Carlo模拟细化对具有低能量和稳定簇大小的可能对接结构进行评分。关于灵活的对接方法，采用HADDOCK（High Ambiguity Driven protein-protein Docking）2.4服务器。HADDOCK使用了一组python脚本，NMR和晶体学数据加上从头计算对接，是 的 。 该 服 务 器 基 于 OPLS （ Optimized Potentials for LiquidSimulations）力场进行建模，分为三个阶段：刚体能量最小化、半柔性精化和最终结构精化。将最佳对接模型提交至PRODIGY服务器以获得自由能（ΔG）和解离常数（Kd）数据，并在pyMOL v.2.3软件上可视化模型[43]。2.6. 电子克隆显然，不适应的序列密码子可能导致外部基因在宿主中的有效表达。因此，由于炭疽芽孢杆菌和大肠杆菌的密码子之间的差异，并且为了工程化多表位构建的正确翻译，采用Java密码子适配工具（JCat）web工具。在这里，我们希望E. coli菌株K12作为宿主，pET 28a作为表达载体[44]。选择其他选项来优化原核生物核糖体结合位点和限制性内切酶切割位点。ApE v2.0.61是进行序列操作和计算机克隆（https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/）。在这个术语中，RNAfold服务器检查了信使RNA拓扑结构和相关的热力学性质[45]。将构造模型导入到E.colipET28a （ ） 载 体 通 过 使 用 SnapGene 工 具（https://snapgene.com/）开发。3. 结果3.1. 一种顺序编排在文献筛选之后，提示PA和LF抗原在亚单位候选免疫原开发中最受关注。获得了这些蛋白的功能序列通过选择PA-63（197残基），忽略信号肽的裂解。研究蛋白质的剩余序列的线性和非线性B细胞表位。免疫佐剂是增强亚单位疫苗效力的重要要求;因此，结核分枝杆菌的50 S核糖体蛋白L7/L12（RL7_MYCTU）触发Th 2介导的免疫应答。将诱导的免疫应答包埋在N-末端作为佐剂，这在图1中示出，为了清楚起见，最终表位支架被分选为具有适当接头的N′- L7/L12 -LF表位-PA表位-Histag-C′3.2. 表位预测在初步表中总共选择了32个表位，包括13个线性和19个非线性B细胞表位。最后，在交叉匹配表位区域后，我们收集了11个含有所需特性的B细胞16聚体表位。所有11个表位对于线性和非线性B细胞表位都是共同的，除了其中的两个它们被预测是高度免疫原性的，非自身的，以激发B和T细胞表位。通过VaxiJen v2.0预测每个表位的抗原特性，除了构建总体抗原性评分，其测量为0.852（可能抗原）。Bcepred和CBTOPE预测了具有不同残基长度的连续和不连续的B细胞表位，知道构象类型更重要，并且与表位之间存在密切关系。至总B细胞表位的90%。对于LF抗原，最佳B细胞共同表位为““EQNSNEVQEVFAKAFA”;选择线性表位是因为其高Vaxijen评分。 在这方面，对于PA抗原“GPTVPDRDNDGIPDSL”、“ENIILSKNEDQSTQNT”、“GGSVSAGFSNSNSSTV” 、 “IRDKRFHYDRNNIAVG” 、 “DFKKYNDKL-PLYISNP”， “NPSENGDTSTNGIKKI“是 选择， 加上TYNFENGRV 所有选定同时检测序列是否为B细胞和T细胞表位。采用IEDB服务器的MHC-I和MHC-II结合预测工具来研究T细胞表位;这些工具依赖于稳定的基质。我们挑选出MHC-I等位基因， 最好亲和力（IC50）截止的 1000nM）。表位“KEKEKNKDENKRKDEE”A*30：01和MHC II类等位基因HLA-DRB 5 *01：01在最佳等级中。其余的是相同的，可以与表1中列出的不同MHC类别和等位基因相互作用所提及的表位中的每一个通过GPGPG接头连接在此外，IEDB服务器显示所有表位都是保守的，并且具有30%至90%的世界TPC超过半数表位对IFN-γ、IL-4和IL-10诱导从INFepitope和Raghava服务器获得的容量分别使用AllerCatPro和ToX-INPRED工具验证不存在过敏原和ToX-IC3.3. 免疫反应模拟计算机模拟免疫反应由C-ImmSim服务器预测，并在图1中描绘。二、这些图暗示了抗原识别，A. Shamakhi和E. 科尔德巴切医学信息学解锁24（2021）1005745-±±-Fig. 1. 最终构建体的示意图。表位支架的382个氨基酸在氨基末端含有L7/L12佐剂，在碳末端含有聚组氨酸标签。表位通过GPGPG接头彼此连接，并通过EAAAK接头与序列的边缘分开。亚单位蛋白和适当的反应，在抗体上升，B和T记忆细胞的生产后，假设的免疫。初始反应的特征是IgM升高，在第三次给药时观察到IgG和IgM免疫球蛋白的增强。在第三次假设给药中观察到同种型转换效力和记忆细胞形成。同样，在细胞毒性和辅助性T细胞群体中看到了适当的反应，并具有相对的记忆发育，知道这是补充免疫力所必需的。在暴露过程中，近似的树突状细胞活性是一致的，而巨噬细胞活性的增加被发现像IFN-γ和IL-2。此外，辛普森指数（多样性的衡量标准）表明低比率意味着更大的多样性。3.4. 一次序列性质用ProtParam软件对嵌合蛋白的理化性质进行了预测。382个氨基酸的分子量（MW）估计为39.44 kDa，加上预测的等电点值5.14，发现相应地为微酸性此外，通过ProtParam预测其是稳定的（不稳定指数为22.88）、亲水的（GRAVY指数为0.66）、热稳定的（脂肪族指数为67.4），并且通过溶胶-凝胶法预测其是稳定的。uble与Protein-sol服务器指数为0.77，（>0.45）。 还有半衰期在E. 杆菌 如果在细菌中表达，则通过PredictProtein服务器预测不存在二硫桥和蛋白质的细胞外定位。3.5. 更完整的蛋白质最终的工程化肽通过EST 4工具估计包含38.5%的α-螺旋、12.8%的延伸链和43.2%的无规卷曲（图3A）。此外，关于氨基酸溶剂的可及性，67%被分析为暴露，15%被掩埋，16%被介质暴露。此外，RaptorX Property服务器通过同源性建模预测41%的残基（159个氨基酸）可以位于无序结构域中。通过I-TASSER和RaptorX服务器构建了亚基蛋白的第三结构（图11）。 3 B）。I-TASSER提供了10种具有最佳C评分（2.31）和计算RMSD的蛋白质TM评分为16.3 ± 3.1A和0.58 ± 0.15。RaptorX的最佳预测PDB文件最初估计的RMSD为9.3154A。进一步完善了I-10的原始模型TASSER和RaptorX服务器由GalaxyRefine服务器完成，如表2所示。使用GalaxyRefine服务器优化后的最佳模型在结构验证服务器中具有更好的索引。RaptorX模型蛋白的Ramachandran图表明，97.3%的蛋白质在蛋白质组中表达。图二. 假设疫苗接种分三次注射进行，间隔四周。C-ImmSim免疫应答模拟服务器预测注射后的细胞因子（A）和免疫球蛋白（B）水平A. Shamakhi和E. 科尔德巴切医学信息学解锁24（2021）1005746-----图三. 二级结构的图示和评估（A）。卡通二级结构显示-螺旋X（38.5%）、-链（12.8%）和-卷曲（43.2%），和67%暴露。关于三级结构，RaptorX预测缺乏UCSF嵌合体（B）所示的主要埋葬结构域（15%）表2RaptorX和I-TASSER生产和精制蛋白质模型的不同机密参数的研究型号名称拉玛钱德朗赞成RMSD错误Procheck G因子Verify3D摩尔普罗比蒂RaptorX模型I-TA SSER模型97.3394.33.500.547百分之八十点五四百分之八十七点六-0.72-1.02783.77%43.19%2.732.12的残基在高度优选的区域中，2%在优选的区域中，并且0.7%在不允许的区域中（图4A）。最终模型的ProSA Z评分为6.46（图4B）。此外，通过SAVES v6.0和ProSA网络工具验证了改进模型中的潜在误差（表2）。3.6. 分子对接最初，最好的晶体结构具有最低的蛋白质分辨率，即，通过去除H2O、杂原子、无关残基和添加极性氢，挑选炭疽受体、PA和LF蛋白并准备用于对接。除了之前的那些，PA 63蛋白的结构估计通过删除196个氨基酸的N-末端的帮助PyMOL软件;因此，其结合和疏水相互作用位点重新考虑CASTp。在蛋白质表面的不同位置发现了一些结合口袋，由表面积1178.09埃·立方厘米，表体积1339.08埃·立方厘米，PA的A_1 ~3分别为29.43A_2和14.56A_3。刚性对接和柔性对接分别在HADDOCK和ESPRIO Pro服务器上进行了仿真。P2P Pro服务器为每个PA63生成了30个模型和炭疽受体（SHT.pdb）与嵌合体，并将它们排列为簇大小代表对于第一个假设，10个姿势在100-34个成员大小和-695.4到-578.0结合分数的最高分数中。对于第二，前十名得分与100-34成员的大小和871.1 到660.9 结合 评分 （图 5 A）。 关于灵活对接首先，检查工程蛋白的PA部分与炭疽受体的连接。它将80个结构聚类为14个簇其中最佳反应体系的ΔG为10.8（kcalmol-1），Kd为1.2E-8，25℃; HADDOCK评分、RMSD和团簇的范德华能量如图5 B所示。将工程蛋白LF部分与PA63进行对接 同样。 的 服务器集群334 建筑39其中最好的一个具有ΔG为18.4（kcal mol-1），Kd为3.2E-25摄氏度时14个。3.7. 电子克隆密码子适应指数加GC含量的值记为0.94优化后的密码子分别为51.22。这些结果表明，CAI接近1，GC%在所需的范围内。见图4。当Ramachandran图查看残基的误差值时，总体上99.3%的氨基酸在有利区域（A）中。ProSA服务器的Z-评分图将表位蛋白与预定的X-射线和NMR结构进行A. Shamakhi和E. 科尔德巴切医学信息学解锁24（2021）1005747比较并确认（B）。A. Shamakhi和E. 科尔德巴切医学信息学解锁24（2021）1005748图五. 疫苗与炭疽受体的刚性分子对接（A），疫苗与PA63蛋白的刚性连接（B）。疫苗与炭疽受体最佳簇之间以及疫苗-PA 63之间的柔性对接的HADDOCK评分、RMSD30- 70%因此，预期疫苗在BL 21细胞中的有效表达。随后，将适应的密码子序列嵌入pET 28 a中用于表达，并将克隆模型构建成pET28 a。由SnapGene绘制（图6A）。对于转录评估，在序列优化后，未观察到5′处的不适当假结和具有-430.36 kcal/mol的适当自由能（图） 6 B）。4. 讨论疫苗是提高宿主免疫力最有希望的手段。因此，它在公共卫生，畜牧业和食品生产中至关重要。与疾病相关，与治疗费用相比，疫苗接种也更具成本效益[46，47]。疫苗的开发是劳动密集型的，然而随着免疫信息学和分子生物学领域的进步，新一代基于表位的疫苗受到了广泛关注[48]。由于直接靶向免疫系统，这些类型的重组疫苗提供有效和快速的应答[49，50]。如今，通过计算机工具收集表位信息是高度准确和简单的[51]。以前，预测了炭疽芽孢杆菌的免疫显性表位，并开发了一些由它们组成的支架[2]。为此，采用了各种生物信息学工具和服务器挑选出潜在的B和T细胞表位，IFN-γ，IL-10和IL-4表位，表位，随后导致表位疫苗的构建IFN-γ可刺激M1型巨噬细胞并导致II类MHC水平升高，随后诱导IL-12分泌，从而将Th分为Th 1亚型[52]。安全性是疫苗的先决条件见图6。将表位蛋白克隆到pET-28 a（+）载体（6371 bp）中，并分别绘制其转录mRNA的二级结构和蛋白质的三级结构。A. Shamakhi和E. 科尔德巴切医学信息学解锁24（2021）1005749因此，对工程疫苗进行了变应原性和致敏性分析[53]。根据To x-inPred和AllerCatPro中的评估，发现亚基蛋白由抗原性、非致敏性和非过敏性的B和T细胞表位组成。AllerCatPro具有高灵敏度，特异性增加37倍[25]。将先前报道的EAAAK和GPGPG接头嵌入序列中以产生具有最小化的连接免疫原性的构建体。由于先前报道，EAAAK刚性接头适用于双功能蛋白质，我们将其添加在融合表位和佐剂之间，以及表位和His标签序列之间[54]。使用柔性甘氨酸-脯氨酸接头GPGPG共同连接的表位证明在体内呈现足够的表位[55]。L7/L12连接的佐剂有利于细胞介导的免疫系统，并且可以增加表位的动机[56，57]。我们的嵌合蛋白的分子量为39.44 kDa，其不稳定性和溶解性指数研究表明，该蛋白在E. 杆菌此外，理论pI表明，蛋白质在pH范围为5.14. 因为治疗性蛋白质因此，有趣的是，我们的蛋白质在哺乳动物网织红细胞、酵母和大肠杆菌中具有适当的半衰期。coli细胞[58]。高水平的无规卷曲（43.2%）和延伸链（12.8%）结构暴露在蛋白质表面，为免疫系统提供表位残基。了解不同的二级和三级结构对于蛋白质疫苗设计是必要的。对蛋白质的第三结构进行建模、精炼，并进行验证。原始模型的细化通过参数评分的 改 善 来 证 实 。 例 如 ， VERIFY 3D 、 ERRAT 、 WHATOWN 和PROPERTOLOGICAL评分在粗模型细化后有所改善。ProSA服务器的Z-score及其图表将蛋白质模型与预先确定的X射线和NMR以及晶体学结构进行了比对，并证实了这一点。炭疽对X受体蛋白的选择来自PDB格式的RCSB数据库。PA 63蛋白是通过删除PA蛋白的前196个残基获得的，因为剩余的部分充当LF受体。对于蛋白质-蛋白质对接，考虑了刚性和柔性概率。它证明了这种表位蛋白具有成功的计算机定位，并且嵌合支架对这些连接没有任何拮抗作用因此，表位蛋白可以完美地占据炭疽受体，而且它的另一边可以与PA63蛋白以最小能量相互作用。计算机免疫模拟显示，三次给药后免疫球蛋白和体液反应均升高，因此预测与典型的免疫系统反应有关。这意味着B细胞和T细胞记忆的形成持续了几个月。在炭疽病中，对细菌抗原的IgG1和IgG2应答涉及身体保护[12]。IFN、IL-10和IL-4的水平在第一次注射后升高，并在每次加强后保持在峰值水平，因此，其对应于初级表位选择结果。观察到辛普森指数D随时间的变化，并表明鉴于工程化蛋白质包含几个B和T细胞表位，免疫应答的多样性可能性[59]。本研究建立了B.炭疽病需要几个剂量和每年一次的加强剂来提供保护。上另一方面，疫苗的组合物含有许多抗原，批次制备之间的相似性。一些研究声称，这些蛋白质中的一些蛋白质的身份尚未确定[60]。然而，有证据表明，接种疫苗的兔子仍然可以感染B。炭疽[6]。这些观点强调了新一代疫苗的必要性，这些疫苗精确地靶向致病机制，并赋予对抗复制杆菌的可靠免疫力。最近的研究已经证明来自PA抗原的表位疫苗具有诱导中和抗体的潜力[61，62]。为此，S。Aggarwal等人开发了包含PA和LFn的免疫显性表位的构建体[63]。同样的问题，M。Tahmocampur等人进行了计算机模拟研究，以设计多抗原结构疫苗[64]。由于Th2应答似乎对炭疽的适当保护是值得注意的，因此我们考虑了用于表位选择的t细胞表位[63]。然而，实验确认是必要的，以验证免疫原性效力和安全性的表位疫苗在未来。因此，该亚单位蛋白可以被认为是用于开发表位疫苗的候选免疫原。竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认作者要感谢伊玛目侯赛因综合大学的支持，以完成这项研究。引用[1] Moayeri M，Leppla SH，Vrentas C，Pomerantsev AP，Liu SJArom.炭疽病的发病机理。Annu Rev Microbiol2015;69：185-208.[2] KumarV，Waheed SM，Pant.流行病和感染、疫苗开发和进化。 Int J Cur Res Rev 2020;12：87。[3] Rossi CA，Ulrich M，Norris S，Reed DS，Pitt LM，Leffel等人，吸入性炭疽非洲绿猴模型中感染的替代标记物的鉴定。感染免疫2008;76：5790-801.[4] Abbara A，Brooks T，Taylor GP，Nolan M，Donaldson H，Manikon M，et al.2009-2010爆发案例研究中欧洲海洛因相关炭疽控制的 经 验 教 训 ， 伦 敦 ， 英国。 急诊感染疾病2014;20：1115。[5] 我是弗里德兰德炭疽病：临床特征、致病机制及潜在的生物战威胁。 临床感染疾病2000;20：335-49.[6] JelinskiJ，Terwilliger A，Green S，Maresso A，豁免权。炭疽病II NEAT疫苗开发的进展：吸入模型中免疫原特异性和明矾有效性。88.第八十八章：一个女人[7] 李文，李文.氢氧化铝佐剂和甲醛在rPA炭疽疫苗配方中的作用。疫苗2007;25：2771[8] 杨文辉，王文辉，王文辉. 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