埃及西奈半岛Ras Mohamed海洋高地芽孢杆菌多糖生物学特性研究

··埃及基础与应用科学杂志5（2018）204完整文章埃及西奈半岛Ras Mohamed海洋高地芽孢杆菌萨哈尔湾穆罕默德·沙伊马·K.Amerb，Manal S.Selima，Hala M.里法特ca埃及开罗国家研究中心遗传工程和生物技术研究处微生物生物技术部b埃及开罗艾因夏姆斯大学理学院微生物学系c埃及开罗国家研究中心遗传工程和生物技术研究处微生物化学系。阿提奇莱因福奥文章历史记录：2018年3月1日收到收到修订版，2018年5月16日接受，2018年在线提供2018年关键词：海洋胞外多糖海洋芽孢杆菌A B S T R A C T本研究的目的是调查胞外多糖（EPS）的生产在29个细菌菌株分离的红树林周围的沉积物在Ras穆罕默德地区，红海海岸，西奈半岛，埃及。其中两个菌株能够产生EPS。从12号分离物获得较高的EPS产量。菌株鉴定结果与Bacillus altitudinis高度相似。 所产生的EPS被表征为含有甘露糖醛酸、葡萄糖和硫酸盐的杂多糖。使用凝胶渗透色谱法来估计EPS分子量，发现其为4.23×105道尔顿。多糖吸收的典型模式得到红外光谱的支持。EPS对两种肿瘤细胞EACC和肺癌A-549具有明显的体外抗肿瘤活性。此外，广泛的细菌和真菌被纯化的EPS抑制。©2018 曼 苏 拉 大 学 。 由 爱 思 唯 尔 公 司 制 作 和 主 持 这 是 一 篇 基 于 CC BY-NC-ND 许 可 证 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍胞外多糖（EPS）是由不同微生物（包括细菌、真菌和蓝绿藻）产生的长链高分子量聚合物[1]。由细菌产生的EPS具有结构多样性和新颖的生物学特性，被认为是具有多种生物技术应用的天然高分子的宝贵来源。微生物EPS在极端的海洋环境中普遍存在，它们是微生物生存所必需的。大多数归因于EPS的功能具有保护性质，它们的确切作用取决于微生物生活的生态功能。它们可以支持微生物群落承受极端的温度、盐度和营养可及性，在细菌细胞与其所处环境之间构建一个边界。海洋环境中的细菌在渗透胁迫下产生具有独特组成的EPS，研究其在各个部门的应用前景[2]和发现新的大分子[3]。最近，产生EPS的微生物的抗氧化、免疫调节、抗肿瘤和抗微生物特性的证据增加[4，5]。临床使用的抗肿瘤药物的严重副作用将注意力转向研究具有更高活性的新型药物。*通讯作者。电子邮件地址：manalsleem@yahoo.com（M.S. Selim）。影响力和影响力更小[6]。人类病原体也具有由商业抗微生物药物的不正常使用形成的耐药性。这种耐药性和某些抗生素的不良副作用促使科学家从许多来源寻找新的抗微生物取代物[7]。本研究的目的是从红海沿岸Ras Mohamed地区红树林周围的海洋沉积物中分离和鉴定产EPS的细菌。本文还研究了纯化的EPS对艾氏腹水癌和肺癌细胞株的体外抗肿瘤活性以及对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和真菌2. 材料和方法2.1. 细菌的分离和EPS的产生从埃及西奈半岛Ras Mohamed的红树林（白骨壤）根际采集海洋沉积物将样品在90 ml无菌水中连续稀释，并铺在含有（g/l）[葡萄糖（20）;酵母提取物（0.1）; NH4NO3（0.8）; CaCO3（1）;K2HPO4（0.6）; KH2 PO4（0.5）;MgSO4 7H2 O（0.05）、MnSO4 4H2 O（0.1）和琼脂（15）]，溶于750 ml海水和250 ml蒸馏水[8]。根据菌落表型（光滑和粘液）选择产生EPS的https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2018.05.0092314- 808 X/©2018曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbasS.S. Mohamed et al./Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）204-209205××××-×然后将纯菌株接种到含有50 ml先前培养基的250 ml锥形瓶中，并在37℃下在旋转振荡器中以120 rpm孵育以5000 rpm离心15 min后，将上清液与四倍体积的冷冻乙醇混合，同时将收集的沉淀物用丙酮和乙醚洗涤两次[5]，然后在50 ℃下干燥以获得恒重。通过苯酚-硫酸法估计EPS形成[9]。2.2. 鉴定菌株根据其形态学、生理和生化特征（如硝酸盐还原、过氧化氢酶、氧化酶、Voges-Proskauer试验、葡萄糖产酸[10]和16 S rRNA序列）鉴定具有最高EPS产量的菌株。使用Weisburg等人描述的通用引物扩增16S rRNA基因并测序[11]第10段。使用BLAST将序列与GenBank数据库进行比较[12]。2.3. EPS的提取和纯化将选择的菌株在含有（g/l）[蛋白胨（4.0）、酵母提取物（2.0）和蔗糖（20.0）]的发酵培养基中生长三天，所述发酵培养基溶解在750ml海水和250 ml蒸馏水（pH 7-7.5）中，在37 ℃下，在振荡培养箱中以120 rpm的转速生产EPS[13]。为了沉淀蛋白质，将5%三氯乙酸加入到无细胞培养物上清液中，并在4 °C下孵育24小时。以5000 rpm离心后，15分钟后，将上清液pH调节至7，并使用透析管（MWCO2000）对蒸馏水进行透析。透析后，向上清液中加入无水乙醇并在4 °C下孵育24小时。将沉淀的EPS溶解，用去离子水透析并使用0.45 mm过滤器过滤，然后施加到DEAE-纤维素柱（1.5 cm × 70 cm）上。使用连续梯度NaCl溶液（0.2-3.0 M）进行洗脱。随后，使用Sephadex G-200柱（2 cm × 80 cm）对收集的级分进行进一步纯化步骤，该柱用0.1 MNaCl以0.5 ml/min的流速洗脱。将具有EPS的级分收集在一个级分中，透析并冻干用于进一步分析。2.4. EPS的化学分析分别根据许多作者[10，14使用高效液相色谱法（HPLC）分析单糖含量，使用Shimadzu Shim-Pack SCR-101 N柱（7.9 mm 30cm）和去离子水作为流动相，流速0.5 ml/min，采用酸水解技术[17]。2.5. 分子量估算通过凝胶渗透色谱法（GPC）在Sephadex G-200柱（80 cm）上估计EPS的分子量2厘米）。使用标准葡聚糖（40，000; 500，000和2，000，000）道尔顿进行校准，并通过绘制标准图来测定分子量[18]。2.6. 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）将干燥的EPS与KBr粉末混合，研磨并压制成1 mm的粒料，用于使用Bruker scientific FT-500-IR光谱仪在400-2.7. 高碘酸氧化和Smith降解高碘酸盐氧化和Smith降解通过将酯化EPS（16 mg）溶解在蒸馏水（6 ml）中，然后加入到保持在4 °C黑暗中的圆底烧瓶中的0.1 MNaIO4（50 ml）中来测定[20]。每24小时取等分试样（0.1 ml），用蒸馏水（25 ml）稀释，在分光光度计中在223 nm处读数。根据吸光度变化计算高碘酸盐消耗量[21]，并通过苯酚-硫酸法监测甲酸产物[9]。加入乙二醇（2ml），将溶液用蒸馏水透析48小时。之后，加入NaBH4（100 mg）并将混合物在室温下放置24小时，然后加入冰冷的乙酸（4N）以终止反应。如上所述再次透析溶液并冻干[22]。将所得多元醇用90% HCOOH水解5小时，并通过HPLC分析所产生的糖和2.8. EPS的生物活性2.8.1. EPS对DPPH自由基根据Yang等人[23]描述的方法，使用1，1-二苯基-2-苦基-肼（DPPH）评估EPS的自由基清除活性。将5 ml DPPH的乙醇溶液加入到1 ml浓度为（50-300 mg/ml）的纯化EPS中将混合物在黑暗中 孵 育 30 分 钟 ， 并 使 用 分 光 光 度 计 UV-Visible 2401 PC（Shimadzu，Japan）在517 nm处测量DPPH吸光度下降，清除自由基能力强。自由基清除能力基于以下等式计算：清除能力（%）= [（对照-样品A517）/对照A517]× 100。EC50值被认为是DPPH吸光度降低50%时EPS的有效浓度（mg）。2.8.2. 对艾氏腹水癌细胞（EACC）的抗肿瘤活性如Yang等人[23]所述，采用改良的细胞毒性台盼蓝排除技术测量肿瘤细胞活力。肿瘤细胞增殖抑制基于以下等式计算：[（A B/A）]100%，其中A和B分别是对照和样品的活肿瘤细胞2.8.3. 对肺癌细胞系A-549的使用MTT细胞活力测定法测定纯化EPS对A-549细胞系的细胞毒性[24]。使用公式（处理细胞吸光度/对照细胞吸光度×100）计算相对活力百分比以BJ-1正常人细胞株为对照，计算半数抑制浓度IC502.8.4. 抗微生物活性测试了纯化的EPS针对广泛的微生物的抗微生物潜力，所述微生物包括：（i）革兰氏阳性细菌（枯草芽孢杆菌NRRL B-941和金黄色葡萄球菌NRRL B-767），（ii）革兰氏阴性细菌（铜绿假单胞NRRL B-23和大肠杆菌NRR-B 210），（iii）酵母菌（酿酒酵母Y-2034和白色念珠菌NRRL Y-477），和（iv）革兰氏阴性细菌（铜绿假单胞菌NRRL B-23和大肠杆菌NRR-B 210）。(iv)真菌（尼日尔NRRL-3和尖孢镰刀NRRL 26406）。测定了不同浓度EPS（75、100、150和200μ g/盘）使用作为抗菌剂（200μ g/片）的利马坦和作为抗真菌剂（200μg/片）的氟克醛作为对照[25]。206S.S. Mohamed等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）204-209×3. 结果和讨论3.1. 胞外多糖产生菌的分离、筛选和鉴定许多海洋细菌产生EPS用于其生长，以粘附在固体表面并克服极端条件。从埃及西奈半岛红海Ras Mohamed地区红树林根际沉积物中分离到29株细菌。其中两个有能力生产EPS。在12号菌株中检测到最高的EPS产量（10.33 g/l）。刘等人[26]在一项研究中报道，19种细菌菌株产生2.28-9.02 g/l的EPS12号菌株的菌落在固体培养基上显示粘液样外观。相差显微镜下观察，细胞呈革兰氏阳性，杆状，有运动能力，有孢子形成。硝酸盐还原试验、Voges-Proskauer试验、葡萄糖产酸试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验均为阳性，葡萄糖产气试验均为阴性。特别是，部分测序的16S rRNA基因显示与Bacillus altitudinis的相似性为99%，因此菌株No. 12 被 鉴 定 为 Bacillus altitudinis MSH2014 ， 登 录 号 为（KY550404）（图12）。①的人。3.2. EPS的特性3.2.1. EPS的纯化利用DEAE-纤维素阴离子交换层析柱对从Bacillus altitudinisMSH2014产生的粗EPS进行纯化（图2）。洗脱曲线显示一个主峰（级分100-120）。收集该组分，透析并冻干以获得EPS，其用于进一步分析。3.2.2. EPS的分子量测定通过凝胶过滤技术测定的由Bacillus altitudinisMSH 2014产生的EPS的分子量为4.23 × 10 -5Da。EPS呈现为单个对称窄峰（图3），这代表EPS的均一性。先前报道的地衣芽孢杆菌产生的EPS的分子量为2.826×104 Da[26]。3.2.3. EPS的化学成分纯化的EPS通过Bradford试验产生阴性反应，通过HPLC分析单糖组成，表明EPS由甘露糖醛酸和葡萄糖组成，摩尔比为1：2.2。EPS的化学组成表明存在糖醛酸（14.26%）和硫酸盐（15.47%）。图1.一、16S rRNA部分序列与GenBank数据库中的密切相关序列的系统发育树1.41.20.41.00.80.60.30.20.40.20.10.0 0.00 20 40 60 80 100 120 140 160 180馏分数量图二、来自Bacillus altitudinisMSH2014的EPS的 DEAE纤维素柱洗脱图490nm处的氯化钠S.S. Mohamed et al./Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）204-2092071.41.21.00.80.60.40.20.00 20 40 60 80 100 120 140 160 180管号图三. 来自Bacillus altitudinis MSH2014的EPS的凝胶过滤色谱。发现从深海分离的产生EPS的细菌由于含有10-高碘酸盐氧化过程。但是，每摩尔脱水糖，酯化的胞外多糖消耗高碘酸盐（0.942摩尔）产生甲酸（0.000801摩尔）。的HPLC分析钒酸盐或无机残留物，如PO-4或SO-3存在[28]。来自芽孢杆菌的EPS altitudinis MSH2014显示了甘油，甘油，根据文献，SO-3基团的存在增强了EPS的医疗潜力[29]。糖组成在生物活性中具有重要作用[30]。来自Bacillus altitudinisMSH 2014的EPS的FT-IR光谱显示了多糖吸光度的典型模式（图4）。在3435.6 cm-1处的宽带是由于碳水化合物残基的AOH基团的伸缩振动[31]。2360.0cm-1谱带是由CA H伸缩振动引起的。在1630 cm-1处的弱吸收峰是由于C@ O的伸缩振动，其可能与甘露糖醛酸和内部氢键有关[32]。1340 cm-1处的谱带是由于S@ O和/或CA OA S键的存在[33]，863 cm-1处的谱带表明EPS中同时存在的α3.3. 高碘酸氧化和Smith降解对硫酸化和去硫酸化的EPS进行高碘酸盐氧化，其中在硫酸化的EPS的情况下，由于存在和赤藓酸存在（表1）。少量甘油和大量游离甘油的存在部分证明了（1？4）单糖单元与EPS中C2和/或C3上的硫酸酯基团之间的连接。赤藓糖醇是由（1？4）主链水解后葡萄糖的糖苷键，而（1？4）甘露糖醛酸的糖苷键。在多糖的水解中存在相对少量的来自葡萄糖单元的甘油和来自甘露糖醛酸单元的赤藓酸，给出了在非还原端可以发现葡萄糖的信息。这些结果与其他工作者提到的结果非常一致[34，35]。表1Smith降解由Bacillus altitudinis MSH2014产生的EPS的HPLC结果糖醇赤藓糖醇甘油赤藓酸3.3 0.4 0.9在碳原子2或3上的硫酸酯基团，其阻碍见图4。 来自Bacillus altitudinis MSH 2014的EPS的FT-IR光谱。490 nm208S.S. Mohamed等人 /埃及基础与应用科学杂 志 5（2018）204-209100.0080.0060.0040.0020.000.00电话：+86-510 - 8888888传真：+86-510-8888888EPS浓度（μg/ml）3.4. Bacillus altitudinis MSH2014胞外多糖生物活性研究3.4.1. EPS清除自由基活性用DPPH估计自由基清除活性[36]。EPS的清除活性如图所示。 5呈浓度依赖性，EC 50为150（mg/ml）。据报道，EPS从凝结芽孢杆菌RK-02中分离，并通过尺寸排阻色谱法纯化，其显示出体内抗氧化活性[37]。Agili和Mohamed[38]还提到，Padina pavonica的EPS具有抗氧化活性。多糖的抗氧化特性主要与其确认、结构、分子量及其单糖组分相关[39]。图五. Bacillus altitudinisMSH2014胞外多糖的自由基清除作用50454035302520151050 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600EPS浓度（μg/ml）图第六章 EACC细胞对来自Bacillus altitudinis MSH2014的EPS的活力。1008060402000 20 40 60 80 100EPS浓度μg/ml见图7。从Bacillus altitudinis MSH2014纯化的EPS对肺癌的抗肿瘤活性。3.4.2. 抗肿瘤活性3.4.2.1. 对艾氏腹水癌细胞（EACC）的抗肿瘤活性。如图6所示，EPS以浓度依赖性方式对EACC与纯化EPS孵育后，肿瘤细胞的存活率从47%急剧下降至20%，然后通过将EPS浓度分别从100 mg/ml增加至500 mg/ml直至1500 mg/ml，逐渐进一步下降至10%，这与Ahmed和Ahmed[40]获得的结果一致。3.4.2.2. 对肺癌细胞的体外抗肿瘤活性。用不同浓度（12.5、25、50和100 μ g/ml）的纯化EPS处理肺癌细胞系A-549，并显示在图1中。第七章数据显示在高浓度EPS的情况下肿瘤细胞活力逐渐降低。EPS 浓 度 为 12.5mg/ml 时 细 胞 存 活 率 最 高 （ 71% ） ， 25mg/ml 、50mg/ml、100mg/ml时分别降至63%、51%和39%，IC50分别为1.5%、1.5%和2.5%。51.94mg/ml。而在正常细胞系的情况下，不同浓度处理后，分别达到95%、90%、88%和77EPS浓度分别为12.5、25、50和100mg/mlEPS抗肿瘤活性的差异可能是由于其不同的物理化学性质，如链形状、分子量和单糖组成[41]。EPS分子量可能影响其生物活性，因为高分子量显示出更强的抗肿瘤活性[42]。3.4.3. 抗菌活性抗微生物活性（表2）表明纯化的EPS具有针对所有测试微生物的抗微生物活性，并且通过增加EPS的浓度，抑制区增加，其范围为6.3至24.9 mm。[43]分离了两种产EPS的海洋细菌，并筛选了它们对革兰氏阳性细菌（Lysinibacillus和Paenibacillussp.）和革兰氏阴性细菌（假单胞菌属，大肠杆菌）显示存在抑制区。不同的研究者研究了纯化的EPS的抗微生物活性的机制，并且他们提到，表2不同浓度的来自Bacillus altitudinis MSH2014的EPS对微生物生长的抑制区域。EPS浓度（mg/盘）革兰氏+ve菌革兰氏-ve菌酵母菌真菌B. 枯草街金黄色葡萄球菌E. 杆菌 P. 铜绿假单胞菌酿酒酵母白色念珠菌A. 尼日尔湾尖孢抑菌圈（mm）7511.212.212.97.710.27.715.26.310013.115.117.710.612.29.516.77.115015.717.319.813.414.713.718.78.320017.818.824.915.617.617.320.010.5利玛克坦16.716.821.914.10.00.00.00.0氟醛0.00.00.00.025.924.124.526.4细胞活力（%）活力（对照%清除活性（%）S.S. Mohamed et al./Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）204-209209阴离子多糖如硫酸化多糖的抗微生物活性通过其螯合活性和限制微生物生长的金属、微量元素或必需营养素的剥夺通过几种机制发生[44]。4. 结论虽然EPS是一种丰富的生物活性成分，但由于其高度的分子多样性、复杂性和高的药物设计和制备能力，其研究仍然是一个令人感兴趣的领域此外，产生EPS的微生物是满足实际工业需求的有希望的来源，特别是海洋微生物，其为新的生物活性化合物的发现提供了巨大的机会。利益冲突声明作者声明，与任何可能不适当地影响这项工作的金融组织、公司或个人没有利益冲突。引用[1] 郭顺，毛伟，李英，田军，徐军.真菌胞外多糖的结构鉴定镰刀菌 尖孢 Y24。碳水化合物研究2013;365：9-13。[2] Nichols MCA，Guezennec J，Bowman JP. 来自极端海洋环境的细菌胞外多糖，特别考虑南大洋、海冰和深海热液喷口。海洋生物技术2005;7：253-71。[3] Finore I，Di Donato P，Mastascusa V，Nicolaus B，Poli A.海洋微生物胞外多糖发酵工艺优化。Mar Drugs2014;12：3005-24.[4] ZhangY，Kong H，Fang Y，Nishinari K，Philips GO. 裂褶多糖的结构、性质、生物活性及其研究进展。Bioact Carbohydr膳食纤维2013;1：53-71.[5] 李伟，季军，芮新，于军，唐伟，陈新，等。瑞士乳杆菌MB 2 -1产胞外多糖及其体外功能特性研究。 LWT-Food Sci Technol 2014;59：732-9.[6] 张志华，唐建华，詹志良，张晓林，吴宏华.异烟肼与利福平及其代谢产物对QSG-7701肝细胞的细胞毒性。 Asian Pac J Trop Med 2012;5：306-9.[7] Ramachandran M ， Thirumalai T ， Vinothkumar P.Merremiae marginata EKElumalai的各种叶提取物的抗菌活性。Asian PacJ TropicalBiomed 2011;1：406-8.[8] Kim YO，Kim HK，Bae KS，Yu JH，Oh TK.芽孢杆菌DS11耐热植酸酶的分离纯化及性质研究。酶微生物技术1998;22：2-7.[9] 杜布瓦M，吉尔斯KA，汉密尔顿JK，Rebers PA，史密斯F。糖和有关物质测定的比色法。 Anal Chem 1965;28：350-6.[10] Holt JG，Sharpe ME，Williams ST Bergey系统细菌学手册。巴尔的摩，伦敦：威廉姆斯&威廉姆斯; 1989年。[11] Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，Lane DJ. 16S核糖体DNA扩增用于系统发育研究。J Bacteriol 1991;173：697-703.[12] [10]杨文，李文， 李文 . 分 子进 化遗 传分 析（MEGA ） 软件4.0 版 。 Mol BiolEvol2007;24：1596-9.[13] 姜志东，Jensen PR，Fenical W，Lobophorins A.一种热带海洋细菌产生的新型抗炎大环内酯。生物有机医学化学通讯1999;9：2003-6.[14] 布拉德福德MM。 一种利用蛋白质-染料结合原理对微克量蛋白质进行定量的快速灵敏方法。AnalBiochem 1976;72：248-54.[15] Filisetti-Cozzi TMC ，Carpita C. 不受中性糖干扰的糖醛酸测定。AnalBiochem1991;197：157-62.[16] Dodgson KS，Price RG.硫酸多糖中硫酸酯含量测定的注记。生物化学杂志1962：106-10.[17] 黄文，黄文，黄文，等.反相高效液相色谱法测定糖蛋白中的单糖含量.中国食品工业出版社，2001. 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