工程7（2021）1557免疫学研究从表位特异性细胞库中筛选PD-1高亲和力诱饵突变体刘浩a，b，#，乔春霞a，#，胡乃静a，c，#，王志宏a，d，王静a，冯建南a，沈蓓芬a，马元芳b，刘文，罗龙龙a，刘文a毒理学与医学对策国家重点实验室，北京药物毒理研究所，北京100850b河南大学医学院附属第一医院抗体药物工程国家联合实验室，河南开封475004c沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，中国沈阳110016d中国药科大学基础医学与临床药学院，南京210009阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2020年8月17日修订2020年11月16日接受2021年7月13日在线提供保留字：PD-L1诱饵面向表位的哺乳动物细胞文库A B S T R A C T用抗程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）/程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）单克隆抗体的免疫疗法已成为治疗多种人类癌症（如肺癌、肠癌和黑色素瘤）的常规疗法。PD-1/PD-L1通路抑制微环境中的T细胞活化，使其成为有吸引力的抗癌靶点。野生型（WT）PD-1胞外域由于其低亲和力而显示难以阻断PD-1/PD-L1混合物形成目前的工作使用三维（3D）晶体复合物结构来分析PD-1与PD-L1或PD-L2结合的相互作用。它还报告了PD-1与其临床抗体Opdivo之间结合模式的理论研究。基于PD-1及其配体的理论结合分析（即，PD-L1和PD-L2）或抗体（Opdivo），建立了针对PD-1的小含量、面向表位的哺乳动物细胞文库。在三轮细胞分选后，筛选出诱饵PD-1突变体463，其对PD-L1的亲和力比WT PD-1高（亲和力增加了几乎三个数量级）。它表现出对PD-1的抑制作用，以防止其与PD-L1形成混合物，这与市售抗PD-L1抗体atezolizumab（ATE）的作用相似。诱饵突变体的半数有效浓度（EC50）为0.031lg·mL-1，而ATE为0.063 lg· mL -1，均远低于野生型PD-1的2.571lg·mL-1。的463诱骗突变体逆转了PD 1对T细胞活化的抑制作用，10 mg·kg-1的463对MC 38转基因小鼠移植瘤的抑制率约为75%，与ATE的活性相似。更有趣的是，甚至更低剂量的463（2 mg·kg-1）显示出比10 mg·kg-1的WT PD-1更好的效果。这项工作为诱饵463提供了改善的疗效，这有可能成为对抗PD-1/PD-L1相关癌症的良好选择©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍淋巴细胞活性通常由抑制性、刺激性和共刺激性信号调节在T淋巴细胞中，阴性和阳性信号之间的平衡塑造了T细胞对暴露于反应性肽或主要组织相容性复合物（MHC）的反应[1]。癌症*通讯作者。电子邮件地址：luolong_long@126.com（L. Luo），mayf@henu.edu.cn（Y.Ma）。#这些作者对这项工作做出了同样的促进免疫系统对癌症的内源性反应[2]。然而，癌细胞有时受益于免疫抑制信号以逃避免疫监视[3]。例如，免疫检查点程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）及其配体之一程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）的信号通路通过阻断T细胞活化而对免疫功能构成障碍[4]。PD-1/ PD-L2和PD-L1/分化簇80（CD 80）也触发T细胞中的抑制信号。正常情况下，PD-1/PD-L1通路可防止T细胞过度活化，并维持对自身抗原的免疫耐受性[5]。然而，在各种癌症中，如淋巴瘤、黑素瘤、肺癌和乳腺癌，PD-L1https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.11.0112095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engH. Liu，C. Qiao，N. Hu等人工程7（2021）15571558······通常过度表达，并阻止了在癌症的肿瘤微环境中，通过与T细胞表面上的PD-1结合来抑制T淋巴细胞[6PD-1通过其细胞内结构域启动抑制性信号级联，该结构域包含激活酪氨酸磷酸酶SHP的开关基序，该酪氨酸磷酸酶SHP对抗TCR信号传导和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序[11]。PD-1/PD-L1抑制T细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒性，从而导致癌症中T淋巴细胞的耗竭和/或凋亡[12]。因此，委员会认为，PD-1/PD-L1通路已被确定为关键分子，用于癌症免疫治疗，几种抗PD 1/PD-L1抗 体 药 物 已 被 批 准 进 入 市 场 ， 如 Keytruda/ pembrolizumab ，Opdivo/nivolumab和Tecentriq/atezolizumab（ATE）。这些药物在国外一系列癌症亚型中表现出令人印象深刻的治疗功能，和转移阶段[13在临床上，大量癌症患者已证明对抗PD-1/PD-L1免疫治疗有长期应答[14] 。 结 果 令 人 印 象 深 刻 ， 足 以 加 速 2014 年 pembrolizumab 和nivolumab的批准[18，19]。最近，有证据表明，抗PD-1抗体在转移性黑色素瘤治疗中比传统化疗药物更有效[20Nivolumab在转移性鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）患者中也显示出令人满意的临床结果。它已被批准为超过15年的第一个单药治疗药物，以证明与标准策略相比具有更好的总生存期（OS）。抗体阻断PD-1/PD-L1信号传导，逆转肿瘤中的免疫抑制状态，并激活T淋巴细胞以达到次优功效;此外，传统抗体通过天然杀伤（NK）细胞或巨噬细胞（例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP））[23]。此外，抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体（PD-L1或PD-L2）结合，而抗PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1或PD-L1/CD 80信号通路[24，25]。与大多数研究中阻断PD-1/PD-L1通路时使用的单克隆抗体类似，PD-1的胞外结构域可作为竞争性拮抗剂给药。PD-1胞外段比单克隆抗体（其分子量约为150 kDa）小，分子量约为30 kDa，因此更容易进入癌变区域。然而，野生型（WT）PD-1以低亲和力结合PD-L1（~10此前，我们尝试建立了一个靶向表位的哺乳动物细胞展示文库，并获得了一种新型抗人PD-1抗体[27]。因此，我们考虑了通过体外亲和力进化的PD-1突变体是否可以像抗体一样表现出令人满意的抗肿瘤应答。因此，基于PD-1与PD-L1结合的关键残基，我们建立了包含数百万个PD-1突变体的表位特异性细胞表面展示文库，从中筛选出更高亲和力的PD-1突变体，以获得比WT PD-1功能更好的突变体。2. 材料和方法2.1. 试剂人PD-1、PD-L1和CD 80以及人/鼠PD-L2购自SinoBiological（目录号：10377-H 02 H、10084-H 02 H和10698-H 02 H）。别藻蓝蛋白（APC）结合yhttp://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm436534。htm.http://www.fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/ucm436566.htm.（例如，PD-1）和生物素缀合（例如，PD-1、PD-L1和PD-L2）由Jiaxuan Biotech Co.，有限公司（中国）。干扰素（IFN）-c检测试剂盒购自BioLegend，Inc.。（美国），抗PD 1抗体Opdivo和抗PD-L1抗体根据专利DNA序列在本实验室制备ATE。MIL50是本实验室制备的抗蓖麻毒素单克隆抗体。链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）、链霉亲和素-APC、同种型对照人免疫球蛋白G（IgG）（目录号：02-7102）和山羊抗人IgG（H + L）二级抗体（HRP偶联;目录号：#A18805）来自Invitrogen（USA）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM;目录号：11965-092）、DMEM-F12培养基（目录号：C11330500 BT）和胎牛血清（FBS;目录号：10438-034）来自Thermo Fisher（USA）。ExpiCHO表达系统来自Thermo Fisher（目录号：A29133）。在我们的实验室构建了具有膜展示的哺乳动物细胞文库质粒pFRT-FTMK和携带完整Ig的载体pFRT-IgG 1 K[27]。上述两种载体来源于Invitrogene该载体含有翻转酶（Flp）-重组靶（FRT）特征序列。重组酶Flp可以将质粒切割并插入基因组中具有相同特征序列的特定位点。所有其他试剂均以分析级购自商业来源。2.2. 细胞培养通过将PD-L1基因转染至CHO-K1细胞（美国典型培养物保藏中心（ATCC），USA）制备中国仓鼠卵巢（CHO）-K1-PD-L1细胞。人胚肾上皮细胞293 T（ATCC，USA）和MC 38（小鼠PD-L1敲除，人PD-L1敲入）获自上海模型器官中心有限公司。 （中国）; CHO-Flp-In TM 培养细胞在补充有100单位mL-1青霉素、100单位mL-1链霉素、100μgmL-1博 莱霉素和10%热灭活FBS的DMEM/F12培养基中。将293T细胞在DMEM中培养补充有10%热灭活FBS、100单位mL-1青霉素和100单位mL-1链霉素。将细胞在加湿培养箱（Thermo Fisher）中于37 °C在5%二氧化碳（CO2）中培养。2.3. PD-1库使用InsightII（2005版; Molecular Simulations，USA）构建与PD-L1结合的人PD-1的非理论三维（3D）结构，并使用模块Discover和Discover_3进行优化非键合截止值为10 nm（1 nm = 0.1nm），原子电荷和非键合参数作为默认值。一个距离依赖的介电常数被用于在真空中计算。分别使用最速下降法（2000步）和共轭梯度法（5000步）最小化模型根据PD-1和PD-L1复合物的理论结构，预测了PD-1/PD-L1相互识别的潜在氨基酸位置为了证明理论预测的正确性，将PD-L1中参与识别PD-1的关键氨基酸替换为丙氨酸，验证PD-L1和PD-1作用的关键位点。在验证模型正确的情况下，我们设计了一系列PD-1突变。我们将PD-1的PD-L1接触位点替换为具有与PD-1相似的碳链骨架但具有更长侧链的残基，其与PD-L1结合更紧密。为了保证理论文库的质量，还使用相同的理论方法研究了PD-1和PD-L2、PD-1及其临床抗体Opdivo的三维复合物结构H. Liu，C. Qiao，N. Hu等人工程7（2021）15571559××·····2.4. 流式细胞术实验在冰上进行。洗涤细胞（5 × 105），悬浮于测定缓冲液（含有2%FBS的磷酸盐缓冲盐水（PBS））中，然后与蛋白质（例如，如有必要，洗涤后，将细胞与APC缀合的链霉亲和素一起孵育，使用BDFACSCaliburTM（USA）测定。 收集细胞荧光密度并用BD CellQuestPro软件分析。2.5. PD-1图书馆基于计算机辅助设计结果，首先通过丙氨酸置换法合成了PD-1上的5个突变体（M1-PD-1上的特定氨基酸取代和突变前后与PD-L1结合的自由能结果见表1。对PD-1突变体与PD-L1结合的荧光激活细胞分选（FACS）数据测试用于鉴定突变区域的重要性，并选择PD-1的1 - 3个关键位点，并用1-3种具有增强PD-1与PD-L1结合亲和力潜力的氨基酸（表2）替换这产生了小含量的PD-1靶向文库。利用重叠PCR技术合成文库基因，亚克隆到pFRT-FTMK中，转染CHO-Flp-InTM细胞。表1基于计算机辅助设计的PD-1上可能与PD-L1相互作用的丙氨酸的特异性氨基酸取代和相互作用能的计算2.6. FACS分选收集从细胞文库中筛选出的总共5 × 107 个细胞，并将其重悬于ImL补充有2%的PBS中。FBS。然后将细胞用21g/mLPD-L1-生物素染色，在4 ℃孵育30 min后，加入APC-缀合的链霉并在相同条件下孵育WT PD-1细胞设为对照。分析荧光数据，并使用FACS Aria III流式细胞仪分选具有较强结合能力的细胞使用我们的Flp-FRT哺乳动物细胞系统对来自文库的选定PD-1突变基因进行测序、亚克隆和表达2.7. 酶联免疫吸附试验将酶联免疫吸附测定（ELISA）板用11gmL-1蛋白质（例如，PD-1）孵育过夜，然后在补充有1%牛血清白蛋白的PBS中封闭05% Tween-20的牛血清白蛋白（BSA）在37 °C下孵育1小时。蛋白质（例如，PD-L1-生物素）。洗涤后，加入辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素，在室温（RT）下孵育1小时。使用四甲基联苯胺（TMB）底物（目录号：00-4201-56; Invitrogen）使结合信号可视化， 并 使 用ELISA 读数器在450 nm 处测量吸光度。2.8. Biacore表面等离子体共振实验在25 °C下使用Biacore T200机器以HBS-EP作为运行缓冲液（目录号：BR-1003-99; GE Healthcare，USA）进行。对于这些测量，PD-L1或PD-L2在pH 5.0下偶联在CM 5芯片上PD-1突变体PD-1中的关键残基与PD-L1PD-1突变前PD-1与PD-L1之间的相互作用能（kJ）PD-1和PD-L1之间的相互作用PD-1中Ala置换后（kJ）使用胺偶联试剂盒（Cat.编号：BR-1001-护理）。将PD-1突变体的系列稀释液（3.125 -50nmolL-1）以30 μ Lmin- 1通过两个流动池，以记录缔合相（120 s）。解离阶段监测1200 s，并通过用HBS-EP替换样品溶液来触发。本体折射率差异PD-1 M1天冬酰胺66酪氨酸68-218.96-108.29PD-1 M2Asn74 Gln75 Thr76 Asp77 Lys78-218.96-98.31PD-1 M3酪氨酸45谷氨酸46天冬氨酸48天冬酰胺49-218.96-215.38PD-1 M4异亮氨酸126亮氨酸128赖氨酸131异亮氨酸134谷氨酸136-218.96-94.29PD-1 M5谷氨酸84天冬氨酸85精氨酸86丝氨酸87谷氨酰胺88-218.96-106.83Asn：天冬酰胺; Tyr：酪氨酸;谷氨酰胺：谷氨酰胺; Thr：苏氨酸;天冬氨酸：天冬氨酸;赖氨酸：赖氨酸;谷氨酸：谷氨酸;岛：异亮氨酸;亮氨酸：亮氨酸; Arg：精氨酸; Ser：丝氨酸。表2设计高亲和力PD-I突变以形成小含量细胞文库。通过减去在参考流动池（第一流动池）上获得的响应来校正每次循环后，传感器表面通过10 mmol L-1甘氨酸-HCl（pH 2.1）的短暂处理进行再生记录结合动力学并使用1：1结合模型用Biacore T200评估软件（GE Health-care）分析。将WT PD-1设定为对照，将溶剂（样品缓冲液）设定为阴性对照。根据V-基线扣除背景，以获得动力学曲线并计算解离常数（KD值）。关键氨基酸替代氨基酸合并密码子2.9. 小鼠肿瘤异种移植模型（自由能≤-119 kJ）Val64 His，Ile，列伊AWSArg69 Glu RRSAsn74 Gly，Ser RRCAla81 Val，莱乌，VYC岛Glu84 Gln，Asp SASArg86 His，Tyr YRC丝氨酸87天冬氨酸ARCGly90 Ala，Val，Leu SBCGln91 Tyr，Phe YWSLeu122 Ile，Gln MWS丝氨酸127酪氨酸，苯丙氨酸THCAla129 Gly GSCAla132 Val，Leu，Ile BYCM = A/C，R = A/G，W = A/T，S = G/C，Y = C/T，V = A/G/C，H = A/C/T，B = G/C/T代表着几个基地的合并理论上，合成过程中每个碱基的频率是相等的。雌性12 - 14周龄转基因小鼠C57 BL/6 j（鼠PD-1敲除和人PD-1敲入小鼠）购自上海模式生物中心有限公司。（中国），并在无特定病原体（SPF）级设施中饲养在过滤罩笼（每笼五只小鼠）中，用无菌食物和水喂养。我们遵循“我们在研究过程中遵循动物伦理学，遵循Val：缬氨酸; Ala：丙氨酸; Gly：甘氨酸; Phe：苯丙氨酸; His：组氨酸。yhttps://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines。H. Liu，C. Qiao，N. Hu等人工程7（2021）15571560×和毒理学。在我们注射癌细胞之前，一周内每天都要检查小鼠的不适症状和一般外观。然后，在MC 38细胞系的基础上，用人PD-L1分子原位替换小鼠PD-L1基因的基因工程细胞系将上述细胞培养至对数生长期，静脉内注射每只小鼠1106个在约一周内，当肿瘤体积达到80 mm3时，向小鼠腹膜内注射抗PD-L1抗体ATE、WT PD-1、PD-1突变体463或同种型对照（抗蓖麻毒素抗体MIL 50）。每周观察小鼠两次，以测量小鼠体重和肿瘤大小，持续另外四周。测定后，使用氯胺酮麻醉，然后用颈椎脱位法处死小鼠;然后我们使用深度冷冻来确认死亡。2.10. 统计分析通过Student t检验或通过重复测量的单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析通过Tukey事后检验降低。通过双因素ANOVA分析体内差异，然后进行Bonferroni事后检验。用正态线性混合效应模型检验剂量递增实验的显著性当p0.05时，认为治疗具有显著性。3. 结果3.1. 与PD-L1结合的PD-1表位被叠加使用同源建模、对接和动态模拟方法，我们分别建模了PD-1及其配体PD-L1或PD-L2或抗PD-1抗体Opdivo的理论结构。使用PD-1和PD-L1的3D复杂理论结构，构建初始亲和力成熟文库。为了保证理论亲和力成熟文库的质量，从理论上分析了PD-1与PD-L2、PD-1与Opdivo的结合方式。利用PD-L2和Opdivo鉴定的PD-1的结合模式和关键残基，对亲和成熟文库进行优化，并对重要残基进行预测。如图所示图 1（a），相互作用 的关键氨基酸位点图1.一、PD-1结合PD-L1的表位鉴定（a）PD-1和PD-L1复合物的理论结构绿色棒代表PD-1中的关键位点，而紫色棒是PD-L1中与PD-1结合的关键位点位于PD-1和PD-L1之间界面的部位（绿色和紫色棒）是直接接触的关键部位（b）流式细胞术检测PD-L1上与293 T细胞表面上展示的WT PD-1或其突变体结合的位点。设计突变体并使用丙氨酸置换法合成其DNA序列。将转染的细胞与生物素缀合的PD-L1一起孵育，然后与APC缀合的链霉亲和素一起孵育。M1、M2、M4和M5突变体失去了它们的结合能力，表明这些突变体中的突变残基是允许PD-1结合PD-L1的关键位点阴性：阴性对照。H. Liu，C. Qiao，N. Hu等人工程7（2021）15571561PD-1和PD-L1由不同颜色的棒状结构表示。将表达PD-1突变体的细胞（M1-M1、M2、M4和M5被证实对于PD- 1与PD-L1的结合是重要的，因为它们显示与PD-L1的结合显著降低或完全丧失（图2）。 1（b））。基于图1（b）中所示的FACS发现位于 PD-1 上的残基 Val64 、 Arg69 、 Asn74 、 Ala81 、 Glu84 、Arg86、Ser87、Gly90、Gln91、Leu122、Ser127、Ala129、Ala1323.2. 利用表位特异性细胞库WT PD-1可以以低亲和力与PD-L1结合，因此很难阻断癌症微环境中的PD-1/PD-L1相互作用更高亲和力的PD-1突变体可以阻断PD-1/PD-L1混合物形成，作为潜在的诱饵药物（图2（a））。基于根据PD-1的结构信息和关键位点，设计了每个氨基酸的高亲和力突变。在设计过程中，重要的是保持每个突变体的表位被PD-L1识别。也就是说，突变位点需要具有与WT残基相似的结构、物理或化学特征。因此，该文库是一个小容量文库，仅含有具有一致表位的较高亲和力的PD-1突变通过重叠PCR扩增PD-1突变体的DNA序列。电泳结果显示，DNA文库片段在琼脂糖凝胶中的转移条带大小与理论条带相同，分子量约为650个碱基对（bp）（附录A中图S1），通过常规的分子生物学消化和连接方法将突变序列插入文库载体pFRT-FTMK中。为了确认文库的活力，使用下一代测序方法对质粒进行测序，并分析设计的氨基酸以显示其分布（附录A中的图S2）。然后，将各种PD-1突变体的文库质粒转染到CHO-Flp-InTM细胞中，图二、使用细胞表面展示方法定向进化高亲和力PD-1突变体（一）高亲和力PD-1（HA-PD-1）诱饵分子设计示意图，野生型PD-1分子不能有效阻断PD-1与PD-L1之间的免疫抑制信号，提高PD-1与PD-L1之间的亲和力可以有效阻断PD-1与PD-L1之间的免疫抑制信号，释放免疫细胞的肿瘤杀伤能力（b）PD-1文库的三轮筛选在每次选择后，细胞克隆具有更强的PD-L1结合能力。SSC-A：侧向散射面积; APC-A：别藻蓝蛋白面积; HA：高亲和力; Neg：阴性对照。H. Liu，C. Qiao，N. Hu等人工程7（2021）15571562×××××···显示在细胞表面。使用三轮细胞分选筛选出高亲和力克隆（图2（b））。每轮细胞分选后，克隆具有更强的PD-L1结合能力。共筛选出29个单克隆，并对突变体序列进行测序。然后将突变序列基因插入pFRT-IgG 1Fc载体中，在293 T细胞中制备PD-1突变体Fc融合蛋白。收集转染细胞的上清液，稀释，并用包被的PD-L1/PD-L2孵育以与WTPD-1竞争。ELISA检测显示29种PD-1突变体以及WT PD-1结合PD-L1或PD-L2的结合能力（图1B）。附录A中的S3）。选择具有潜在增强的结合能力的九种突变体用于进一步拮抗鉴定：408、431、407、410、446、411、463、506和576。这些突变体可以与人PD-L1（附录A中的图S4）或人PD-L2（图S4）结合。 附录A中的S5）。此外，它们抑制WT PD-1与PD-L1或PD-L2的结合（图1A和1B）。附录A中的S6（a）和（b）），表明可能用作针对PD-1/PD-L1信号的诱饵蛋白。使用Biacore分析来确认对结合PD-L1或PD-L2具有最高亲和力的五种PD-1突变体（表3）。与WT PD-1（1.00 10 - 6）[26]相反其中一个突变体463的解离常数（2.06× 10另外，五个变种人与PD-L2的亲和常数范围为2.67106.9510根据流式细胞术数据，两种PD-1突变体463和506阻止PD-1与PD-L1表面结合。它们都显示出比WT PD-1好得多的抑制活性，以及与ATE相似或甚至更好的效果（图S6（c））。我们建立了两者的稳定细胞系;然而，506在ExpiCHO表达系统中的表达水平远低于463，因此我们选择463进行进一步的研究。突 变 体 463 与 人 PD-L1 的 结 合 呈 剂 量 依 赖 性 ， 其 EC50 值 为0.031lgmL-1，低于野生型PD-1（2.571lgmL-1）和ATE（0.063lgmL-1），提示突变体463可能具有逆转PD-1/PD-L1的作用应用程序（图） 3（a））。 如图 3（b），463以剂量依赖性方式与人PD-L2结合，EC 50值为0.63lg·mL-1，明显低于野生型PD-1（>6lg·mL-1）;463也与鼠PD-Ll结合，EC50值为0.97lg·m L-1，远低于野生型PD-1（132.5lg·m L-1）（Fig. 3（c））。3.3. PD-1突变体463阻断PD-1/PD-L1形成以抑制体内PD-1突变体463抑制人WT PD-1与PD-L1（附录A中的图S7）、PD-L2（附录A中的图S8）或CD 80（附录A中的图S9）的结合，因此逆转了细胞因子释放表3所选五种PD-1突变体与PD-L1和PD-L2结合的Biacore分析410 PD-L1 1.08× 1050.137 1.28 × 10446 PD-L1 5.05× 1060.178 3.53 × 10463 PD-L1 9.99× 105 2.060× 10506 PD-L1 4.25× 10923.600 5.54 × 10408 PD-L2 3.40× 106 9.070× 10410 PD-L2 3.47× 1010 4.240× 1021.22 × 10446 PD-L2 2.31× 106 2.070× 10463 PD-L2 2.80× 106 1.950× 10506 PD-L2 7.70× 1060.128 1.66 × 10Ka：缔合速率常数;Kd：解离速率常数;KD：平衡解离常数;KD=Kd/Ka。图3.第三章。PD-1突变体463以剂量依赖性方式与小鼠/人PD-L1或人PD-L2结合（a）463以剂量依赖性方式与人PD-L1结合将ATE和WTPD-1设定为阳性对照。 EC50值分 别 为0.031lg·mL-1（463）、2.571lg·mL-1（WTPD-1）和0.063lg·mL-1（ATE），表明463能够逆转PD-1/PD-L1抑制的潜在优势。(b)463以剂量依赖性方式与人PD-L2结合。将WT PD-1设定为阳性对照。463处理样品的EC50值为0.63lg·m L-1，而PD-1组在100lg·m L-1浓度下未达到EC 50值，表明463有可能逆转PD-1/PD-L2抑制。(c)463以剂量依赖性方式与鼠PD-L1结合。将WT PD-1设定为阳性对照。mL-1（463）和132.50lg·mL-1（WTPD-1）;突变体号样品Ka（（mol·LKd（s-1）KD（mol·L408PD-L19.84×1070.5725.81 ×10H. Liu，C. Qiao，N. Hu等人工程7（2021）15571563··········(e.g.、IFN-c）在T细胞中以剂量依赖性方式由CD 3/CD 28途径触发。PD-L1抑制T细胞活化;然而，抗PD-1抗体Opdivo逆转了这种抑制。463似乎类似于Opdivo，但比WT PD-1好得多，因为后者显示出弱的或没有恢复作用（图1B）。 4（a））。在体内MC 38异种移植小鼠模型（每组n= 5）中，463以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长，这与相同剂量（10 mg kg-1）的ATE的作用相似在用10 mg kg-1的463 治疗的组中，平均肿瘤体积约为600mm3，而在用WT PD- 1治疗的组中，体积接近2000 mm3，这与同种型对照组（MIL 50组）中的体积相似更有趣的是，即使是2 mgkg-1的463也比10 mg kg-1的WT PD-1具有更好的抗肿瘤能力，并导致平均肿瘤体积约为1100 mm3（10 mg kg-1 463 vs 10 mg kg-1 WTPD-1，p0.05）。在第20天，处死小鼠，分离肿瘤并称重。结果表明，10 mg kg-1的463或2 mg·kg-1的463具有良好的抗肿瘤作用，其肿瘤重量分别为（0.6 ± 0.31）和（1.06 ± 0.45）G.与WT PD-1相比，在相同剂量下，10 mg kg-1 463优于10 mg kg-1WT PD-1（1.53 ± 0.81）g（图1A和1B）。4（b）<-（d），p0.05）。4. 讨论免疫检查点分子PD-1是存在于T细胞表面并调节T细胞活化的I型跨膜受体。活化的T细胞分泌过量的炎性细胞因子;然而，作为T细胞过度活化的检查点分子，PD-1可以结合其配体PD-L1和PD-L2以限制T细胞活性。在癌症环境中，PD-L1分子通常在癌细胞表面过表达;因此，PD-1/PD-L1信号通过抑制T细胞的抗肿瘤免疫应答而使癌症进展阻断PD-1和PD-L1之间的信号传导轴及其抗PD-1或抗PD-L1抗体在癌症患者中显示出显著的治疗成功，在黑色素瘤、NSCLC和其他实体瘤的临床试验中观察到客观肿瘤缓解[29]。在转移性尿路上皮膀胱癌患者的I期临床试验中，效果令人印象深刻，以至于在43%的患者中观察到肿瘤缩小;因此，美国食品和药物管理局授予测试抗体突破性名称[30，31]。在全球范围内，抗PD-1/PD-L1治疗性抗体药物正在扩大其癌症治疗的适应症。然而，抗PD-1和抗PD-L1抗体治疗实际上仍处于图四、诱饵PD-1突变体463在体外和体内的生物学功能。（a）463以剂量依赖性方式恢复了由CD 3/CD 28途径触发的T细胞中IFN-c的细胞因子释放将Opdivo和PD-1设置为对照。463显示了与Opdivo相似的功能463抑制异种移植小鼠模型中的肿瘤生长(b)异种移植小鼠的肿瘤体积;（c）肿瘤重量;和（d）从小鼠剥离的肿瘤。将ATE和PD-1设为阳性对照，将抗蓖麻毒素抗体MIL 50设为同种型对照。10mg·kg-1的463显示与10mg·kg-1的ezolizumab相似的体内抗肿瘤活性，但是10mg·kg-1的WT PD-1显示非常弱的功能。更有趣的是，2mg·kg-1的463显示出比WT PD-1更好的抑制活性*p 0.05。H. Liu，C. Qiao，N. Hu等人工程7（2021）15571564×临床开发的早期阶段，并且预期更多的检查点抗体和抗体样蛋白在临床前或临床试验中具有增强的功能。由于抗体具有固有的局限性，包括差的肿瘤/组织转移率和消耗免疫细胞的有害Fc效应子功能，PD-1/PD-L1导向的免疫疗法可以用较小的蛋白质（例如，诱饵PD-1）治疗。本文提供的高亲和力诱饵PD-1突变体具有在整个肿瘤中更广泛地扩散的潜力，而已经发现抗PD-L1抗体此外，发现高亲和力诱饵PD-1突变体在治疗较大肿瘤方面比PD-L1抗体更有效，这可能是因为与Fc融合的分子量减半的高亲和力诱饵PD-1突变体可以更有效地进入肿瘤[32]。事实上，很早就报道了鼠PD-1与人PD-L1[33]或鼠PD-L2[34，35]复合物的晶体结构，并且已经发表了在其与人PD-L1结合期间形成的人PD-1复合物的X射线晶体结构嗯，考虑到WT PD-1胞外域以1× 10- 6的亲和力结合PD-L1，这太低而不能与PD-1/PD-L1复合物形成竞争。为了寻找更高亲和力的诱饵PD-1突变体，我们首先基于先前报道的结构构建并理论优化了人PD-1/PD-L1复合物（在溶剂中，柔性结构）的模型研究表明，人PD-1/人PD-L1与受体PD-1内的显著可塑性相关，并且PD-L1可能被小分子靶向以抑制PD-1/PD-L1轴[36]。根据我们的模型，预测的关键残基和丙氨酸扫描实验进一步修正了理论预测的结构。此外，基于PD-1与PD-L1结合的关键残基，我们设计并建立了包含数百万个PD-1突变体的表位特异性细胞表面展示文库，从中筛选出亲和力更高的PD-1突变体463，并显示其功能优于WT PD-1。肿瘤相关PD-L1表达预测临床疗效然而，PD-L1阴性患者也对抗PD-1检查点治疗有反应，这表明存在其他PD-1相关配体或途径。PD-L2是另一种已知的PD-1配体，肿瘤组织中的PD-L2表达与接受派姆单抗治疗的复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的临床应答存在明确关系发现PD-L2分布与PD-L1显著相关，而在某些缺乏PD-L1的肿瘤中检测到PD-L2表达。PD-L1和PD-L2均可预测pem- brolizumab的治疗反应。PD-L1和PD-L2阳性患者的治疗应答优于仅PD-L1阳性患者。PD-L2也是派姆单抗治疗无进展生存期（PFS）的独立预测因子。与PD-L2阴性患者相比，PD-L2阳性患者没有进展，OS更长。总之，对于PD-L1和PD-L2阳性癌症，靶向两种PD-1配体的药物可能比仅靶向PD-L1的药物具有更好的临床获益[37]。该研究证明，亲和力成熟的PD-1突变体463可以高亲和力结合PD-L1和PD-L2（图3）。并且与上述PD-1抗体或PD-L1抗体不同，高亲和力诱饵分子463似乎阻断三种信号传导途径PD-1/PD-L1（图S7）、PD-1/PD-L2（图S8）和PD-L1/CD 80（图S8）。 S9）。这进一步阐明了463的理论基础作为抗肿瘤候选分子。此外，463逆转了T细胞抑制并刺激了细胞因子释放（例如，IFN-c）由CD 3/CD 28途径触发。在体内异种移植小鼠中，模型，463抑制肿瘤生长的功能类似于并且优于野生型PD-1（图4）。我们的数据证明了诱饵PD-1突变体463，并表明它具有PD-1相关癌症治疗的潜力，特别是在PD-L1和PD-L2阳性癌症中。确认这项工作得到了国家自然科学基金（21976210）的资助。遵守道德操守准则刘浩、乔春霞、胡乃静、王志宏、王静、冯建南、沈北芬、马元芳和罗龙龙声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.11.011上找到。引用[1] 帕多尔DM.癌症免疫治疗中免疫检查点的阻断。Nat Rev Cancer 2012;12（4）：252[2] Blankenstein T，Coulie PG，Gilboa E，Jaffee EM.肿瘤免疫原性的决定因素。Nat Rev Cancer2012;12（4）：307-13.[3] Klump KE ， McGinnis JF. 活 性 氧 在 眼 部 恶 性 肿 瘤 中 的 作 用 。 Adv Exp MedBiol2014;801：655-9.[4] 杨文忠，杨文忠. 肿瘤细胞上的PD-L1参与逃避宿主免疫系统和PD-L1阻断的肿瘤免疫治疗。Proc Natl Acad Sci USA 2002;99（19）：12293-7.[5] Riella LV，Paterson AM，Sharpe AH，Chandraker A. 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