研究有害的单核苷酸多态性对人乳腺癌的结构和功能影响

医学信息学解锁22（2021）100503转录-翻译错误：在计算机上研究有害的单核苷酸多态性对人乳腺癌的结构和功能的影响。GULP1基因奥佩耶米湾Soremekuna，e，Chisom Ezenwab， e，Mahmoud Soliman a，Tinashe Chikoworec， d，Oyekanmi Nashirub，**，Segun Fatumob，e，f，*a分子生物计算和药物设计实验室，健康科学学院，夸祖鲁-纳塔尔大学，韦斯特维尔校区，德班，4001，南非b尼日利亚阿布贾国家生物技术局基因组学研究与创新中心cMRC/Wits健康发展途径研究股，威特沃特斯兰德大学健康科学学院儿科系，约翰内斯堡，南非d悉尼布伦纳分子生物科学研究所，健康科学系，威特沃特斯兰德大学，南非约翰内斯堡e非洲计算基因组学研究小组，MRC/UVRI LSHTM乌干达研究所，乌干达f联合王国A R T I C L EI N FO保留字：非同义单核苷酸多态性GULP1SNPinformaticsMD模拟A B S T R A C T非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）是已知破坏翻译产物从而改变蛋白质结构-功能关系的最常见的突变形式之一。GULP 1（PTB domain-containing engulfment adaptor protein 1）是一种进化上保守的衔接蛋白，在全基因组关联研究（GWAS）中与糖化血红蛋白（HbA 1c）相关。为了了解GULP1在糖尿病病因学中的作用，研究GULP1蛋白中存在的一些功能性nsSNPs是重要的。因此，我们使用SNPinformatics方法来检索，分类，并确定一些nsSNP的稳定性效应。致病分类工具联合预测Y27 C、G142 D、A144 T和Y149 C是致病的，然而，只有G142 D、A144 T和Y149 C的结构架构如I-MUTANT和MuPro所预测的那样受到干扰。有趣的是，G142D和Y149C出现在GULP1的位置142和149处，这两个位置恰好在GULP1的结合位点内发现。蛋白质相互作用分析还显示GULP 1与细胞分裂周期5样蛋白（CDC 5L）、ADP-核糖基化因子6（ARF 6）、Arf-GAP with coiled-coil（ACAP1）和多表皮生长因子样结构域蛋白10（MEGF 10）等10种蛋白质相互作用。rs 128246649可作为糖尿病诊断的遗传生物标志物。然而，作为计算研究，这些nsSNPs需要实验验证，以探索它们在疾病发病机制中的代谢参与。1. 介绍遗传技术的进步已经导致在人类基因组内鉴定出若干遗传变异，然而这并非没有一些挑战。单核苷酸多态性（SNP）是人类基因组中最丰富的变异形式，数量在300万到500万之间[1]。已发现SNP有助于疾病的发生，因此，它们被用作理解疾病病因的遗传标记，然而，一些SNP是中性的，即它们不是致病的[2]。SNP改变了氨基酸的一级序列称为非同义单核苷酸多态性（nsSNP）。由于它们在氨基酸链上引起的变化，翻译产物受到影响，因此扭曲了蛋白质的功能[3]，并可能导致药物代谢和吸收[4]。这些SNP已经通过全基因组关联研究（GWAS）或家庭研究GULP1（含PTB结构域的吞噬衔接蛋白1）是通过吞噬作用吞噬凋亡细胞所必需的进化保守衔接蛋白[5]。它包含几* 通讯作者。非洲计算基因组学（TACG）研究小组，MRC/UVRI和LSHTM，乌干达恩德培** 通讯作者。电子邮件地址：oyekan. gmail.com（O. Nashiru），segun. lshtm.ac.uk（S.法图莫）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100503接收日期：2020年10月21日;接收日期：2020年12月14日;接受日期：2020年12月14日2020年12月24日在线提供2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuO.S. Soremekun等人医学信息学解锁22（2021）1005032-+号蛋白质相互作用结构域和区域，如N-末端磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域、亮氨酸拉链结构域和富含脯氨酸/丝氨酸的结构域[6，7]。它们调节细胞胆固醇和鞘糖脂移位[5]。GULP1结构的畸变已在几种疾病中报道，如精神分裂症[8]、关节炎[9]和癌症[10]。在我们之前的GWAS分析中，我们确定了GULP1和糖化血红蛋白（HbA1c）之间的关联[11]。HbA1c是用于诊断糖尿病的标志物，通常用于估计个体过去三个月的平均葡萄糖水平，以跟踪糖尿病血管损伤[12]。HbA1c不仅可用于糖尿病的诊断，还可用于糖尿病引起的病变（如视网膜病变、肾病和神经病变）的诊断。然而，HbA1C在非洲也没有被充分用于诊断，因为人们担心它会被感染和缺铁所混淆。考虑到GULP1在疾病诊断中的作用，研究该基因中存在的变体的功能后果是重要的。因此，我们使用致病预测工具如PolyPhen、PANTHER、SNPGO、PhD-SNP等，对NCBI-SNPs数据库中检索到的SNP数据进行了SNPin- formatics调查。我们进一步调查了预测的致病nsSNPs的保守性和稳定性。此外，致病SNPs的结构检查和可视化进行了分子动力学模拟和CHIMERA。本研究中采用的研究方法（图1）的优点是能够快速和廉价地筛选功能重要的变体，这些变体需要通过实验程序进行验证2. 材料和方法2.1. GULP1结构解析为了表征GULP 1的三维结构，我们使用了基于计算结构的技术，该技术由迭代线程组装细化（I-TASSER）算法[13]促进。I-TASSER算法使用数千种蛋白质模型进行训练，这些模型作为构建天然蛋白质或缺乏3D结构的蛋白质结构的模板[13]。采用COACH [14]确定GULP1蛋白的潜在结合口袋COACH结合绑定Fig. 1. 本研究所采取步骤的工作流程示意图TM-SITE [15]、FINDSITE [16]和ConCavity [17]的位点预测，以预测潜在的结合口袋。通过使用CHIMERA中的“swapaa”命令行在GULP12.2. GULP1 nsSNP数据集检索和nsSNPUniProt数据库[19]用作检索GULP1基因（Q9UBP9）的FASTA序列的来源，而GULP1nsSNP数据集从dbSNP数据库[20]下载，并进一步用gnomAD浏览器[21]和Ensembl浏览器[22]进行交叉验证。为了评估GULP 1nsSNP的致病性，使用了SIFT [23]、Poly-phen 2 [24]和PhD-SNP[25]。SIFT通过使用称为耐受指数的排名得分来访问SNP的路径基因状态(TI)score [23]. TI值0.05的突变被认为是有害的，而TI值>0.05的突变被认为是非致病性的[23]。PolyPhen还调查了使用PSIC评分，在进化保守结构域中发现变化的概率[24]。PhD-SNP采用训练的数据集来检查氨基酸取代的致病性质，无论是致病还是非致病[25]。SNPs GO是一个非常精确和准确的服务器，它以82%的准确度预测疾病相关的氨基酸取代[26]。PMUT是一种注释和预测某个位置的氨基酸取代是病理性的还是非病理性的工具。PMUT使用不同类型的后端算法来描述突变和神经网络来处理数据[27]。SNAP 2是一个基于神经网络训练的工具，它利用序列和变异体的信息区分效应和非同义变异它使用的预测分数范围从100 到100 标志着 一 强 非同义 预测和强同义词预测[28]。2.3. 突变对GULP1结构稳定性nsSNP改变蛋白质强度的可能性非常高，它增加或降低蛋白质的稳定性。为了评估nsSNP对GULP 1稳定性的影响，使用了三种工具（I-Mutant[29][2I-Mutant是一种支持向量机工具，可以自动预测氨基酸取代后蛋白质的稳定性差异。优化I-Mutant以使用蛋白质结构或蛋白质序列预测蛋白质稳定性。如果使用蛋白质结构作为查询，I-Mutant的准确率为80%，而如果使用蛋白质序列，则为77%。能量变化（DDG）值， 是突变体的吉布斯自由能减去野生蛋白质的吉布斯自由能，单位为Kcal/mol。MUpro是一种结合支持向量机和神经网络两种机器学习方法来预测单核苷酸突变如何影响蛋白质稳定性的工具，其准确率为84%。DDG分数小于0表示氨基酸取代降低蛋白质稳定性，而分数大于0意味着增加蛋白质稳定性。2.4. GULP1序列保守性分析和转录后修饰位点（PTM）预测在ConSurf服务器的帮助下预测GULP1内存在的保守区域的估计[31]。ConSurf基于蛋白质及其同源物之间的进化相关性来估计保守值。转录后修饰参与了信号转导、蛋白质间相互作用等疾病的发病过程。因此，PTM的预测有助于了解疾病发病机制变化的影响。我们使用Modpred和Musite来确定存在于GULP1中的PTM位点。Modpred使用蛋白质序列预测PTM位点O.S. Soremekun等人医学信息学解锁22（2021）1005033±-±2.5. 突变对GULP1的时间结构扰动效应我们采用分子动力学模拟（MDS）来探索突变对GULP1的结构扰动影响，使用先前报道的模拟方案[32，33]。GULPI蛋白（野生型和突变型）的参数化借助于AMBER18软件中存在的FF14SB进行。GULP1参数和拓扑坐标是使用AMBER18的LEAP变体导出的。然后进行部分抑制、完全抑制、加热和平衡[34]。随后进行了100 ns的生产运行[35]。生产运行轨迹在AMBER18的CPPTRAJ变体的帮助下进行了检查[36]。通过CHIMERA促进可视化和氨基酸置换[18]。3. 结果3.1. GULP1结构测定GULP1的三维结构先前已被结晶化（6ITU）[37]并保存在蛋白质数据库（PDB）中。然而，这种结晶结构只是整个GULP1蛋白的一部分。因此，有必要构建包含所有重要结构域的GULP1结构。从UniProt服务器检索GULP 1的FASTA序列[19]，并因此用作I-TASSER的输入，6 ITU和3SUZ用作模板。建模的GULP1蛋白具有置信度评分（C评分）、估计的TM评分和估计的均方根偏差（RMSD）[38]，2.59、0.41、0.14和12.34.3分别为（图2A）。GULP 1在Verify-3D、PROGRAM和ERRAT的帮助下进行了确认。使用这些工具的研究表明，建模GULP1具有较高的结构完整性，可用于进一步的下游生物信息学分析。使用COACH的结合位点表征鉴定了22个残基（残基P40、K41、T43、L95、H96、R97、I98、S99、F100、C101、A102、D103、K105、K116、H123、E135、T138、L139、G142、F145、Y149和F152），其在20个氨基酸残基处具有相同的结合位点。C-评分为0.43，COACH预测了三个预测的nsSNP中的两个发生在位于活性位点内的位置（142和149）处3.2. 预测致病性SNP并评估GULP1蛋白的稳定性从dbSNPs检索的GULP1SNPs包含628个SNPs，其中207个是非同义的。将207个nsSNP输入PhD-SNP、PANTHER、PolyPhen和SNPs GO服务器中。四个nsSNPs（rs1446644508、rs1357922096、rs1264999716和rs128246649）在预测到被致病通过这些四 SNP致病性预测工具（表1）。用PMUT和SNAP 2对这四个SNP的进一步分析揭示了它们也是致病的和致病的。进一步分析四种预测的SNP以评估它们对GULP1稳定性的影响。采用I-MUTANT和MuPro测定蛋白质不稳定性的变化。通过I-MUTANT和MuPro预测rs 1446644508分别增加和降低GULP 1稳定性。然而，I-MUTANT和MuPro联合预测rs 1357922096、rs1264999716和rs 128246649降低GULP 1的稳定性。因此，这些SNP被用于进一步分析。3.3. 翻译后修饰位点的评价和保守性分析通过使用GULP1的一级序列作为输入，在ModPred服务器的帮助下确定与我们预测的nsSNP相关的翻译后修饰。ModPred预测rs128246649位 于 蛋 白 水 解 切 割 位 点 ， 而 rs1357922096 、 rs1264999716 和rs1446644508没有PTM位点。保守性分析对于揭示nsSNPs是否存在于保守区域中非常重要。来自ConSurf服务器的分析显示，rs1446644508和rs1357922096位于GULP1的高度保守区域，两者的会话得分均为8。rs128246649发生在平均保守的区域，保守性评分为5（表2）。3.4. 突变对GULP1的时间结构扰动效应为了探索突变对突变蛋白相对于野生型的时间效应，我们检查了均方根偏差（RMSD）、回转半径（RoG）、主成分分析（PCA）和蛋白中的氢键数目。如上文在使用I-MUTANT和MuPro的稳定性估计中所见，突变通过引起突变体稳定性的降低而改变了蛋白质的稳定性。同样，Cα骨架RMSD图证实了这些发现，野生蛋白在整个过程中显示出高稳定性然而，在模拟期间，突变后，蛋白质的不稳定性显著增加（图3A）。类似地，当蛋白质被投射到两个运动分量，主分量1（PC 1）和主分量2（PC 2）上时，野生蛋白质沿着两个主分量几乎没有分散（PC1和PC2），与突变蛋白不同，（G142 D、A144 T和Y149 C），其沿着两个主成分表现出高度分散的运动，这是突变赋予蛋白质的不稳定性的结果（图3B）（见图3B）。 4）.图二、模型化GULP1的三维结构（A）。野生型和突变型蛋白质的叠加结构（B）。O.S. Soremekun等人医学信息学解锁22（2021）1005034表1氨基酸变化对GULP1基因的影响及其与疾病的关联RSID突变PolyPhenPhD-SNP/评分PANTHER/评分SNPS GO/评分rs1446644508Y27CPD疾病/0.812疾病/0.849疾病/0.629rs1357922096G142DPD疾病/0.857疾病/0.878疾病/0.768rs1264999716A144TPD疾病/0.815疾病/0.671疾病/0.612rs128246649Y149CPD疾病/0.872疾病/0.939疾病/0.762答：可能是破坏。表2氨基酸变化对GULP1稳定性的影响。RSID突变I-MutantMuPro保护评分翻译后修饰位点rs1446644508Y27C增加减少8***rs1357922096G142D减少减少8蛋白水解切割rs1264999716A144T减少减少0***rs1282464649Y149C减少减少5***图三. 对于野生型和突变型蛋白质，骨架RSD被描绘为时间的函数（A）。PCA散点图描绘了野生蛋白和突变蛋白之间运动的明显分离（B）。野生型和突变型蛋白质中的氢键总数（C）。野生型和突变型蛋白质C- α原子的回 转半径 （D）。在生产运行期间测量蛋白质的Cα骨架的紧密性的RoG估计也遵循类似的趋势如RMSD图。当与野生蛋白质相比时，野生蛋白质表现出高原子紧密性，而突变蛋白质显示出较低的紧密性（图3D）。突变前蛋白质中的平均氢键数为108，而G142D、A144T和Y149C的平均氢键数估计分别为111、114和104（图3C）。 在G142D中观察到的额外氢键和A144 T可能是由于天冬氨酸和苏氨酸形成的分子内键，而在Y149 C蛋白中看到的也可能是由于酪氨酸突变为半胱氨酸时的键丢失。蛋白质相互作用预测表明GULP 1与10种蛋白质相互作用，即细胞分裂周期5样蛋白（CDC 5L）、ADP-核糖基化因子6（ARF 6）、具有卷曲螺旋的Arf-GAP（ACAP 1）、多表皮生长因子样结构域蛋白10（MEGF 10）、吞噬和细胞运动蛋白3（ELMO 3）、吞噬和细胞运动蛋白3（ELMO 3）、吞噬和细胞运动蛋白4（EMO 3）、吞噬和细胞运动蛋白4（EMO 3）、吞噬和细胞运动蛋白4（EMO 3）、吞噬和细胞运动蛋白4（EMO 3）。O.S. Soremekun等人医学信息学解锁22（2021）1005035图四、GULP 1的蛋白质-蛋白质相互作用图。运动蛋白2（ELMO 2）、吞噬和细胞运动蛋白1（ELMO 1）、鞭毛内转运蛋白122同源物（IFT 122）、胞质分裂蛋白1（DOCK 1）和衔接分子crk（CRK）。4. 讨论和结论在基因组中已经鉴定出数百万个SNP，其中一些发生在内含子区域，另一些发现于外显子区域。随着全基因组关联研究（GWAS）的增加，各种SNP将被鉴定并保存在各种数据库中，如dbSNP，Encoding，gnomAD和GWAS目录。由于SNPs数据的雪崩，精确定位导致疾病发作的特定SNPs变得越来越苛刻。计算方法在鉴定致病或致病的SNP中提供了科学帮助，这些SNP被称为nsSNP。此外，nsSNP改变蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用、蛋白质-配体相互作用和药物代谢。因此，nsSNP的鉴定可用作诊断疾病的遗传生物标志物[39，40]。本研究中使用的每一种生物信息学工具都是使用不同的算法，这可能导致对于相同的分析具有不同的预测的可能性。然而，通过使用多种生物信息学工具进行每次分析所提供的再现性确保了结果的精密度和准确度。本研究中使用的工具包括SIFT、PolyPhen 2、PhD-SNP、Musite、I-MUTANT、ConSurf等。在207个已鉴定的nsSNP中，PhD-SNP、PANTHER、PolyPhen和SNP GO联合预测了4个 （ rs 1446644508 、 rs 1357922096 、 rs 1264999716 和 rs128246649）为致病性。然而，I-MUTANT和MuPro预测只有三个nsSNP的 结构 体系 受到 影响 。rs128246649具 有蛋 白水 解切 割位 点 ，而rs1446644508和rs1357922096发现于GULP1的高度保守区域。分子模拟分析所揭示的RMSD，RoG，PCA，和氢键的数量证实了这些发现。这类研究的主要局限之一是，确认的nsSNP需要实验验证。因为本研究仅预测可能致病的潜在nsSNP。在预测过程中，所使用的不同工具的固有局限性可能会影响结果，并可能改变结果的准确性。资金ON和SF部分由美国国立卫生研究院共同基金资助，资助号为5U24 HG 006941-09. TC是一个国际培训研究员由惠康信托基金（214205/Z/18/Z）支持。竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认NA.引用[1] 多霍良公司预测非同义单核苷酸多态性的功能后果。 Sci Rep 2017：1-18.[2] WangX，Tomso DJ，Liu X，et al.转录调控区的单核苷酸多态性与环境响应基因的表达。到Xicol应用药理学2005;207：84[3] 作者：J. 有害人类SNP的鉴定和分析。JMol Biol2006;356：1263[4] Giacomini KM，Brett CM，Altman RB，et al.药物遗传学研究网络：从SNP发现到临床药物反应。《临床药理学与治疗》2007;81：328[5] SuHP，Brugnera E，Van Criekinge W，等.鉴定和表征CED-6是一种参与凋亡细胞吞噬的衔接蛋白。J Biol Chem 2000;275：9542-9.[6]LiuQA，Hengartner MO.人CED-6编码一个功能同源物，秀丽隐杆线虫吞噬蛋白CED-6 Curr Biol 1999;9：1347-50.[7] Smits E，Criekinge W Van，Plaetinck G，et al.秀丽隐杆线虫CED-6的人类同源物特异性促进凋亡细胞的吞噬作用，如Smits *，Wim van Criekinge *，GeertPlaetinck和Thierry Bogaert。CurrBiol1999;9：1351[8] 陈晓，孙春，陈强，等。凋亡吞噬通路与精神分裂症。PloS One 2009;4.[9] 黄庆春，黄润月，李刚，等。类风湿关节炎和骨关节炎中骨关节炎相关基因表达谱的比较。RheumatolInt 2008;28：697[10] Ma CIJ，Martin C，Ma Z，et al. Engulfment protein GULP is regulatoroftransforming growth factor-β response in ovarian cells. 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