基于反向疫苗学的登革病毒和人乳头瘤病毒16型疫苗设计与构建

医学信息学解锁19（2020）100343一种系统和反向疫苗学方法设计针对登革病毒1型（DENV-1）和人的新型亚单位乳头瘤病毒-16（HPV-16）Bishajit Sarkara，*，Md Asad Ullaha，Yusha Araf ba孟加拉国达卡萨瓦尔贾汉吉尔纳加尔大学生物科学学院生物技术和遗传工程系b孟加拉国锡尔赫特Shahjalal科技大学遗传工程和生物技术系A R T I C L EI N FO关键词：登革热疫苗人乳头瘤病毒分子对接抗原性疫苗学A B S T R A C T目前，登革热和宫颈癌是世界上最危险的两种疾病。登革热是由四种血清型的登革热病毒（DENV）- 1、2、3和4引起的，并且发现大多数人类宫颈癌病例是由人乳头瘤病毒16型（HPV-16）引起的。在本研究中，使用反向疫苗学的许多工具设计了潜在的基于表位的亚单位疫苗，靶向DENV-1的衣壳蛋白E和HPV-16的主要衣壳蛋白L1。反向疫苗学是一种基于基因组的疫苗设计方法，识别病原体的潜在抗原表位。获得目的蛋白序列后，测定其抗原性和理化性质。随后，预测可能的T细胞和B细胞表位，并在分析其抗原性、变应原性、毒性和保护性以及对接结果（与MHC I类和II类等位基因对接）后，选择最佳表位用于疫苗构建。此后，基于分析最初构建的six疫苗的对接结果（与各种MHC等位基因和TLR分子对接），选择两种最佳疫苗构建体（每种病毒一种）用于进一步分析。对两种最佳疫苗的对接复合物进行了分子动力学模拟，结果令人满意。最后，将构建的疫苗插入pET-19 b质粒载体中，转化大肠杆菌。coli菌株K12中进行了克隆。然而，可能需要对建议的疫苗进行更多的体外和体内研究，以对其进行适当的验证。1. 介绍登革热是人类最常见的节肢动物传播病毒感染类型。据估计，全世界每年约有5000万至1亿新病例。除登革热外，每年还记录了约25万至50万例登革出血热（DHF）新病例[1]。登革热和DHF由四种非常密切相关的登革病毒（DENV）血清型引起：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。然而，它们的大多数抗原决定簇部分彼此相当不同;因此，针对病毒的一种血清型的疫苗接种不能为其他血清型提供保护性免疫[2]。登革热是由一种叫做埃及伊蚊的蚊子传播的。这种白天叮咬的蚊子是这种病毒的载体。登革热在除欧洲以外的世界各大洲流行，目前世界上几乎三分之二的人口生活在登革热的直接威胁之下。目前，世界上大约40%的登革热病毒的风险，每年全球发生5000万至大多数亚洲和东南亚国家是世界上登革热最流行的地区。根据欧洲疾病预防和控制中心的数据，孟加拉国2019年记录了101，354例病例，与2018年相比增加了约10倍。2019年，包括柬埔寨在内的其他亚洲国家的登革热病例也大幅增加，Sri 兰卡， 和 越南 （https://www.ecdc.europa.eu/en/dengue-monthly.于二零二零年二月十三日查阅）。登革病毒是黄病毒科的一员，当蚊子叮咬并从人体抽血时感染人体它含有一种称为NS1的抗原，这是登革热表现的最重要抗原。因此，目前正在开发靶向NS 1抗原的疫苗构建体以对抗登革热[5然而，也可以发现关于这些登革热疫苗的失败的报道，这些疫苗多年来引起了很大的争议[8，9]。登革热包膜蛋白E或* 通讯作者。电子邮件地址：sarkarbishajit@gmail.com（B.Sarkar）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100343接收日期：2020年3月4日;接收日期：2020年4月24日;接受日期：2020年2020年5月16日网上发售2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuB. Sarkar等人医学信息学解锁19（2020）1003432图1.一、本研究采用分步程序设计基于表位的亚单位疫苗。B. Sarkar等人医学信息学解锁19（2020）1003433包膜糖蛋白E是DENV包膜的必需蛋白。这种蛋白质与另一种称为前膜蛋白（prM）的蛋白质一起，在病毒组装、成熟和诱导潜在免疫中起着非常重要的作用[10，11]。因此，靶向DENV包膜蛋白E可能是开发抗DENV疫苗的潜在途径。宫颈癌是世界上每年导致数百万妇女死亡的主要癌症之一。它是由人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染引起的[12]。HPV是最常见的传播病毒，在性交过程中通过皮肤接触传播。到目前为止，在人类中已经发现了100多种HPV。其中，30种HPV类型是生殖器和粘膜HPV病毒。HPV-6、11、72、81等被分类为低风险HPV类型，HPV-16、18、31、33、35等被分类为高风险HPV类型。HPV 16、18、31、33、35型是导致宫颈癌的主要原因[13在这些HPV类型中，HPV-16与HPV-18一起负责大多数宫颈癌。HPV-16也是一些其他类型的癌症如口咽癌的原因[17，18]。事实上，50%的宫颈癌和90%的肛门生殖器癌和口咽癌病例是由HPV-16引起的。该病毒含有两种类型的衣壳蛋白：例如，主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。 这两种蛋白共同形成一个55 nm的二十面体衣壳。主要衣壳蛋白含有许多可用作疫苗的潜在靶标的表位[19]。由HPV引起的宫颈癌是最普遍的在南美和非洲国家。在报告宫颈癌病例最多的一些非洲国家，政府报告了每10万名妇女的年龄标准化宫颈癌发病率。56.3左右。 然而，在一些亚洲国家，如印度，孟加拉国、缅甸和越南，这一比率在30左右，远远大于世界上许多其他国家[20]。有一些商业疫苗已经可用于HPV-16，靶向病毒的整个L1蛋白。然而，这些商业疫苗主要基于病毒样颗粒（VLP）[21本研究利用HPV-16 L1蛋白可能的表位序列构建了比VLP疫苗更具特异性和抗原性的HPV-16 L1表位疫苗。在该实验中，使用反向疫苗学和生物信息学的不同工具，靶向DENV包膜蛋白E和HPV-16主要衣壳蛋白L1的许多表位，开发了针对DENV- 1和HPV-16的潜在疫苗。近年来，随着计算机软件和工具的发展，计算方法已广泛应用于肿瘤生物学、基因组学、蛋白质组学、表观基因组学、药物设计、疫苗设计、个体化医学、合成生物学等领域，并在疫苗设计中发挥了重要作用。近年来，免疫信息学和反向疫苗学在设计不同类型的疫苗中得到了充分利用[23反向疫苗学方法可以被定义为疫苗开发的潜在过程，其中通过分析特定病原体或病毒的基因组信息来鉴定病毒或病原生物体的新抗原。在这种方法中，生物信息学的工具被彻底用于通过解剖基因组来鉴定新抗原。随后，所选择的抗原用于疫苗构建。疫苗开发的反向疫苗学方法有助于理解和鉴定在疫苗开发期间应给予更高优先级的病原体的抗原片段。为了开发新的候选疫苗，将免疫遗传学和免疫基因组学与生物信息学结合起来这种方法是一种快速，简单，有效和具有成本效益的方法来设计可能的疫苗[27，28]。寨卡病毒、基孔肯雅病毒等成功地设计了一个疫苗学方法[29]。在我们的研究中，利用反向疫苗学和免疫信息学的许多工具来设计针对DENV-1和HPV-16的基于表位的亚单位疫苗。虽然这两种病毒彼此无关，但在研究中使用这两种病毒来设计针对每种病毒的单独疫苗。本研究中使用的疫苗开发过程的流程图见图1。1.一、2. 材料和方法2.1. 菌株鉴定和选择通过分析NCBI的国家生物技术信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库的不同条目来鉴定和选择病毒的菌株。2.2. 蛋白质序列从UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库检索DENV-1包膜蛋白E序列（登录号：Q8 BE 39）和HPV-16主要衣壳蛋白L1（登录号：Q9WLQ 6）。2.3. 蛋白质序列通 过 抗 原 性 分 析 在 线 服 务 器 VaxiJen v2.0 （ http ： www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）进行蛋白质序列的抗原性预测，将阈值保持在0.4 [30通过EXPASy的在线工具ProtParam（www.example.com）确定蛋白质序列https://web.expasy.org/protparam/2.4. T细胞和B细胞表位预测使 用 在 线 表 位 预 测 服 务 器 Immune Epitope Database 或 IEDB（www.example.com）预测T细胞和B细胞表位https://www.iedb。org/）。IEDB是包含大量关于T细胞表位和抗体的实验数据的数据库，并且这些数据是从对人、非人灵长类动物和其他动物进行的实验中收集的。它是一个服务器，允许在一些工具的背景下对许多表位进行鲁棒分析，群体覆盖率、抗原之间的保守性和具有相似序列的簇[34]。的MHC I类限制性CD8T淋巴细胞（CTL）表位使用HLA-A*11-01等位基因的NetMHCpanEL 4.0预测方法获得所选序列，保持序列长度9. MHC Ⅱ类限制性CD4 + T淋巴细胞（HTL）表位使用Sturniolo预测方法获得HLADRB 1 *04-01等位基因，保持序列长度为12。根据百分位数评分和抗抗原性评分（AS），选择前40个MHC I类表位中的20个。根据B细胞淋巴细胞（BCL）表位的长度（选择长度超过10个氨基酸的序列）选择BCL表位，并使用BepiPred线性表位预测方法获得。2.5. 表位的跨膜拓扑结构及抗原性预测所选表位的跨膜拓扑结构使用蛋白质螺旋的跨膜拓扑结构测定，TMHMM v2.0服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。服务器预测该表位是否是B. Sarkar等人医学信息学解锁19（2020）1003434�它可以是跨膜肽，或者它将保留在膜的内部或外部[35]。使用VaxiJenv2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）服务器预测所选表位的抗原性[30，31]。2.6. 表位的致敏性和毒性预测使 用 两 种 在 线 工 具 AllerTOPv2.0 （ https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/） 和 AllergenFP v1.0 （ http://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/ ） [36 ，37]。然而，AllerTOP预测的结果被优先考虑，因为与AllergenFP服务器（87.9%）相比，该服务器具有更高的准确性（88.7%）[36]。通过ToXinPred服务器（http://crdd.osdd.net/raghava/toX inpred/）使用基于支持向量（SVM-Swiss-Prot）的方法进行所选表位的遗传性预测，将所有参数保持为默认值。2.7. 水利预测和人口覆盖分析使用IEDB服务器（http：//too www.example.com）的“表位保护性分析”工具进行所选表位的保护性分析ls.iedb.org/conservancy/download/[ 34 ] 。 序 列 同 一 性 阈 值 保 持 为“50”。对于DENV-1表位的保守性分析，使用来自其他类型的登革病毒DENV 2、3和4（UniProt登录号分别为：Q8 BE 39、Q66394、Q7 TGD1、Q7 TGC 7）的包膜蛋白E进行比较。由于100%保守的序列用于疫苗构建，因此构建的疫苗还可以赋予针对DENV血清型2、3和4以及DENV-1的免疫性。此外，为了确定HPV表位的保守性，使用来自五种不同类型的HPV病毒一一11、92、16、32、57 b（UniProt登录号分别为：P04012、Q8B5B0、Q9WLQ6、P36737、P89427）的主要衣壳蛋白L1进行比较。与DENV疫苗一样，HPV-16的100%保守表位用于HPV疫苗构建;因此，这些疫苗也可能提供对HPV-11，92，16，32和57 b以及HPV-16的潜在免疫力。对于人口覆盖率分析，人口覆盖率计算-使 用 IEDB 服 务 器 （ http://tools.iedb.org/population/ ） 的 查 询 工 具[34]。使用为分子对接研究选择的表位，对世界上的几个种族群体和人口统计区域进行覆盖率分析。通过抗原性、致敏性、毒性和保守性分析，筛选出最佳表位，为进一步分析和疫苗构建奠定基础。显示高抗原性、非变应原性、非特异性和100%保守性以及超过50%最小同一性的表位被认为是最佳选择的表位。2.8. MHC等位基因MHC等位基因的聚类分析有助于鉴定具有相似结合特异性的MHC I类和 II 类 分 子 的 等 位 基 因 。 通 过 在 线 工 具 MHCcluster 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/MHCcluster/）进行MHC等位基因的聚类分析[38]。在分析过程中，待包括的肽的数量保持在50，000，自举计算的数量设置为100，并且选择所有HLA超型代表（MHC I类）和HLA-DR 代 表 （ MHC II 类 ） 。 为 了 分 析 MHC I 类 等 位 基 因 ， 使 用NetMHCpan-2.8预测方法。服务器以MHC特异性树和MHC特异性热图的形式生成结果。2.9. 产生所选表位使用3D结构生成工具PEP-F0 LD 3（http：//bioserv. rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3/）。该服务器是用于生成肽的从头3D结构的工具[392.10. 选定表位通过在线对接工具PatchDock（https://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/）进行所选表位的分子对接PatchDock包含将分子的Connolly点表面表示划分为凹、凸和平坦补丁的算法。此后，匹配互补块以生成潜在的候选变换。然后对每个候选变换进行评分，最后对候选解进行RMSD（root mean squaredeviation）聚类评分，剔除冗余解，得分最高的解成为最优解.通过PatchDock 对 接 后 ， 对 接 结 果 由 FireDock 服 务器（http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/FireDock/）灵活地细化并重新评分。FireDock服务器根据PatchDock服务器的最佳解决方案的细化生成全局能量，并根据全局能量对它们进行排名，最低的全局能量总是可观的[42-45 ]。使用HLA-A*11-01等位基因（PDB ID：5 WJL）和HLA-DRB 1 *04-01（PDB ID：5 JLZ）作为参考进行分子对接实验。受体和配体是最佳选择的MHC-I和MHC-II表位。两种病毒的表位（遵循高抗原性、无致敏性、无毒性和100%保守性的选择标准的表位从RCSB-蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）服务器下载受体。使用Discovery Studio Visualizer可视化最佳结果[46]。版本4.1 Alfreys Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州）[47].2.11. 疫苗构建构建了针对每种病毒（DENV-1和HPV-16）的三种疫苗。为了构建疫苗，将最佳选择的CTL、HTL和BCL表位组合在一起。所有疫苗均按照佐剂、PADRE序列、CTL表位、HTL表位和BCL表位的顺序构建。三种不同的佐剂序列用于疫苗构建，即，β-防御素、L7/L12核糖体蛋白和HABA蛋白（M.结核病，登录号：AGV15514.1）。β-防御素佐剂可以通过作为激动剂激活Toll样受体（TLR）1、2和4，并且L7/L12核糖体蛋白和HABA蛋白都具有激活TLR-4的能力。针对每种病毒的三种疫苗仅在其佐剂序列上彼此不同。针对每种病毒构建了三种疫苗，以确定具有最佳佐剂序列（通过分子对接）的两种最佳疫苗（每个病毒组一种），其可能引发潜在的免疫原性应答。在疫苗构建期间，使用不同的接头，即，EAAAK接头用于偶联佐剂和PADRE序列，GGGS接头用于连接PADRE序列与CTL表位以及CTL表位与其它CTL表位，GPGPG接头用于连接CTL与HTL表位以及HTL表位之间，KK接头用于偶联HTL和BCL表位以及BCL他们之间的关系[48PADRE序列改善了含有它的疫苗的CTL应答[56]。本实验共构建了6株B. Sarkar等人医学信息学解锁19（2020）10034352.12. 构建疫苗再 次 通 过 在 线 服 务 器 VaxiJen v2.0 （ http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）确定构建的疫苗的抗原性。预测阈值保持在0.4[30AlgPred（http://crdd.osdd.net/raghava/algpred/）和AllerTopv2.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）用于预测疫苗构建体的变应原性。AlgPred服务器基于蛋白质的任何已知区域的已知表位的相似性来预测可能的过敏原[57]。MEME/MAST基序预测方法用于AlgPred对疫 苗 的 变 应 原 性 预 测 。 此 外 ， 在 线 服 务 器 ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）检查了疫苗的许多理化性质[33]。2.13. 疫苗构建体的二级和三级结构预测使用在线工具PRISPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）生成疫苗构建体的二级结构。PRISPRED是一种简单的二级结构生成器，可用于预测跨膜拓扑结构、跨膜螺旋、折叠和结构域识别等以及二级结构预测[58，59]。使用PRISPRED 4.0预测方法预测疫苗蛋白的二级结构。通过另一种在线工具NetTurnP v1.0（www.example.com）确定疫苗的β折叠结构http://www.cbs.dtu.dk/services/NetTurnP/[60]。使用在线工具RaptorX（http://raptorx.uchicago.edu/）服务器生成疫苗的三级或3D结构。该服务器是一个完全注释的工具，用于预测蛋白质结构以及属性和接触预测，序列比对等[61通过Discovery Studio Visualizer可视化疫苗构建体的3D结构[46]。版本4.1Alfreys Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州）[47].2.14. 3D结构细化和验证使用在线细化工具3Drefine（http://sysbio.rnet.missouri.edu/3Drefine/）细化构建的疫苗的3D结构该服务器是一个快速，简单和有效的蛋白质结构优化工具[64]。然后通过分析Ramachandran图验证疫苗蛋白，使用在线服务器PROPERTIES （ https://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/ ） 生 成[652.15. 疫苗蛋白二硫键工程通过在线工具Disulfide by Design 2 v12.2（www.example.com）进行疫苗蛋白二硫化物工程化http://cptweb.cpt.wayne。edu/DbD2/）。进行二硫键工程以提高蛋白质的稳定性。服务器预测一个与六个选择的MHC等位基因对接以测试它们的结合亲和力。例如，DRB 1 *0101（PDB ID：2FSE）、DRB 3 *0202（PDB ID：1A6A）、DRB 5 *0101 （ PDB ID ： 1H15 ） 、 DRB 3 *0101 （ PDB ID ：2Q6W）、DRB 1 *0401(PDB ID：2SEB）和DRB 1 *0301（PDB ID：3C5J）。此外，研究表明，存在于免疫细胞上的TLR-8负责介导针对RNA病毒的免疫应答，而免疫细胞的TLR-3介导针对DNA病毒的免疫应答[70DENV-1是一种RNA病毒，HPV-16是一种DNA病毒[73，74]。因此，DENV-1的疫苗构建体也与TLR-8（PDB ID：3 W3 M）对接，HPV-16的疫苗构建体与TLR-3（PDB ID：2A 0 Z）对接。对接由三个不同的在线服务器进行 三次 ， 以 提 高对 接 的 准确 性 首 先， 对 接 是由 XNUMX Pro 2.0（https：//cluspro.bu.edu/login.php）进行的服务器基于它们的能量分数对对接复合物的簇进行排名，其中较低的能量分数对应于较好的结合亲和力[75RISK Pro服务器根据以下等式：E1/40.40Ereptum （ -0.40Eatt ） 1.00EDARS （ Kozakov 等 人 ， 2017;Kozakov等人，2013年度）此后，对接再次由PatchDock（https：bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/）执行，并且随后由FireDock服务器 （ http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/FireDock/ ） 改 进 和 重 新 评 分 。FireDock服务器根据它们的全局能量对对接的复合物进行排名，分数越 低 表 示 结 果 越 好 [42 最 后 ， 使 用 HawkDock 服 务 器（cadd.zju.edu.cn/hawkdock/）进行对接还使用HawkDock服务器进行了分子力学/广义玻恩表面积（MM-GBSA）研究。根据服务器，较低的分数和较低的能量对应于较好的分数[78HawkDock服务器生成停靠复合体的几个模型，并通过按升序分配HawkDock分数来对于每种疫苗及其各自的靶标，采用模型1的评分进行分析。此外，还分析了每个复合物的模型1，用于HawkDock服务器进行的分子力学/广义出生表面积（MM-GBSA）研究。从对接实验中，两种最好的疫苗（一种来自病毒类别）进行进一步分析。与TLR对接的最佳疫苗由Discovery StudioVisualizer可视化[46]。版本4.1Alfreys Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州）[47].2.17. 分子动力学模拟研究通过在线服务器iMODS（http://imods.chaconlab.org/）对最佳疫苗（一种来自DENV-1的疫苗和一种来自HPV-16的疫苗）进行分子动力学模拟研究。该服务器是一个快速，用户友好和有效的分子动力学模拟工具，可用于研究蛋白质复合物的结构动力学和稳定性。服务器提供变形能力的值，B-改造二硫键、链内、链间和Cβ，因素（移动性配置文件），特征值，方差，协方差图和弹性网络 对于复合物或蛋白质，变形性取决于甘氨酸残基。χ3角保持在-87°或-97° 10，C α-C β-S γ角保持在114.6 °10.2.16. 蛋白质对接在蛋白质-蛋白质对接中，通过与各种MHC等位基因和TLR对接来分析构建的DENV-1和HPV-16疫苗的结合亲和力。根据对接实验中的优异表现，从两个疫苗组中选出一个最佳疫苗。当病毒感染发生时，病毒颗粒或抗原被MHC复合物的各个部分识别。MHC分子的这些部分由不同的等位基因编码。因此，疫苗应该对由不同等位基因编码的这些MHC部分具有良好的结合亲和力[69]。所有的疫苗结构在每个氨基酸残基处变形的能力。本征值与使给定结构变形所需的能量有关，较低的本征值对应于复合体更容易变形。此外，本征值还表示蛋白质复合物的运动刚度。该服务器是一个快速和简单的服务器，用于确定和测量蛋白质的灵活性[82为了分析疫苗-TLR 8（对于DENV-1）和疫苗-TLR 3（对于HPV-16）对接复合物的分子动力学模拟。将对接的PDB文件上传到iMODS服务器，并显示结果，同时将所有参数保持为默认值。B. Sarkar等人表1医学信息学解锁19（2020）1003436两种病毒蛋白的抗原性预测及理化性质分析。AN;抗原性，AI;脂肪指数，GRAVY;亲水性总平均值。蛋白质名称AN（阈值0.4）数目的氨基酸分子量理论pIEX t。系数（单位：M-1cm-1）不稳定指数AI重力（17.60）（36.57）表2DENV-1包膜蛋白E和HPV-16主要衣壳蛋白L1的预测MHC I类表位列表抗原性评分。登革病毒1HPV 16表位开始端拓扑作为百分分数表位开始端拓扑作为百分分数VTNPAVLRK5058内部0.9660.01TTYKNTNFK353361内部0.9390.01TTIFAGHLK276284内部0.8970.02YTFWEVNLK444452内部0.8620.04KALKLSWFK385393内部0.7090.13ISGHPLLNK117125外面0.7730.09GSCVTTMAK2836内部0.6010.23TSDAQIFNK301309内部0.7500.1KIVQYENLK128136内部0.5870.24RIHLPDPNK7482内部0.7460.1PTLDIELLK3947外面0.4880.34YLPPVPVSK1220外面0.7030.14MVLLTMKEK1624内部0.4660.37ISTSETTYK348356内部0.6640.17SLITCAKFK112120内部0.4580.38TSSTSTTAK491499内部0.6370.21GTVLVQVKY318326内部0.4320.35YVARTNIYY2735内部0.6180.22ALKLSWFKK386394内部0.4160.47STSTTAKR493501内部0.5280.3CTGSFKLEK302310内部0.4030.49TSQAIACQK422430内部0.4700.37GGVFTSVGK426434外面0.3250.66RLLAVGHPY4149外面0.3750.54LTWLGLNSR463471外面0.2890.78AANAGVDNR136144内部0.3360.63伊芙琴基129137内部0.2880.78VGHPYFPIK4553外面0.1811.3TTSQETWNR225233内部0.2820.80NTNF密钥357365内部0.1481.5KLEGGIVQY124132内部0.2820.81SGLQYRVFR6674内部0.1231.7YIVVGAGEK277385内部0.2590.87FVTVVDTTR330338内部0.0832.2FSGVSWTMK448456外面0.2380.94TTAKRKKRK496504外面0.0642.6ISNTTTTDSR6573内部0.1421.5PIKKPNNNK5159内部0.0642.6公司简介429437外面0.0353.5DSLFFYLRR244252外面0.0443.22.18. 密码子适应和计算机克隆在密码子适应中，最好的疫苗构建体被反向翻译成可能的DNA序列，然后根据所需的生物体来适应DNA序列，使得该特定生物体的分子机制可以有效地使用适应的DNA序列的密码子，并提供所需产物的更好的生产。密码子调整是电子克隆的必要步骤，因为相同的氨基酸在不同的生物体中可以由不同的密码子编码（密码子偏好性）。此外，一个有机体的细胞机制可能与另一个有机体完全不同。因此，一种生物体中特定氨基酸的密码子可能在另一种生物体中不起作用。因此，密码子适应预测了可以在特定生物体中编码特定氨基酸的合适和最佳密码子[87，88]。通过Java密码子适应工具或JCat服务器（http://www.jcat.de/）将最佳选择疫苗的预测蛋白质序列用于密码子适应[87]。真核E.大肠杆菌K12菌株进行rho非依赖性转录，避免了限制性内切酶的启动子、原核核糖体结合位点和SgrA1和SphI切割位点。在JCat服务器中，蛋白质序列被反向翻译为优化的可能的DNA序列。然后取优化的DNA序列，并分别在N-末端和C-末端位点缀合SgrA1和SphI限制性位点。最后，使用SnapGene限制性克隆模块将新适应的DNA序列插入pET-19 b载体的SgrA 1和SphI限制性位点之间[89]。3. 结果3.1. 病毒的选择和病毒蛋白两种病毒，在实验中选择DENV-1和HPV-16作为疫苗设计的通过分析来自国家生物技术信息中心或NCBI数据库的大量数据来选择病毒。选择DENV-1包膜蛋白E和HPV-16主要衣壳蛋白L1作为靶蛋白。这些蛋白质的氨基酸序列为：3.1.1. 登革病毒1型包膜蛋白E（登录号：Q8BE390）MRCVGIGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTL-DIEL-LKTEVTNPAVLRKLCIEA-KISNTTTTDSRCPTQGEATLVEEQDANFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKG-SLITCAKFKCVTKLEGKIVQYEN LKYSVIVTVHTGDQHQVGNES-TEHGTTATITPQAPTSEIQLTDY-GALTLDCSPRTGLDFNEMVLLTMKEKSWLVHKQWFLDLPLPWTS-GALTLDCSPRTGLDFNEMVLLTMKEKSWLVHKQWFLDLPLPWTS-GALTLDCSPRTGLDFNEMVLLTMKEKSWLVHKQWFLDLPLPWTSATTSQETWNRQDLLVTFKTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGA-TEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYVMCTGSFKLEKE-VAETHAN@HGTVLVQVKYEGTDAPCK-IPFSTQDEKGVTQNGRVITANPIVTDKEKPVNIEAEPPFGESYIVVGAGE-KALKLSWFKKG-STIGKMFEA-登革病毒1型包膜蛋白E抗原49553776.927.5167670稳定85.62-0.043人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1抗原50556278.198.5572030稳定74.51-0.347B. Sarkar等人医学信息学解锁19（2020）1003437--表3DENV-1包膜蛋白E和HPV-16主要衣壳蛋白L1的预测MHC II类表位列表抗原性评分。登革病毒1HPV-16表位开始端拓扑作为百分分数表位开始端拓扑作为百分分数LLKTEVTNPAVL4556外面4.100.78FVRHLFNRAGAV256267外面3.402.10WFLDLPLPWTSG212223外面2.903.60PLELINTVIQD186197外面3.382.20VQVKYEGTDAPC322333内部2.704.00YRVFRIHLPDPN7081内部3.102.80VGNESTEHGTTA151162外面2.604.70VFRIHLPDPNKF7283外面2.983.30IQTSGTTTIFAG270281内部2.505.30公司简介390401内部2.903.60VVVLGSQEGAMH250261外面2.405.60YPDYIKMVSEPY231242外面2.206.90YGVLFSGVSWTM444455外面2.207.00MDFTTLQANKSE208219外面2.107.60TLDIELLKTEVT4051外面1.809.60RKFLLQAGLKAK466477外面2.008.20YSVIVTVHTGDQ137148内部1.7810TNIYYHAGTSRL3142内部1.809.80RLKMDKLTLKGM286297内部1.4013公司简介311322内部1.789.90VIVTVHTGDQHQ139150内部1.3014VRHLFNRAGAVG257268内部1.3014WVDVLEHGSCV2031外面1.2015LQFIYLCKITL372383外面1.2014WFKKGSTIGKMF391402内部1.1815公司简介415内部1.1815VLFSGVSWTMKI446457外面1.1016YFPTPSGSMVTS291302外面1.1016YENLKYSVIVTV132143内部0.98017TLQANKSEVPLD212223内部1.0017WTSGATTSQETW220231内部0.90018SMVTSDAQIFNK298309内部0.9018QETWNRQDLLVT228239内部0.70021LKKYTFWEVNLK441452内部0.8020WLGLNSRSTSLS465476外面0.60022公司简介370381外面0.7021KISNTTTTDSRCP6475内部0.50023YVARTNIYYHAG2728内部0.5822KIGIGVLLTWLG456463外面0.30025WNFGLQPPPGGT402413外面0.6022TARGARRMAILGDTAWDFGSIGGVFTSVGKLVHQIFG-TAYGVLFSGVSWTMKI-GIGVLLTWLGLNSRSTSLSMTCIAVGLVTLYLGVMVQA3.1.2. 人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1（登录号：Q9WLQ6）MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYY-HAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNNKILVPKVSGLQYRV-FRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGV-GISGHPLLNKLDDTENASAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPI-GEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLE-LINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICK-YPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPD-DLYIKGSG-STANLASSNYFPTPSGSMVTSDA-QIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSET-TYKNTNFKEYLRHGEYDLQFIYLCK-ITLTADVMTYIHSMN-STI-LEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTF-WEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTST-TAKRKKRKL3.2. 病毒蛋白序列发现两种选择的蛋白质都具有潜在的抗原性。两者具有相当相似的氨基酸数量（DENV-1 为495 个氨基酸，HPV-16 为505 个氨基酸）。DENV-1的分子量为53776.92，HPV-16的分子量为56278.19。DENV-1和HPV-16的消光系数分别为53776.92和56278.19，两者均具有较高的脂肪指数。此外，DENV-1的总平均亲水性（GRAVY）为0.043，HPV-16估计为0.347。抗原性和理化分析结果见表1。3.3. T细胞和B细胞表位预测和表位的拓扑确定通过IEDB服务器确定DENV-1和HPV-16的I类MHC的T细胞表位。服务器生成了100多个这样的表位。然而，基于分析抗原性评分（AS），根据百分位数评分，从前40个表位中选出20个潜在表位进行抗原性、变应原性、致敏性和保守性试验。服务器基于百分位分数的递增顺序对表位进行排名，并且较低的百分位分数总是对应于表位与其等位基因的良好结合亲和力DENV-1和HPV-16的MHC II类（HLA DRB 1*04-01等位基因）的T细胞由于几个表位产生了相似的AS评分以及百分位评分，因此仅从显示相似结果的表位组中选择一个表位。此外，使用IEDB服务器的BepiPred线性表位预测方法选择B细胞表位，并基于其较高的对所选表位的拓扑结构预测表明，超过一