医用增材制造技术在小直径血管生物打印中的研究综述

工程7（2021）832研究医用增材制造-综述小直径血管的生物打印Xia Cao#，Sushila Maharjan#，Ramla Ashfaq，Jane Shin，Yu Shrike Zhang医学工程部，医学系，布里格姆妇女阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2020年2月15日修订2020年3月6日接受2020年9月30日网上发售保留字：生物打印小直径血管Bioink血管工程A B S T R A C T对于用于再生医学和药物筛选的生物工程血管的需求一直在增加。然而，真正的生物工程血管移植物的可用性仍然有限。三维（3D）生物打印呈现了用于制造用于移植和再生的各种架构和尺寸的血管或血管化组织构建体的潜在方法。在这篇综述中，我们总结了不同血管的基本生物学，以及3D生物打印方法和生物墨水设计，这些方法和设计已被应用于制造血管和血管化组织结构，重点是小直径血管。©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍血管是将氧气和营养物质输送到组织并从组织中携带二氧化碳和废物的管道。动脉、毛细血管和静脉是三种主要类型的血管，它们在结构组成、尺寸和生理功能上不同[1]。根据内径（ID），血管大致分为ID小于1 mm的微血管、ID范围为1 - 6 mm的小血管和ID大于6 mm的大血管[2，3]。主动脉是人体内最大的血管;它将含氧血液从心脏输送到身体的不同部位。主动脉分支成动脉，动脉进一步分成称为小动脉的较小血管。小动脉最终分支成微小的毛细血管;这些是最小的血管，允许氧气、营养物质、二氧化碳和其他代谢废物在血液和局部组织之间扩散[4，5]。微囊在小动脉和小静脉之间形成网络，后者是非常小的静脉，从毛细血管收集脱氧血液并将其输送到逐渐变大的静脉中，直到其重新进入心脏[6]。尽管动脉和静脉具有不同的功能，但它们的壁同样由不同成分的细胞和细胞外基质（ECM）组成，其分为三个主要层：最内层内膜、中膜和外膜。*通讯作者。电子邮件地址：yszhang@research.bwh.harvard.edu（Y.S. 张）。#这些作者对这项工作做出了同样的外膜（图1（a））[7，8]。毛细血管（ID 10l m）由单层内皮细胞（EC）组成，形成血管的内层（内膜），并被基底层和周细胞包围（图1（b））[9，10]。小动脉和小静脉（ID = 10-动脉和静脉（ID >100l m）由内部EC衬里（内膜）、中等密度的SMC层（中膜）以及成纤维细胞和ECM成分的外层（外膜）（图1（b））[10，11]。不同血管层及其细胞组成、直径、ECM组分和功能列于表1中[12，13]。内皮细胞和血管平滑肌细胞是动脉和静脉的关键细胞成分这些细胞类型的相互作用不仅在脉管系统的发育中起关键作用，而且在维持血管稳态中也起关键作用[14]。血管的EC衬里在表型和功能上具有显著异质性，这是由于它们在血流期间经历的不同微环境和不同水平的压力和剪切应力[15]。EC衬里用作严格调节的动态屏障，防止血液渗漏到周围组织和间隙中。它们还在几种生理过程中发挥关键作用，包括调节血流和渗透性、炎症部位循环免疫细胞的跨内皮迁移以及维持血管张力和止血[16，17]。虽然EC纵向排列，但SMC周向排列并由弹性纤维隔开平滑肌细胞具有收缩表型，通过主动收缩和舒张维持血管稳态此外，SMC拥有https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.03.0192095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engX. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832833图1.一、血管的一般结构和类型（a）动脉和静脉壁的不同层的示意图复制自Ref。[8]经玛丽·哈姆斯许可，©2015。（b）不同类型血管的示意图，显示细胞组成、直径和厚度。表中的条表示血管的不同层的相对毛细血管包括被周细胞包围的EC衬里微动脉/微静脉由EC衬里组成，EC衬里由平滑肌细胞（SMC）薄层包围动脉/静脉由被致密的SMC层和成纤维细胞包围的EC衬里组成复制自Ref。[10]经Nature许可，© 2018;和参考文献[11]经美国生理学会许可，Inc.，©1954年。表1血管的一般结构和功能[12，13]。血管壁层特征细胞ECM组分功能动脉/静脉外膜最外层，脉厚中间层，成纤维smc和弹性蛋白、I型和IV型胶原蛋白以及多功能蛋白聚糖弹性蛋白;纤维胶原I型，在细胞运输、免疫应答介导和血管重塑通过控制血管收缩媒体图尼卡动脉增厚比在静脉最里面，周细胞ECSIII和V;层粘连蛋白;纤连蛋白;和蛋白聚糖层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白和血管扩张提供血管的结构完整性内膜最薄层IV型和巢蛋白半透膜和耐热壁;也控制血流和血管张力毛细血管内膜极薄单层ECS层粘连蛋白、纤连蛋白、IV型胶原蛋白和蛋白聚糖提供了一种半透膜，用于氧气、营养物、二氧化碳和代谢废物在血液和局部组织环境分泌表型，负责ECM的合成和修复，从而调节血管壁的结构[18]。冠心病和外周动脉疾病是全球死亡和发病的主要原因，每年的死亡率估计增加到2330万到2030年[19]。血管成形术、支架植入术和外科搭桥术移植是目前常用的血运重建方法[20]。自体动脉或静脉的使用，胸廓内动脉或隐静脉仍然是用于治疗血管疾病如冠状动脉和外周血管疾病的旁路移植物的金标准[20]。然而，健康的自体血管并不总是可用的，X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832834需要侵入性采集，长期通畅率较差[21，22]。合成血管移植物（主要由聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚四氟乙烯制成）已被用作自体血管的替代品，用于成功置换中型和大型血管[23，24]。尽管这些合成移植物已被证明对具有长期通畅性的中、大血管有效，但由于生物力学性能不匹配、生物相容性差、血管壁厚度低和血管壁厚度低，它们在小血管中的应用有限相容性、血栓形成性、微生物污染，表2理想的生物工程小直径血管的要求。复制自Ref。[25]在瓦伦蒂娜·卡托等人的许可©2014年。要求生物相容性无毒性无免疫原性无血栓形成对感染维持功能性内皮和通畅率差[25考虑到目前血管管道的局限性和小直径血管包括冠状动脉和外周血管力学性能顺应性与自体血管相似爆破压与自体血管相似扭结和抗压性良好缝线固位由于小直径血管的存在，临床上对具有降低与小直径血管疾病相关的发病率的潜力的生物工程血管导管存在持续的需求[28]。随着在血管生物工程，三维（3D）生物打印已经成为用于生成具有在体内生长、重塑和修复血管疾病的能力的血管的潜在方法。在过去的几年里，人们已经研究并建立了不同的3D生物打印技术和策略来制造仿生血管，并不断进行改进和改进[29-32]。在这篇综述文章中，我们总结了不同的生物打印技术，包括挤出生物打印，喷墨生物打印，激光辅助生物打印和基于还原聚合的生物打印，应用于小直径血管的工程，包括小血管和微血管，以及它们的优势和局限性。 我们还讨论了不同的生物材料及其与生物相容性，可打印性和机械性能相关的特性，以及满足小直径血管3D生物打印关键要求的适当生物油墨配方所面临的挑战。我们总结了未来的潜在方向。2. 3D生物打印3D生物打印在血管组织工程领域取得了重大进展长期通畅的血管工程的基本要求包括适当的机械性能、高顺应性、重塑能力和抗血栓形成性，以实现与自体血管的成功整合[33]。理想的生物工程血管的要求-特别是小直径血管-列于表2中[25]。3D生物打印允许生物材料和活细胞（统称为“生物墨水”）以精确定义的空间模式精确沉积，这些空间模式通过生物打印的血管组织工程已经通过各种模式和策略以及广泛的生物墨水实现[24]。最常用的生物打印方式包括喷墨[35]、挤出[36，37]、激光辅助[38]和基于桶聚合的生物打印[39，40]。喷墨方法是一种非接触式生物打印技术，它从墨盒中沉积预定尺寸的生物墨水液滴，以生成伪3D或3D结构（图1）。 2（a））[31，41]。挤出生物打印是最常用的生物打印方法，其中生物墨水通过喷嘴以细丝的形式连续分配（图1A）。 2（b））[31，42]。激光辅助生物打印比喷墨和挤出相对不太常见，并且使用激光脉冲将生物墨水从供体载玻片沉积到受体基底上（图2（c））[31，43，44]。基于还原聚合的生物打印，通常以立体光刻或数字光处理的形式，使用精确控制的光图案在垂直可移动的平台上照射光敏聚合物，以创建具有所需架构的3D结构（图11）。 2（d））[45，46]。每种方式都有其优势和局限性，几个参数，例如生物墨水和所用基底的选择、图案的复杂性和制造的产率[47]。喷墨可加工性低制造成本无菌或可灭菌易于储存可随时提供各种长度和直径生物打印提供了几个优点，包括快速的生物墨水沉积和高分辨率;然而，由于分配层的不稳定性，它通常具有有限的容量[48，49]。挤出生物打印是一种易于控制的具有成本效益的方法。然而，这是一种相对较慢的方法，分辨率较低[50]。激光辅助生物打印提供快速制造、高分辨率和生物相容性，但仪器成本高[51]。基于还原聚合的生物打印还提供了高分辨率和快速制造，具有中等复杂性的仪器[52]。根据血管的不同形状和大小，不同的3D生物打印模式已被应用于体外制造具有不同功能程度的脉管系统（图2（e））[5]。3. Bioink设计为了发挥功能，生物工程脉管系统的结构和完整性必须类似于天然血管的结构和完整性，两者都高度依赖于来自周围ECM的机械和化学线索[53]。ECM作为各种细胞因子和生长因子的储存库和调节剂，以及在血管形成期间为EC组织和稳定提供结构支持[54]。因此，ECM特性（如密度、异质性和硬度）在调节血管形态发生、毛细血管网络形成和屏障完整性方面发挥关键作用[55，56]。构成不同血管层的主要ECM组分见表1[12，13]。 血管管腔内衬EC，其位于基底膜上，基底膜主要由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和其他大分子组成[54，57]。中膜（中间SMC层）由胶原ECM组成，包含纤维状胶原I、III和V;层粘连蛋白;弹性蛋白;纤连蛋白;透明质酸;和核心蛋白聚糖[58-60]。内膜和中膜由内弹性膜分隔。外膜是结缔组织和成纤维细胞的最外层，由弹性蛋白、I型和IV型胶原蛋白以及多功能蛋白聚糖组成中膜和外膜由外弹性膜隔开[57，59为此，血管的成功体外制造，特别是那些具有小直径的血管，需要更高分辨率的生物打印方法和足够的生物墨水制剂之间的协同作用，所述生物墨水制剂可以提供结构和机械支持以维持细胞活力，同时促进移植或新血管形成[62]。生物墨水是生物材料、细胞、营养素和/或生长因子的组合，其应模拟组织的最佳ECM环境[63]。生物墨水的设计应该考虑主要的ECM成分，并且对于血管的3D生物打印至关重要，因为它不仅决定生物打印的性能，X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832835图二、代表性的3D生物打印方法。（a）喷墨生物打印方法的示意图（b）挤出生物打印方法的示意图（c）激光辅助生物打印方法的示意图（(d)基于瓮聚合的生物打印方法的示意图。复制自Ref。[46]经马宣义等人许可©2016. （e）显示血管层次结构和目前用于制造各种不同血管的生物打印技术的示意图复制自Ref。[5]经Elsevier许可，©2019。分辨率，以及血管完整性和其他关键生物学特性[64用于血管的3D生物打印的生物墨水的最流行的配方是基于水凝胶前体，这是由于其优异的生物相容性、可调的刚度和孔隙率、以及模拟天然ECM的能力，以及其与不同生物打印模式的相容性[67]。已经研究了几种天然和合成生物材料，单独或组合，用于设计类似于ECM的物理化学性质的生物墨水。已广泛用于体外血管组织工程的天然生物材料包括明胶[68-[2019 - 04 - 19][2019 - 04][2019 - 19][2019 - 04][2019 - 05][201基于天然生物材料的水凝胶为细胞粘附、生长和增殖提供了合适的微环境;最重要的是，它通常不会引起慢性炎症或对宿主的毒性[74]。然而，天然来源的水凝胶的弱机械强度不能承受生理压力，因此限制了它们在血管组织工程中的使用[94]。因此，已经研究了各种合成聚合物，与天然生物材料组合，用于此类应用，因为它们具有精确控制的机械性能、孔隙率、再现性、结构多样性、刚度和生物降解性[95]。常用的合成聚合物包括聚（乙二醇）（PEG）[96，97]、聚（甲基丙烯酸羟乙酯）[98]和聚（乙烯醇）（PVA）[99，100]。这些复合材料可以提供良好的机械性能，支撑并增加印刷结构的机械强度。然而，合成聚合物的应用受到限制，因为它们缺乏生物相容性，细胞粘附性差，释放有毒副产物，并且由于降解过程而降低机械性能[47]。为了克服这些限制并获得具有所需性质的生物墨水，已经使用基于化学、机械、物理和生物修饰的不同方法探索了官能化。最常用的功能化方法之一是将甲基丙烯酰基引入聚合物，如明胶[101该方法产生可光聚合的聚合物，其在需要时可形成机械稳定的构造。这些聚合物的机械强度主要取决于甲基丙烯酰改性程度和光暴露，甲基丙烯酰改性程度越高，光暴露时间越长，结构刚度越高，降解越少[110]。应用两种或多种交联机制可显著提高结构完整性和机械强度[110，111]。例如，当使用维生素B2（核黄素）共价交联脱细胞ECM（dECM）生物墨水[112]，然后通过胶原原纤维生成进行热触发物理交联[113]时，实现了改善的机械性能。与单独交联的结构相比，这种两步交联机制表现出优越的储能模量，表明每种交联机制都有助于整体X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832836··结构的机械性能[113]。另一方面，组合生物墨水材料可以实现相同的现象。 例如，向甲基丙烯酰明胶（GelMA）中添加明胶可增加交联度，从而提高机械性能[114]。此外，当掺入其他聚合物，例如甲基纤维素[115]、4臂PEG-四丙烯酸酯（PEGTA）[110]、具有三季戊四醇核的8臂PEG-丙烯酸酯（PEGOA）[116]、透明质酸[117]、PVA[118]或羟基磷灰石[119]时，它们可以增强生物打印后的可打印性和/或改善形状保真度。此外，各种生物活性材料如纤维蛋白（或纤维蛋白原和凝血酶）和聚赖氨酸已被添加到生物墨水中，用于诱导或增强其生物活性。纤维蛋白原是纤维蛋白原的聚合物，在凝血酶存在下形成纤维状、粘弹性和多孔水凝胶，已证明可改善生物墨水的生物相容性和生物活性[120]。带正电荷的聚赖氨酸也被用于通过增加与带负电荷的细胞膜的静电相互作用来增强细胞粘附[121]。类似地，非粘附性水凝胶的生物化学性质已经通过用粘附性肽配体对其进行修饰而得到改善。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽是最常用的肽配体，在细胞粘附、扩散和迁移中起关键作用[122]。例如，与没有 RGD 修 饰 的 那 些 相 比 ， 与 RGD 肽 缀 合 的 PEG- 二 丙 烯 酸 酯（PEGDA）水凝胶增强了细胞的粘附[123]。进一步证明了在植入的PEGDA水凝胶上包含RGD肽在体内调节细胞粘附、炎症、纤维包裹和血管形成[123]。还将RGD肽引入各种其他水凝胶形成聚合物中，如透明质酸[123]、藻酸盐[124]、壳聚糖[125]和PEG[126]水凝胶，以改善细胞行为。几种生长因子如成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子-α（TGF-α）和TGF-β已被鉴定为血管生成的诱导剂。例如，FGF-2[127]和VEGF[128]是刺激EC增殖、运动和分化的血管形成的关键介质[129]。VEGF被物理包埋在PEG水凝胶中，以响应细胞分泌的蛋白酶而释放，导致体外和体内研究中血管形成增强[130]。此外，在ECM蛋白质中发现了几个生长因子结合位点，如纤连蛋白[131]、纤维蛋白原[132]、腱生蛋白C[133]和玻连蛋白[134]。与这些ECM蛋白结合的VEGF已被证明可改善糖尿病伤口和骨缺损的愈合[135]。虽然其中一些策略可能尚未与生物墨水结合用于血管生物打印，但它们的适应似乎是自然的。最近，几项研究显示了改变的基质粘弹性对细胞行为的影响，包括通过改变聚合物的共价交联和/或浓度来调节丙烯酰胺水凝胶的损耗模量[136，137]，通过改变具有不同亲和力的共价交联剂来调节PEG水凝胶中的应力松弛[138]，或使用海藻酸盐水凝胶的共价和/或物理交联[139]。这些研究表明，改善的损耗模量和基质蠕变增强了二维（2D）培养中MSC的细胞铺展和成骨分化[136，137]，增强的基质应力松弛改善了2D培养中细胞的铺展和增殖[139]，并允许细胞适应3D培养中的生理相关形态[138]。类似地，证明了细胞在弹性和粘弹性水凝胶中的行为不同，并且生物材料的松弛行为随着时间的推移而改变。细胞的相互作用，改变细胞行为，包括扩散、增殖和分化[140]。发现MSC分化依赖于3D中水凝胶的初始弹性模量，而它对弹性水凝胶中的水凝胶刚度失去敏感性，表明细胞中应力松弛相对于ECM中的机械线索的重要性[141]。这些见解可能有助于血管生物墨水设计以改善细胞增殖和血管功能。4. 小直径血管生物打印的最新进展小血管包括小动脉和小静脉。通过毛细血管的血液流动由小动脉腔调节小静脉是最小的静脉，从毛细血管接收血液，并在血液和组织之间的氧气和营养物质交换中发挥重要作用[4]。使用手动方法通常难以构建小直径血管，包括小血管和微血管然而，利用生物打印的优势，可以获得更复杂和生理相关的小直径血管结构[46，142]。4.1. 挤压生物打印挤出生物打印是一种具有成本效益且常用的生物打印方法，其以与打印头的空间运动同步的方式逐层地从打印头分配生物墨水挤压式生物打印机通过喷嘴以气动或机械方式连续分配生物墨水，并与各种高粘度生物油墨[145]。藻酸盐已广泛用于血管组织构建物的挤出生物打印。例如，藻酸盐可以与同时递送的氯化钙（CaCl2）溶液在芯中物理交联，以确保生物打印的中空构造的结构保真度[89，146]。使用同轴喷嘴用藻酸钠溶液（3%、4%和5%w/v的去离子水溶液）中溶解的原代人脐静脉SMC（HUVSMC）生物打印可灌注的脉管系统导管，所述同轴喷嘴用外针（ID = 540μ m）和内针（ID = 250μ m）制造[147]。用海藻酸钠溶液（5%w/v）生物打印的血管导管和管腔直径分别为（1449 ±27）和（990 ± 16）μm。类似地，使用同轴螺旋桨辅助挤出生物打印方法，用L929小鼠成纤维细胞包封的海藻酸钠（2%-5%w/v）和CaCl 2（2%-同轴组件由外部内径为1600μ m的针和内径为510、410或330μ m的三种不同内针生物打印的中空纤维的尺寸根据内针的尺寸以及海藻酸钠和CaCl2的流速和浓度而变化。当使用海藻酸钠溶液（2%w/v，1 mL min-1流速）和氯化钙（4%w/v，2 mL min-1流速）时，发现生物打印的海藻酸盐中空纤维的平均内径和外径分别为892和1192μ在另一项研究中，使用具有同心针的多层同轴喷嘴和人脐静脉EC（HUVEC）和人间充质干细胞（hMSC）包封的生物墨水制造可透性血管组织构建体[110] 。本研究中的生物墨水由海藻酸钠（2%或3%w/v）、PEGTA（2%或3%w/v）和GelMA（5%或7%w/v）预聚物溶液组成。加入PEGTA以增强机械性能。X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832837图3.第三章。（a）小直径血管的同轴生物打印（I）多层同轴喷嘴和示意图，展示了各种空心管的制造(II)生物打印过程和血管床制造的示意图（III）显示具有不同直径的生物打印管的示意图和荧光显微照片（IV）在注射红色荧光微珠之前（插图）和之后生物打印管的荧光照片。(V)血管管状结构的共聚焦图像显示培养14天（上排）和21天（下排）后MSCs表达平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）和HUVEC表达分化簇31（CD 31）. 细胞核用4，0，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（b）（I）示出用于生物打印多层中空管的多通道同轴挤出系统的示意图。（II）双层中空管的代表性荧光显微照片（上排）和单层和双层中空管的横截面图（下排）（III）生物打印管的荧光显微照片，所述生物打印管由用绿色细胞追踪器标记的内部人尿路上皮细胞和外部人尿路上皮细胞组成。在第4天用红细胞示踪剂标记膀胱SMC（IV）显示HUVEC表达CD31（绿色）的免疫染色血管管的共聚焦显微照片，a- SMC的SMA（红色）（a）复制自Ref。[110]经Elsevier许可，©2016;（b）转载自参考文献[116]经Wiley许可，©2018。X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832838···生物打印的血管组织构建体的特性根据所使用的内针（ID = 0.159-生物打印的中空管的平均外径（OD）在约500至1500μ m的范围内，ID在400至1000μ m的范围内，并且壁厚在100至1000μ m的范围内厚度范围为60 - 280μ m。混合的生物墨水是显示支持包封的HUVEC和MSC在生物打印的血管构建体中的扩散和增殖，从而形成生理学相关的血管组织构建体（图3（a））[110]。最近，使用多通道同轴挤出系统进一步制造该系统由具有三个同心针（芯中的针（ID = 0.210 mm）、中层中的针（ID = 0.686mm）和外层中的针（ID =1.600 mm））的同轴喷嘴组成;由GelMA（5%或7% w/v）、海藻酸钠（2%或3% w/v）和PEGOA（1%或2%w/v）组成的生物墨水;待在中层中递送的HUVEC;以及待在外层中递送的SMC[117]。当使用具有最佳印刷适性的共混生物墨水（7%w/vGelMA、2%w/v藻酸盐和2%w/v PEGOA）时，测得内腔的平均直径为（663 ± 52）μm，而外腔的平均直径为（977 ± 63）μm。发现内壁和外壁厚度分别为（62 ± 10）和（94 ± 10）lm（图3（b））[116]。生物打印的血管组织表现出不同层和相应表型的细胞异质性，表明血管样组织的形成。在最近的一项研究中，使用三层同轴喷嘴（ID = 2.159/2.906/3.810mm）通过挤出生物打印制造包含内皮细胞和肌肉细胞层的小直径血管结构，其中HUVEC和人主动脉SMC（HAoSMC）封装在血管组织来源的ECM（VdECM，3% w/v）/藻酸盐（2% w/v）水凝胶中作为生物墨水[149]。 所得的内径约2 mm的管由以下组成：由较厚的HAoSMC层（800-1000 μ m）包围的薄HUVEC层（约50μ m）早熟血管植入大鼠腹主动脉21 d。血管移植物显示平滑肌层重塑和整合到宿主组织中，以及良好的通畅性和完整的类似地，使用3D打印的微流体共挤出装置，产生（265 ± 11）、（360 ± 11）或（448 ± 12）μmOD的长的可渗透藻酸盐管，其随后用共包封在基质胶（35%v/v）中的HUVEC和血管SMC（vSMC）接种[150]。结果显示，血管管具有正确的管腔结构，内有内皮细胞衬里，外有平滑肌细胞鞘。这些血管管表现出血管的功能特性，包括对血管收缩剂的反应的快速性、灌注性和收缩性另一项研究提出了小直径血管的同轴挤出打印，其中将人冠状动脉SMC（HCASMC）封装在儿茶酚官能化的GelMA（GelMA/C，20重量%）生物墨水中[151]。用直径为840μ m的外针挤压含HCASMC的GelMA/C生物墨水，用直径为406 μ m的内针挤压含30wt% PluronicF 127和23.4nmol·L-1高碘酸钠的HUVEC根据所使用的同轴喷嘴，发现生物打印管的ID为500 -1500 μ m，壁厚范围为100 -从100升到300升。生物打印的血管结构是进一步植入非肥胖糖尿病-严重联合免疫缺陷（NOD-SCID）白细胞介素-2（IL-2）受体γ缺失（NSG）小鼠，并提示体内自主整合和功能性血管形成。4.2. 喷墨生物打印喷墨生物打印是一种制造方法，其中生物墨水液滴沉积在基底上的预定位置处。液滴的形成可能是由热力或压电力引起的[48，152]。利用CaCl2溶液中藻酸盐珠粒的突然凝胶化来制造基于藻酸盐的3D管状组织构建体，从而形成微凝胶液滴作为构建块[153]。具体地，将海藻酸钠溶液（0.8%w/v）喷射到CaCl2溶液（2%w/v）通过喷墨喷嘴以形成圆形微凝胶珠的大约40 Lm直径。 海藻酸通过移动喷墨头制造直径为200μ m的管在一个实施例中，该方法包括以圆形图案打印头，其中藻酸盐凝胶的液滴在CaCl2浴中生物打印。使用包封在海藻酸钠（1% w/v）中的NIH/3 T3成纤维细胞作为生物墨水，通过3D喷墨生物打印系统逐层沉积成功制造了具有悬垂结构的直径约为3 mm的3D直形和锯齿形细胞管[154]。通过压电喷嘴分配器（ID = 120μ m）将生物墨水液滴喷射到CaCl2（2%w/v）浴中，形成凝胶化的细胞-藻酸钙层。所提出的制造方法可以潜在地应用于具有复杂几何形状和结构的血管的生物打印类似地，通过基于液体载体的喷墨生物打印方法产生具有分叉的血管样结构使用压电喷墨打印头（ID = 120μ m）喷射由海藻酸钠溶液（1%w/v）与或不与NIH/3 T3成纤维细胞组成的生物墨水液滴;使用CaCl2血管构建体以水平方式生物打印（图1A和1B）。 4（a-I）、4（a-II）、4（b-I）和4（b-II））或垂直方式（图2）4（a-III）、4（a-IV）、4（b-III）和4（b-IV））加入CaCl 2溶液浴（2%w/v）中。分叉血管结构的平均直径为3 mm，壁厚约为1mm[35]。在另一个实施例中，将凝血酶（50 U·mL-1）和CaCl2（80mmol·L-1）生物打印的细胞在纤维蛋白通道内对齐并准备增殖，并且观察到生物打印的微血管的通道结构保持稳定21天[155]。4.3. 基于激光辅助和缸聚合的生物打印激光辅助生物打印是一种无干扰的生物打印方法，它利用激光脉冲将生物墨水从供体载玻片沉积到受体上[156]。一项研究证明了激光辅助生物打印用于使用藻酸盐（8%w/v）或含有小鼠成纤维细胞的藻酸盐（2%w/v）作为生物墨水制造直的和Y形管状结构的潜力。当应用优化的参数（激光能量密度：1445mJ·cm-2，重复频率：10Hz，底物速度：80 mm·min-1，向下移动步长：25l m）时，平均细胞Y形结构的直径为5 mm[38]。使用激光辅助生物打印，用HUVEC和HUVSMC制造模拟天然组织中血管网络的简单结构。沉积直径约50μ生物打印液滴当使用0.5-1.5 l J脉冲-1的激光能量时，彼此相距50基于动态数字微镜器件（DMD）的瓮聚合生物打印是另一种具有高分辨率的制造方法[158]。该技术使得能够制造高度X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832839图四、小直径血管的喷墨生物打印（a）显示（I，II）水平和（III，IV）垂直分叉管状构建体的喷墨生物打印的示意图，其中将含有或不含有细胞的藻酸钠液滴（1%w/v）沉积在平台上，然后用CaCl2溶液交联（b）通过水平打印产生的分叉藻酸盐管的（I）顶视图和（II）全局视图;通过垂直打印产生的分叉藻酸盐管的（III）前视图和（IV）全局视图经Wiley许可，转载自参考文献[35]，©2015。图五.微血管化组织的基于还原聚合的生物打印。(a)示意图显示了预血管化组织构建体的制造;（b）荧光显微照片，显示了由通道中的HUVEC（红色）和周围水凝胶基质中的HepG2细胞（绿色）组成的生物打印的组织构建体;（c）3D共聚焦重建显微照片，显示了微通道中的EC，用红细胞示踪剂标记并对CD 31染色为绿色。复制自Ref。[43]在爱思唯尔的许可©2013年。复杂的组织结构，具有微米分辨率。使用包封相关细胞的水凝胶制造具有包埋脉管系统的体积组织构建体[159]。例如，在一个示例中，用基于DMD的立体光刻生物打印方法制造3D血管化肝模型，其中用包封在GelMA（5%w/v）中的人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肝细胞制造肝小叶，随后使用包封在缩水甘油甲基丙烯酸酯-透明质酸（1%w/v）和GelMA（2.5%w/v）中的HUVEC和脂肪来源的干细胞制造脉管系统[46]。这些3D生物打印的肝脏结构，尺寸为3 mm× 3 mm，厚度约为200μ m，由hiPSC衍生的肝细胞小叶的六边形阵列组成，周围有HUVEC和脂肪衍生的干细胞层。这种血管化的肝脏模型为病理生理学和药物筛选提供了平台研究[46]。在另一项研究中，按照相同的方法创建了预血管化组织构建体;采用三个数字掩模来制造图案化组织构建体，其中均匀（图5）[43]或梯度血管通道形成血管网络[142]。血管通道的大小为50 - 250μ m。虽然血管化组织构建体的基底层由六边形区域组成，其使用具有六边形图案的数字掩模用封装在GelMA（5%w/v）中的HepG 2细胞制造，但使用血管通道掩模用封装在水凝胶（2.5%w/v GelMA +1%w/v甲基丙烯酸缩水甘油酯-透明质酸）中的HUVEC和10 T1/2鼠胚胎成纤维细胞制造血管通道最后，使用平板掩模在顶部用GelMA（5%w/v）覆盖血管网因此生成一血管化组织构建体尺寸为4 mm× 5 mm，厚度为600l m。HUVEC在X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）832840····生物打印的组织构建体在体外自发形成管腔样结构。此外，将生物打印的预血管化和非预血管化（无细胞）组织构建体植入严重联合免疫缺陷小鼠的背部皮肤下14天，并证明预血管化组织构建体的内皮化[142]。4.4. 其他生物打印策略除了上述用于制造脉管系统结构的生物打印方式之外，牺牲生物打印是经典的间接（生物）打印方法。血管化组织构建体的牺牲性生物打印利用在生物打印完成后通常通过物理提取或改变温度去除的短效生物墨水，留下可灌注通道[62]。使用琼脂糖作为牺牲模板，通过挤出生物打印方法在载有细胞的GelMA水凝胶内生物打印圆柱形琼脂糖纤维[88，160]。然后去除琼脂糖纤维，在GelMA内产生可灌注的血管。这些血管的内径范围为800l m至2 mm，壁厚范围为50 - 100μ m。这些可灌注血管允许在厚的水凝胶中增加质量传递，并支持内皮单层的形成。采用类似的生物打印方法，使用Pluronic F127在GelMA水凝胶内生成中空脉管系统[161]。将HUVECs灌注到中空通道中以形成EC单层。作为替代方案，创建了3D血管化网络，其中使用碳水化合物玻璃配方（25 g葡萄糖、53 g蔗糖和10 g葡聚糖在50 mL反渗透水中的混合物）在110 °C下通过钢喷嘴（ID = 1.2或0.84 mm）打印开放和互连的牺牲碳水化合物玻璃晶格[162]。然后在50 ℃下玻璃化5分钟后，将打印的碳水化合物玻璃格浸入聚（d-丙交酯-共-乙交酯）溶液中，这防止了由于碳水化合物溶解而对包封细胞的渗透性损害.各种载有细胞的水凝胶，包括人胚肾（HEK）293载有细胞的PEG水凝胶（包含PEG-二丙烯酸酯（5%、10%或20%w/w）和1 mmol/L丙烯酸酯-PEG-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（RGDS）和Irgacure 2959（0.05%w/v）、10 T1/2载有细胞的纤维蛋白凝胶（10 mg/mL，包含纤维蛋白原和凝血酶）、10T1/2载有细胞的藻酸盐凝胶（2%w/v）、原代大鼠肝细胞和基质成纤维细胞装载的琼脂糖凝胶（2%w/v）、和10 T1/2细胞负载基质胶，用于封装3D打印的玻璃晶格。在ECM交联之后，通过将整个结构浸入介质中来去除牺牲性碳水化合物玻璃，在ECM水凝胶内留下开放通道。这些血管通道内衬HUVECs，然后在高压脉动流下用血液灌注结果显示，这些血管通道能够支持3D生物打印组织构建体中原代大鼠肝细胞的代谢功能。按照相同的方法，使用100 g异麦芽酮糖醇和10 g葡聚糖在60mL反渗透水中通过钢喷嘴（ID = 0.84 mm）打印牺牲碳水化合物玻璃丝，将其封装在纤维蛋白凝胶（10 mg mL-1）中[163]。通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤去除牺牲性碳水化合物细丝，然后将HUVECS注射到中空通道中。这些3D打印的血管补片被植入后肢缺血的小鼠模型中，并表现出增强的血管生成和工程血管与宿主血管系统的整合，导致远端缺血组织的灌注。类似地，当应用于心肌梗死小鼠模型时，这些生物打印的血管补片被证明可以部分挽救心脏功能，射血分数和心输出量与健康对照组相似。在另一项研究中，使用明胶（10%w/v）作为牺牲材料，在3D胶原蛋白I基质（3 mg mL-1）中;首先在流动室上生物打印胶原蛋白前体，然后生物打印两根明胶纤维[164]。在两个明胶纤维之间的纤维蛋白凝胶中包封的HUVEC和正常人肺成纤维细胞沉积后，在顶部生物打印几层胶原蛋白以覆盖整个结构。然后除去牺牲明胶，将HUVEC注射到通道中，随后使其与培养基一起流动。该研究证明了通过将HUVEC和成纤维细胞包埋在两个血管通道之间的纤维蛋白凝胶内形成微血管网络。最近，使用具有三个打印头的生物打印机证明了用于生产血管构建体的按需滴注生物打印方法[10，11]。使用直径为150μ m的打印头将明胶（5%w/v）或负载HUVEC的另外两个直径为0.3 mm的打印头用于制造肌肉层;一个打印头分配含有凝血酶、谷氨酰胺转移酶和CaCl2的交联剂溶液的液滴，而另一个打印头分配纤维蛋白原（2.5%w/v）-人脐动脉SMC悬浮液的液滴。最后，在生物打印过程完成后，通过将纤维蛋白原（1.25%w/v）-胶原蛋白（0.18%v/v）共混物包封在肌肉层周围来形成血管的外层因此，得到的可灌注血管通道，直径为1 mm，壁厚高达425μ m，由内皮细胞，SMC层，和周围的成纤维细胞基质。表3生物打印小直径血管的代表性参数和特性外径977lmHSF：人皮肤成纤维细胞。生物墨水生物打印模态细胞类型血管直径参考琼脂糖喷墨HUVSMC、HSF外径= 0.9[一百五十三]VdECM/藻酸盐挤出HUVECsID = 892l m[一百四十八]GelMA/藻酸盐/PEGTA挤出HUVECs、hMSCsOD = 1192l m内径= 400[110]GelMA/藻酸盐/PEGOA挤出HUVEC、SMCOD = 500产品编号663l m[第116话]VdECM/藻酸盐挤出HUVEC、HAoSMC内径= 2 mm[149]第一百四十九话海藻酸挤出HUVEC、vSMCOD = 300l m[150]X. Cao，S. 马哈让河 Ashfaq等人工程7（2021）8328415. 未来方向生物打印技术的进步导致了具有不同形状、尺寸和功能的可灌注血管结构和血管化组织构建体的生物工程化（表3）[110，116，148然而，大多数生物打印的血管组织仍然缺乏天然血管的关键结构成分、机械特性和生理特征每种生物打印模式都有自己的优点和缺点。理想的模态应当具有最大化的能力，例如分辨率和生物打印速度，并且应当以血管类型特异性的方式适用于具有最佳血管化潜力的广泛的生物墨水大多数以前的研究使用HUVEC作为模型细胞类型。然而，为了实现临床上相关的血管组织形成，生物打印的血管构建体应该能够用相关的细胞来源经历重塑和功能转变。因此，需要更多的努力来探索改进的生物打印方法，以及开发用于制造具有适当的机械行为和良好的生物性能的功能性小直径血管移植物和血管化组织移植物的先进生物油墨。这些生