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工程5(2019)803研究合成生物学-文章开发一种非转化依赖性和无偏倚的qPCR检测方法以快速评估DNA组装效率马晓燕a,#,梁欣欣a,#,霍怡欣a,b,北京理工大学生命科学学院分子医学与生物治疗重点实验室,北京100081b加州大学洛杉矶分校技术促进研究所(苏州),中国阿提奇莱因福奥文章历史:2018年2月1日收到2018年7月29日修订2019年3月19日接受在线预订2019年关键词:组装效率DNA组装qPCR二级结构转化A B S T R A C T合成生物学正朝着更大、更复杂的设计方向发展,这在很大程度上取决于基因模块的有效组装。传统的DNA组装效率(AE)的评价需要转化,整个过程需要10 h,且易受各种干扰。为了实现快速可靠的AE测定,使用改良的定量聚合酶链反应(qPCR)测定建立了一种替代的非转化依赖性方法。AE由连接片段的比例表示,可在3 h内测定。通过常用的限制性连接、Golden Gate组装和Gibson组装来检测这种基于qPCR的测量,以组装两个或多个DNA片段;结果与由菌落形成单位(CFU)计数表示的AE显著该方法通过减少测量偏差和源于转化过程的随机偏差而优于基于CFU的测量。该方法被用来研究末端二级结构对DNA组装的影响。结果揭示了重叠序列的整体性质的主要影响和发夹结构对AE的负面影响,这与依赖于末端序列的同源退火的所有组装技术相关。这里提出的基于qPCR的方法应促进DNA组装技术的发展©2019 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版,高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。1. 介绍合成生物学的目标是改变器官的行为或创造新的生命形式来执行新的任务[1]。该学科建立在生物分子(如DNA和蛋白质)的基础上,并遵循层次结构,构成生化反应、代谢途径、细胞,最后是种群[1,2]。然而,向更复杂的生物系统的发展受到两个挑战的极大阻碍其中第一个是增加人工生物构建体的多样性[3],因为目前构建的遗传部分文库的大小通常低于所需水平[4,5]的数量级(103 第二个挑战是多个基因模块的整合[6],特别是当涉及到10个以上的生物部分[7]时。克服这些挑战将依赖于DNA组装*通讯作者。电子邮件地址:huoyixin@bit.edu.cn(Y.- X. Huo)。#这些作者对这项工作做出了同样的技术,提供简单和快速的操作,优越的兼容性,和高效率[8]。组装效率(AE)反映了DNA片段之间发生连接的概率,是衡量一种组装方法的潜力的关键参数。它通常由转化组装产物后形成的菌落数确定[9,10]。AE的测量从转化过程开始,转化过程需要约1-1.5小时,然后过夜孵育至少8小时以形成菌落。最后,还有菌落计数和验证这一费力的步骤。这些步骤除了耗时的感受态细胞制备之外,还需要长达10小时。因此,AE的快速测定将大大加快测试周期以及装配技术发展的优化。DNA分子的组装已经从两个DNA片段的位点依赖性连接发展到具有所需顺序的多个片段的序列无关性组合[11]。现有的方法,如体内组装(IVA)[12]、双引物组装(TPA)[13]、序列和连接独立的方法[14]、双引物组装(TPA)[15]、双引物组装(TPA)[16]和双引物组装[17]。https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.06.0022095-8099/©2019 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。目录可在ScienceDirect工程杂志主页:www.elsevier.com/locate/eng·804X. MA et 其他/工程 2019 - 05 - 29 00:00克隆(SLIC)[10]和环状聚合酶延伸克隆(CPEC)[9]的AE最高,范围为每单位DNA 400至56 000个集落形成单位(CFU)然而,这些价值观可能会产生误导。一方面,AE的计算因研究而异一些研究使用总DNA 的量进行标准化,并将效率表示为CFU/纳克DNA(CFU ng-1)[14],而其他研究则将载体或插入物的量纳入计算[9,15]。还使用了CFU/板[12,16]和阳性CFU比例[17]等表达式因此,不同组装技术报告的效率可能不具有可比性。另一方面,由CFU计数表示的AE可能受到转化过程的影响任何影响转化效率的因素,如感受态细胞的基因型、转化方法或组装产物的大小[18,19],都可能导致菌落计数的显著变化。因此,基于CFU的测量可能不代表实际AE,即使采用相同的计算方法,也会使不同技术之间的比较不太可靠因此,迫切需要开发一种不依赖于转换的方法,用于DNA AE的标准化和无偏评价。大多数组装技术,如SLIC,IVA,In-Fusion[20],和Gibson组装[21],需要在相邻片段的末端有重叠序列。片段的组装依赖于一旦重叠区域凹陷,互补突出端的容易且稳定的退火。因此,重叠序列的设计对于实现高AE至关重要。与重叠长度等因素相比,重叠区域中的次级结构对AE的影响受到的关注要少得多,重叠长度已针对大多数组装技术进行了集中优化[10,12,14]。由于重叠区必须在组装前加工成单链,因此在突出端内或突出端之间形成的二级结构可能会阻止互补末端序列的成功退火这个问题已经通过几个在线协议解决了(例如,来自Addgene的 Gibson组装克隆;来自Integrated DNA Technologies , Inc. 的 gBlocks 基因片段方案然而,实验证据仍然缺乏。在本研究中,使用改良的定量聚合酶链反应(qPCR)测定建立了AE的不依赖于转化的测量(图1A和1B)。1(a-c))。总之,首先组装DNA片段,产生连接的环状DNA和未连接的线性片段的混合物。经T5核酸外切酶处理后,只有组装的环状DNA保持完整,而线性插入片段和载体被消化。通过qPCR测定法测量连接片段相对于其初始量的相对量,并用于指示AE。将该方法应用于三种广泛使用的组装技术-即限制性连接、Golden Gate组装和Gibson组装,并将结果与基于CFU的测量结果进行比较。为了证明基于qPCR的测量的应用,研究了重叠区域中的二级结构对Gibson组装效率本研究的结果表明,与传统的基于CFU的方法相比,基于qPCR的方法可以以更快的方式产生更少偏倚的AE评价;因此,它可以用于DNA组装技术的开发和优化。2. 材料和方法2.1. 限制性连接测试了七组限制性连接(RL 1-RL 7)。酶BamHI和SalI或PacI和FseI用于双重消化。当需要时,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增,通过引物将限制性位点引入DNA片段的末端,并将剩余的模板质粒用Dpn Ⅰ消除。对于双重消化,将1μg插入片段和1μg载体各切割1U(一个单位在此定义为在50 μ L的总反应体积中,在37℃下,在50μL的两种酶的总反应体积中,在1小时内消化1 μ g DNA所需的限制酶的量。将反应混合物在37°C下孵育2小时,并将靶向的片段在37 ° C下孵育2小时。使用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)对片段进行凝胶纯化。总共60Fig. 1. (a)复杂代谢途径和基因组文库的构建依赖于DNA片段的有效组装,这种方法已经从序列依赖性方法发展到序列非依赖性方法。(b)AE通常通过转化和随后的菌落计数来确定。(c)通过利用qPCR试验建立AE的替代测量;连接片段的量与其初始量的比率用于指示AE。(d)将一系列具有不同二级结构的重叠序列引入线性化的pUC 19和1 kb酶片段的末端,以研究末端二级结构对Gibson组装的影响。DG:自由能差。1千卡= 4186焦耳。·XREX×·×X. Ma等人 /工程5(2019)803-810805在22 ° C下,在20 μ L的总体积中,通过T4 DNA连接酶的400个粘性末端连接单位(CEU)连接插入物与载体的摩尔比为1:1或5:1的质粒1小时。所有酶均来自New英格兰生物实验室公司2.2. Golden Gate装配测试了8套Golden Gate组件(GG 1通过PCR扩增将侧翼为指导连接组装的四碱基互补序列的BbsI限制性位点添加到DNA片段的末端。总共200-使用具有SYBR Green I检测的Roche LightCycler®96系统 反应开始于在95 °C下预孵育30秒,然后是40个循环,每个循环在95 °C下5秒,在56 °C下30秒,和在72 °C下30秒。熔融曲线分析通过将温度以一定速率从60 °C升高至95 °C来进行。0.1 °C s-1,每摄氏度采集5次信号。每份样品重复测量两次。AE的计算源自DCt(即,目标值和参考值的阈值差异)方法[22]。靶(Xt)和参比(Rt)的DNA分子的阈值数目可描述如下:或5 :1,将2L10×T4 连接 酶缓 冲液 、200CEUT4DNA 连接酶和5UBbsI混合至总体积为20L。 反应进行30个循环,每个循环在37 °C下进行5分钟并且在22 °C下进行5分钟。随后在55 °C下使限制酶失活15分钟,并在55 ° C下使T4连接酶失活。Xt¼X0×ECt;XRt<$R0×ECt;Rð1Þð2Þ使用的所有酶和缓冲液均来自New英格兰生物实验室公司2.3. Gibson组装PCR扩增待连接的片段以增加末端重叠。通常引入20个碱基对(bp)的重叠其中,X0和R0表示目标和参考的量。DNA,分别。EX是靶序列的扩增效率,ER是参考序列的扩增效率。Ct; X是目标的阈值循环,Ct; R是参考的阈值循环。因此,X0与R0的比率可以表示为如下:用于组装两个DNA片段,X0XtCt; RR延伸至40 bp用于多部分DNA组装。将50飞摩尔的载体和插入物中的每一种添加至11.25μL实验室制备的装配母版,其含有0.06U的T5核酸外切酶、0.375 U的高保真DNA聚合酶,TaqDNA连接酶60 CEU, MgCl2 13.3mmol·L-1,1,4-二硫苏糖醇(DTT)13.3mmol·L-1,1.33×恒温反应缓冲液R0<$Rt×ECt;X 2019 -03-23在这种情况下,定量针对连接片段及其线性参考的相同序列,并且在相同的PCR运行中进行测量。因此,Xt与Rt的比率可以(0.1mol·L-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl),pH7.5,脱氧核苷三磷酸( dNTP )各 0.2mmol·L-1,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)1 mmol·L-1,聚乙二醇(PEG)8000 150 mg/1×缓冲液)。将15 μ L的反应混合物在50℃下孵育1小时(两部分组装)或2.5小时(多部分组装)。使用的酶是来自New England Biolabs,Inc.测试了六套Gibson组件(GA 12.4. 转型实验室制备的大肠杆菌菌株XL 10-Gold(Integrated Science&Technology,Inc.) 转化效率为7 ×106以每微克pUC 19DNA的CFU数(CFU s·lg~(-1))进行化学转化。将1-6 μ L体积的组装产物加入到50 μ L感受态细胞中,在950 μ LSOC培养基中回收1小时并铺板。紫色的殖民地被认为是-如果将编码紫色显色蛋白的基因(iGEM部件:BBa_K1033906)用于组装,则产生正确的组装体。使用10个随机挑选的菌落通过菌落PCR验证不含标记基因的组装体。AE由每微克DNA的正确CFU数2.5. qPCR在 定 量 之 前 , 将 组 装 混 合 物 中 的 残 余 线 性 片 段 在37 °C 下 用0.5μL(5U)T5核酸外切酶消化30分钟,然后在85 °C下孵育15分钟,以使其完全消化。使核酸外切酶变性。插入片段或载体片段在由SYBR®预混二聚体制备的20μL反应系统(补充数据,表S1)中定量1.5μL组装产物EraserTM(TaKaRa).作为参考,制备含有相同量的用于组装的除酶以外的每个DNA片段的平行反应。将T5消化的线性载体和插入物的混合物用作对照测定中的模板假设是一个近似于1的常数此外,本发明还提供了一种方法,DCt方法假定靶和参照的扩增效率相等。在这种情况下,假设更有效,因为目标和参考是相同的。理想情况下,PCR产物在每个循环中复制一次,这意味着扩增效率为2。因此,Eq。(3)可以转化为以下形式:R¼2-DCt400mm其中R表示连接片段的量与其用于组装的初始量的比率,而DCt是靶和靶之间的阈值循环的差异。的参考(Ct; X-Ct; R)-在这种情况下,连接和初始线性片段。2.6. 数据分析Pearson双尾相关性用于研究基于CFU和qPCR测量得出的AE之间的关系。必要时,通过双尾Student t检验分析AE之间的差异Gibson组装效率与重叠序列属性之间的关系使用gbmplus(1.5-17)包中R(2.7.2)中的提升树分析[23]3. 结果3.1. 不同测量方法产生的限制性连接效应以CFU为基础的测定表明,7套限制性克隆的效率不同,从5 × 10- 2到1.6104CFU1g-1(图 2(a))。RL6和RL7,其中每个产生了2.1 kb的DNA分子,平均效率是其他克隆的11倍× ×·×·806X. MA et 其他/工程 2019 - 05 - 29 00:00图2.(a)限制性连接、(b)Golden Gate组装和(c)Gibson组装的AE,由正确的CFU计数和qPCR衍生比率表示;(d)这两个测量值之间CK表示T5核酸外切酶消化后残留线性片段的水平各样本的qPCR衍生比率和CFU计数结果为平均值,误差条代表标准差(n= 3)。rp:Pearson相关系数。套,其连接产物的大小在5.5至8.7kb之间。基于qPCR的测量结果显示AE 存 在 相 似 差 异 , 其 qPCR 衍 生 比 值 在0.021 至 0.209 之 间 ( 图 2(a))。最高(RL7)和最低(RL1)效率之间的差异从35倍(如CFU计数所示)降至10倍(如qPCR衍生比率所反映)。基于CFU的测量的较大差异可能归因于转化效率受损,因为DNA分子的大小从RL7增加到RL1高达四倍,这可能降低DNA产量。因此,由大分子(如RL1)的CFU计数表示的AE可能低于qPCR衍生比率所示的成功连接片段的实际水平。尽管如此,在两次测量产生的效率之间发现了正相关关系(图1)。 2(d))。3.2. 不同测量方法对Golden Gate组装的影响基于CFU和qPCR的测量均检测到GG1至GG8组的AE增加(图2(b))。CFU计数从4增加6.5倍103至2.6104CFU1g-1,qPCR衍生比率从0.013增加5.5倍至0.072。如基于qPCR的测量所示,AE从GG3至GG5显著增加,与GG1或GG2相比平均增加4倍。GG6的效率继续增加,GG7和GG8的效率保持稳定相比之下,通过基于CFU的方法仅检测到GG7和GG8的AE显著增加,而GG1至GG6的AE增加并不特别明显。非显著性结果可归因于基于CFU的测量中的大偏差,其源于转化过程,即使DNA分子大小相等且转化过程中,严格控制反应条件。尽管存在这些差异,但基于qPCR的测量结果与基于CFU的方法产生的结果呈正相关(图1)。 2(d))。3.3. 不同测量方法对Gibson组装的影响根据基于CFU的测量,六组(GA 12.91 04CFU1g-1(图 2(c))。效率随着尺寸的增加而增加装配产物的长度从GA 1的9.7kb下降到3.7kb(GA6)。6个组装体的qPCR衍生比率遵循与CFU数量所示相同的顺序,并且发现这两个测量值之间呈正相关(图2(d))。值得注意的是,对于在所有组装组中将产生最大DNA分子的GA 1没有形成集落,而通过基于qPCR的方法检测到GA 1的值为0.002,其显著高于T5消化的对照的值。这一结果也可归因于DNA分子的大小对转化效率的影响。该方法也被应用于测量多部分DNA组装的效率。正如预期的,当组装片段的数量从2个(M2)增加到3个(M3)时,通过qPCR测定的效率从0.028显著下降48%至0.015(图1B)。 3)。从0.015到2015年,0.007时,四个片段(M4)组装。CFU计数的变化与基于qPCR的测量一致。与两个片段的组装相比,当组装三个片段时,检测到CFU计数减少54%。CFU计数持续减少通过百分之八十四从1.6× 104到3×103CFUs·lg-1时,×·---X. Ma等人 /工程5(2019)803-810807图三.通过基于CFU和qPCR的测量确定2 - 4个(M2-M4)DNA片段的AE。各样本的qPCR衍生比率和CFU计数结果为平均值,误差条代表标准差(n = 3)。四总之,两次测量均证明当组装多个DNA片段时AE3.4. 重叠区二级结构对Gibson组装的影响为了研究重叠区的二级结构对Gibson组装的影响,设计了11个能够形成二级结构的短序列(20 bp)。二级结构的稳定性通过自由能差来量化其中,较低的DG表示对于一个非线性结构具有较高的稳定性[26]。在这11个序列中,发夹型DG的范围为-1.2 ~-9.2kcal·mol-1(1 kcal = 4186J),自身二聚体DG的范围为-3.3~-11.6kcal·mol-1。另外两还设计了不含二级结构(DG这些短序列被引入到末端如图1(d)所示,线性化的pUC 19载体和编码纯化蛋白的1kb片段(补充数据,表S2),总共产生12个片段对。一对片段在两个重叠区都不含二级结构(OL1,作为对照),九对片段在两个重叠区都含有二级结构仅在一个重叠区域(OL 2-OL 10)中,并且最后两对可以在两个重叠区域(OL 11和OL 12)中形成二级结构。来自相同反应管的组装混合物用于通过基于CFU和基于qPCR的方法测量AE。如qPCR衍生的比率和CFU计数所示,AE基本上在OL 1至OL 6的样品中增加,但见图4。通过基于CFU和qPCR的测量确定重叠区域中含有二级结构的DNA片段的AE各样本的qPCR衍生比率和CFU计数结果为平均值,误差条代表标准差(n= 3)。在OL7至OL12的样品中急剧下降(图4)。菌落数从无末端二级结构的OL 1的4×103CFUs·lg-1增加到最高的OL 6的1.1 ×104CFUs·lg-1,发夹DG-5.3kca l·mol-1。当重叠区的发夹DG降至-6.9kcal·mol-1(OL 7)时,CFU计数急剧 碎片-在重叠区具有最低发夹DG的片段对(OL10)具有最低CFU计数2102CFU/g~(-1),仅占5%,这是OL1的与OL1相比,通过基于qPCR的测量,在OL6中也发现了更高的AE然而,根据qPCR衍生比率,OL3达到最高AE(0.156)。当样品的二级结构从OL6到OL7变得更稳定时,该比率从0.136(OL6)急剧下降62%到0.052(OL7),并且达到较低水平,OL10中为0.037。与OL1(0.032)相比,在两个重叠区域(OL11和OL12)中形成的次级结构导致AE显著下降,尽管DG(4.5至6.4 kcal mol-1)表明只有中等结构稳定性在所有的重叠中。以DG为特征的末端二级结构不是影响Gibson组装的唯一因素。事实上,重叠序列的整体性质对AE的影响可能比二 级 结 构 的稳定性更 强(图11)。 5)。根据在12组Gibson拼接结果的模型中,引物熔解温度(Tm)和重叠序列的鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)含量是主要的决定因素,共占AE差异的56%。当总Tm超过60 °C时,效率急剧增加(图5(b)),并且随着GC含量从50%增加到70%而增加(图5(b))。 5(c))。在重叠区域内形成的发夹结构具体地说,对发夹结构的Tm、发夹结构的DG和GC含量进行了解释31%的总方差的AE,而总的相对影响二聚体结构的Tm、DG和GC含量仅为13%。当发夹DG降至-4kcal·mol-1以下时,AE可能会急剧下降(图5(d)),并且AE与发夹Tm之间存在负相关关系,其范围为22 ~ 30 °C(图5(d))。 5(e))。4. 讨论本研究利用改良的qPCR方法,开发了一种不依赖于转化的快速测定DNA AE的方法。如常用的DNA组装技术(包括限制性连接、Golden Gate组装和Gibson组装)所示,基于qPCR的测量产生的AE估计值与基于CFU的常规方法相当,因此有助于研究DNA组装的决定因素。基于qPCR的测量排除了转化对AE的干扰,因此比基于CFU的测量更可靠。在本研究中,对于限制性连接、Golden Gate组装和Gibson组装,由qPCR衍生比率表示的AE的平均标准差分别为14%、13%和17%(图2)。相比之下,即使使用同一批感受态细胞测量AE,并在转化过程中建立严格的质量控制,通过CFU计数估计的AE的平均标准偏差高达31%-48%,这是相应qPCR衍生比率的2.2-3.7倍。基于CFU的测量结果的低重现性可能隐藏了样本(如GG6和GG5)之间的差异,应检测到GG6的AE相对于GG5的AE急剧增加,如qPCR衍生比率所示另一种可以避免808X. MA et 其他/工程 2019 - 05 - 29 00:00图5. (a)末端二级结构和重叠序列的总体性质对AE的相对影响以及AE对(b)总Tm,(c)总GC含量,(d)发夹DG,(e)发夹Tm,(f)二聚体GC含量,(g)发夹GC含量,(h)二聚体DG,和(i)二聚体Tm。通过基于qPCR的测定法的检测源于大小偏好。当DNA分子的大小增加时,将其转化为细胞变得更加困难[27,28],导致转化效率降低,因此由CFU计数表示的AE被低估这可以解释GA1组装失败和成功之间的矛盾,如分别通过基于CFU和qPCR的测量所示(图2(c))。由于GA 1产生的10kb DNA分子可能太大,细胞无法通过转化回收那些很少组装的DNA片段与CFU计数代表的AE相比,源自qPCR试验的AE中RL7和RL1之间的差异降低也可部分归因于大小偏倚。因此,基于qPCR的测定法提供了比传统的基于CFU的测量更高的灵敏度和可靠性不同组组件之间的公正比较应尽量减少AE测量引起的随机偏差。这对于依赖于转化的基于CFU的测量可能是费力的。首先,感受态细胞在所有测量中必须具有相同的基因型,以排除DNA繁殖和稳定性的变化。更重要的是,转换效率必须保持恒定。为确保这一点,感受态细胞应来自同一批次,并且转化必须遵循相同的步骤-例如解冻感受态细胞所花费的时间完全相同-因为这些步骤中的变化可导致转化效率的显著差异高达10000倍[29]。即使有严格的控制,AE仍然会受到组装产物的体内操作的影响,例如含有重复区域的DNA分子的重组[30,31]。 相比之下,基于qPCR的检测试剂盒通过保持qPCR的基本规则,可以轻松控制测量条件。它甚至简化了工作流程,对目标和参考使用相同的序列。因此,仅需要单对引物用于定量,并且靶和参考之间的扩增效率的差异被最小化。请注意,定量参考应使用与组装相同量的片段。此外,组装混合物中剩余的线性片段必须完全消化,并且核酸外切酶应灭活,以避免在后续定量测定中消化qPCR引物。当遵循这些规则时,基于qPCR的测量能够实现快速X. Ma等人 /工程5(2019)803-810809测量AE。通常需要30分钟消化残基片段,15分钟消化T5核酸外切酶,2小时准备和运行qPCR。总的来说,这是一种不到3小时的快速测定,仅需基于CFU的测量所需时间的四分之一。开发基于qPCR的测量并非旨在取代转化,而是为确定AE提供可靠和快速的替代方法。因此,当对测量通量和数据可靠性有高要求时,该方法对于DNA组装技术的开发和低效组装的调试特别有用。各种因素的影响(例如,重叠区的长度、片段之间的比率、DNA分子的量和组装时间)可以在3小时内在单一qPCR测定中同时进行测试,从而可以确定用于该特定组装的最佳方案。体外测量仅针对AE,而不是关注转化和组装的组合效率,这使得能够剖析低产率的多种原因。例如,如果qPCR衍生的比率未表明CFU计数所指示的低AE,则转化过程可能存在问题。如果提高的转化效率没有产生更多的转化体,则可能表明插入基因的产物毒性[32,33],这可以通过切换到更严格控制的载体来解决,该载体禁止毒性基因的泄漏表达。此外,DNA组装的保真度可以通过修改的定量策略来确定。不是靶向连接片段内的序列,而是靶向跨越相邻片段的接合处的区域进行定量,这应该仅在所有片段以所需顺序连接时才是可检测的。在此假设下,连接序列的量与连接片段的量的比率用于指示组装的保真度(图S1(a))。如具有不同正确率的五组Gibson组装所例示的,组装保真度的差异可以通过该替代qPCR测定来鉴定(补充数据,图1B)。 S1(b))。基于qPCR的测量揭示了ter-二级结构对Gibson组装效率的影响。在一般情况下,AE显着降低时,形成稳定的发夹结构内的重叠区域。然而,应该注意的是,整个重叠序列的总体性质,例如基础组成和热稳定性,可能比局部二级结构具有更强的影响在调节DNA组装中的作用。具体而言,具有高Tm的富含GC的重叠序列可能增加同源末端退火的机会,导致高AE。在这项研究中,重叠区域的Tm值范围为48至62 °C,总GC含量范围为40%至70%,这涵盖了DNA组装中使用的一般条件[9,12,13,15]。因此,为了设计有效的Gibson组装体,在重叠序列中应该包括更多的GC,只要GC含量和Tm在正常范围内。在重叠序列内存在弱的发夹结构是可以容忍的,但是应该避免稳定的发夹结构,例如富含GC的回文限制位点。这些规则与SLIC、TPA、IVA等依赖于末端序列同源退火的组装技术相关。5. 结论总之,本研究建立了一种使用改良qPCR测定法测定DNA AE的替代方法。结果与AE定量中常用的CFU计数相当。该方法优于基于CFU的通过减少测量偏差和源于转换过程的随机偏差,可以提高测量精度。这种快速的工作流程可以促进DNA组装技术的发展和低效组装的诊断。确认本研究得到了国家重点研发计划(2017YFD0201400)、国家自然科学基金(21676026)和中央高校基础研究基金的资助。遵守道德操守准则马晓燕、梁欣欣和霍怡欣声明,他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可以在https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.06.002上找到。引用[1] [10] 杨文,王文.合成生物学:新兴学科的新工程规则。分子系统生物学2006;2(1):2006.0028.[2] 放大图片作者:Choffnes ER,Relman DA,Pray L.合成与系统生物学的科学与应用:研讨会摘要。次报告. 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