基因组学特征与治疗利用IL-13反应序列结果在哮喘中的发现

Article文章Genomic Characterization and TherapeuticUtilization 基因 组 学 特性 和 治疗 利用of IL - 13反应 式sequences 结果在哮喘Graphical 的abstracthighlights强调D基因 组 学 方法 识别 气道 上皮 调控 元件哮喘D整合 的 RNA-seq ， H3 K27 ac ChIP-seq ， 和 大 规模 并行 报告 器assay 的D Discovery Of An 的 评论SPDEF Enhancer DrivingSecretory 驾驶 安全 性cell - 选择 性 回应Il - 13D增强 型 CRISPRi 介 导 系统prevented deleterious effects of的 其他 效果Il - 13Authors作者Kyung Duk Koh，卢克R.作者：WALTER L.艾卡尔 巴 ，...，沃尔特E。作者：Finkbeiner，NadavAhituv，David J. erleCorrespondence 的@ahituv@ucsf.edu（ N ） ，大卫 · 厄尔@ucsf.edu（ D . J.E ）在信Epithelial 的Responses 的两 个TheCytokine 。IL - 13 是 由于 哮喘 造成 的气道 阻塞 。 马伊 et艾尔 utilized ScRNA-seq ，H3 K27 ac 问题ChIP - seq ， 大规模 并行 报告 器 分析 ， 以 识别 基于CRISPRi 的 初级 支 气管 上皮 细胞 和开发 中 的 IL - 13 响应 调控 元件therapeutic 的agent两 个downregulateairway obstruction-inducing gene in acell type - and IL - 13 - specific （ 在 细胞 类型 和 IL - 13 - 特异 性 中 的 下游 气道 阻塞 诱导 基因 ）Manner 。Kai et al.，2023 年 ， Cell Genomics 3，100229一月11，2023NE Ⅰ2022年The Author（s）Identify 身份IL - 13 反应 式基因及regulatory Elements干 细胞 和 单 细胞RNA-SEQ的celltypeIl - 13-H3 K27 AC （ 美国 ）Chip-seq 的IL - 13 inducible IL -+—+-+i-13+A13-AnalyzeCandidate regulatory Elements using Reporter assay的个体Candidates 的10080604020大 规模 平行 记者assay 的MPMPMPMPMPMPMPMP0MPMP10 110 310 5gfpInhibitpathologic 病理 学基因expression using A A秘书处cell - 选择 性IL - 13 反应 式成就 者两 个Control 控制CRISPRihu 6sgRNA晋升者MUC5AC的Crab—Cas 9minpSPDEFE的A13 -i-13 +llhttps://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100229llOPENACCESS访问Article文章1OPENACCESS 访问Article文章基因 组 特性 GenomicCharacterization和therapeuticUtilization 使用ofIL - 13 反应 式sequences 结果在哮喘Kyung Duk Koh ， 香港1,2,7卢克 R 。Bonser ，1,2,7沃尔特 · L 。艾卡尔 巴 ，1,3,7关于 Yizhar-Barnea ，2,4,7Jiangshan Shen ，1,2Xiaoning 的Zeng ，5基尔 斯滕L 。 哈克特 ，2Dingyuan 的I 。 Sun ，6Lorna t 。Zlock ，6沃尔特E 。 Finkbeiner ，6Nadav阿 育 吠陀 ，2,4,*大卫 · J 。 erle 1,2,3,8,*1美国 加利福尼亚 大学 医学 系 ， 旧金山 ， CA 941432研究 所for Human遗传 学 ，大学of加州 ，SAN弗朗西斯科 ，SAN弗朗西斯科 ，CA 94143, USA3 CoLabs ， University of California ， 旧金山 ， CA 94143 ，USA4司of生物 工程 bioengineering及Therapeutic 治疗Sciences ，大学of加州 ，SAN弗朗西斯科 ，SAN弗朗西斯科 ，CA 94158, USA5Department of Pulmonary （ Pulmonary ）&关键 医疗 ， 南京 医科 大学 第 一 附属 医院 ， 南京 ， 中国6 Department ofPathology ， University of California ， San Francisco ， 旧金山 ， CA 94143 美国USA7 These authors contributed 作者 贡献equally 平等 的8 Lead 领导Contact 联系◎ Correspondence ：@ahituv@ucsf.edu（ N ） ，大卫 · 厄尔@ucsf.edu（ D . J. E ）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100229Summary总结Epithelial 的Responses 的两 个The Cytokine 。白 细胞 -13（ E13 ）cause 原因Airway 航空破坏 性在哮喘 。 here 这里We使用 多种 基因 组 技术 来 识别 支 气管 上皮 细胞 中 IL - 13 反应 性 调控 元件 ， 并 使用 这些 数据 开发 CRISPRi （ CRISPRi ） 基于 治疗 方案 以 在 细胞 类型 和 IL - 13 特异 性 靶 向 靶 向气道 阻塞 诱导 的 基因 。单 细胞 使用 - cellRNA sequencing 问题（ ScRNA-seq ）及acetylated 的lysine27 on histone 历史3（ H3 K27 ac ）Chromium 的免疫 治疗 （ cipitation ）sequencing 问题（ Chip-seq ）在primary human BRONCHIAL 的epithelial 的Cells ，We IDENTIFIED 身份IL - 13 反应 基因及regulatory Elements 。 These 这些sequences 结果Were Functionally 功能有效及乐观 的via用于 IL - 13诱导 活动 的 大 规模 并行 报告 员 分析 （ MPRA ） 。12—26王思聪（02—26王思聪（SPDEF基因，什么是利用驱动CRISPRi并敲下来SPDEF尼康D750单反套机（MUC 5AC的（Both involved in pathologicmucus production in asthma）。Our work pro - vides a catalog of cell type-specific genes and regulatoryelements involved in IL - 13 bronchial epithelial response and showcases their use for therapeutic （ IL -13 支 气管 上皮 反应 和 显示 其 用于 治疗 的 细胞 类型 特异 性 和 调控 元件 ）目的 。introduction基础哮 喘 ， a condition in which the airways narrow because ofbronchoconstriction and excessive mucus production （ 由于支 气管 收缩 和 过量 的 肌肉 产生 ， 哮喘 ）Affects 影响～全球2.62亿人？细胞 因子 影响 Cytokine Effects onThe航空公司在哮喘发病中发挥中心作用白 细胞 -13” （ 同上 13 ）干扰 素（ IFN ，及IL - 17 ： 受 刺激基因表达 是 增加 了 个体患有 哮喘 的 子 项 ， 而 细胞 因子 信号 与 疾病 的 严重 性 ，气道 炎症 有关答案 ，及Responses 的两 个Therapy 。2-4These这些2 、 INA 反映 了 对 飞机 上 的 各个 方面 的 影响 。例如 ，IL - 13 ， 其中 至少 有 一半 的 个体 患有 哮喘 ， 诱导 嗜 酸性粒 细胞 炎 ，5 ， 6飞行 模拟 肌肉 hypercontractility 7Fibroblastproliferation 纤维 细胞 增殖8这 是 一 个 过度 生产 。9，10使用 转基因 麦克风 ， 我们 展示 了 IL - 13 对 气道 上皮 细胞 的 直接影响 ， 足以 诱导 哮喘 ， mucus overpro - 生产 和 气道 反应 性 的两 个 关键 特征 ， 在 气道 炎症 的 情况 下or纤维 化 。9Il - 13鼓励of Airway 航空epithelial 的llMUC 5AC（英语：MUC 5AC）是造成哮喘的主要贡献者，是一种特殊的秘密细胞（球体细胞）。11研究 在 mice 12人类上皮 细胞 （ Human Epithelial Cells ）13 have demonstratedthat this process depends on 这个 过程 依赖 于induction 诱导 of The sterile 的 Alpha motif Pointed domain E - 26Transformation-Specific Transcription Factor （ SPDEF ）转换 特定 转录 因子CELLS 。Generegulatory元素 ，SUCH AS晋升 者及Enhancers ，可以贡献 贡献两 个cell类型 - 特定答案 | 14These 这些元素可以 通过 全 基因 组 技术 ， 包括 chro - matin 免疫 敲 除 测序 （ ChIP-seq ） 来 识别 ， 以 反对 其 作为 乙酰 化 的 赖氨酸27 对 组 蛋白 3 （ H3 K27 ac ） 的 改变 。15全 基因 组 技术Have Beenused to characterize cytokine responses ，including macrophage re - sponses to IL - 4 其它16，17 and LungEpithelial Line Responses to Trans-Forming Growth Factor（ 跨 性别 成长 因素 ）B（ TDF - ）B），18非 分化 人 支 气管上皮 细胞 的 一般 表 观 遗传 学 特征 （ HBEC ）19However ，more Work IS required 需 要 两 个 IDENTIFY 身 份 及 func -tionally characterize IL - 13 - responsive elements （ 函数 ）differentiated 区别 的Cell Genomics 细胞 基因 组 学3， 100229 ， January 11 ， 2023 NE Ⅰ2022 年 The Author （ s ） 1thisIS AN open 开放access 访问article 文章Under The cc BY-NC - ND license 许可（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）.llOPENACCESS访问Article文章（ Legend continued on next ）页 ）2Cell Genomics 细胞 基因 组 学3，100229 ， 1 月 11 日 ，2023R = 0.40log 2Fold change of近基因C tAAABCD0DcellD16Il—13D23批量 RNA-seqscRNA-seqH3 K27ac 问题Chip-seq的50-5-50550-5-505typeIl—13-+—+-+SFNloxl 4 的CCL 26邮政相对 性expressione1log 2 FoldChange in 巴塞尔CELLlog 2 Fold曲名 ： Changein CiliatedCELLRARRES 3系列-3.30 03.3核Transcribed 的mRNA 中catabolic 类进程WarsAKR1A 1 的ARF 4KRT 23Serpinb 2的CTSCSerpinb 3的Serpinb4 的IDH 1fetubANXA 4 的SCDALOX 15的CMYK 5CDH 26F0.80.60.40.20G丰富Coefficient的细胞 质 翻译 病毒 基因 表达 翻译 起始 Nonsensemediated英文 名称 ：TransmembraneTransport Organic AcidAnion运输Cellular 细胞modified 修改Amino acid metabolic代谢制程 Carboxylic acid运输塞浦路斯 -or Flagellum Dependent 相关cell motility cilium 相关Movement 运动英文 名称 ： Axonemeassembly microtubulebundleFormationAxonemal 的Dyna Complex assembly 一起H1151102520151050goblet 的cell晋升 者（<（ 1 KB ）（ 32.3% ）4提升 器 （ 1 - 2KB ）（ 1.81% ）促进 器 （ 2 - 3 KB ）（ 0.78% ）5 ' UTR（ 1.55% ）3'UTR（ 8.27% ）2第 1 Exon（ 91% ）其他 Exon（ 8.27% ）1st intron 第 一（ 8.27% ）Otherintron 介绍（ 13.18% ）02013 年 第 十 届 中国 （<（ 300 ）（ 0.26% ）X10-11-31-29-5-2.502.5丰富Coefficient 的i新motif Discovery 发现% 或Target 目标跨 基因 Distal Intergenic（ 20.41% ）-2% 或background 背景RankMotifp值sequences with 结果motifsequences with 结果motifCtACtAGCAGtAGCACGttCGGCtACGtAAtCGFigure 1的IL - 13 诱导 细胞 类型 选择 性 基因 表达 变化 的 每 一 个 主要 亚 群 的 支 气管 上皮 细胞 ， 和 丰富 的 H3 K27 ac 峰 近 IL -13 - 刺激基因(A) Scheme 计划for文化primary human BRONCHIAL 的epithelial 的CELL（ HBECs ）at AN Air Liquid 航空Interface 接口（ Ali ）with Il - 13刺激 。 on DAY 0,CELL are Predominantly 基础CELL（ 橘色 ） 阿里Culture allows 的Differentiation 区别Into ciliated 的（ Magenta ）及秘书 处CELL（ CYAN ） 。 The mucin5 B（ MUC 5 B ） - 丰富穆GEL Layer（ RED ）changes to a MUC 5AC-rich gel （ green ） upon IL - 13 相关 信息刺激 。（ B及C ）effects 影响of Il - 13 on秘书 处CELL compared 比较with基础CELL（ b ）or ciliated 的CELL（ c ） 。 EACH point Presents 介绍A A Gene 。Genes that Were受 管制Differently Between 之间cell类型are SHOWN在Black（ log 2Fold change Difference 区别> 1及FDR <0.1 for interactions Between celltype 及 Cytokine 。 效 果 ） ， 及 Other 基 因 我 们 在 灰 色 的 。 R 皮 尔 逊 相 关 系 数 （ Pearson correlation coefficient ） <2.2 3 10-16 for both 相 关comparisons ） 。(D) 20 个 基因 的 相对 表达 与 最 高 绝对 值 IL - 13 - 诱导 折叠 变化三 种 细胞 类型 中 的 任何 一 种 。p< 2.2 X 10-16p = 7.0R = 0.42log 2 FoldChange insecretory 安全log 10p 值11 E - 11782.1725.91GGtllCell Genomics 细胞 基因 组 学3， 100229 ，January 11 ， 20233(E) Geneset丰富analysis of IL - 13 - induced （ IL - 13 诱导 ）cell Type 选择 性Responses 的在HBECs 。 相对 性丰富Coefficient 的Were calculated 估计forThe Full 2,555 个 基因 遗传 学 生物 过程 （ GOBP ） 基因 集 的 集合 ： 五 个 GOBP 基因 组 在 基础 ， 辅助 和 安全 细胞 中 最 高 由 IL - 13 诱导 。<10-5一种 细胞 类型 和 丰富 的 coefficient< 5.0 In Other Cell 其它类型 ） 。(F) IL - 13 - induced （ IL - 13 诱导 ）基因在秘书 处CELL are Highly 的丰富for A A previously 预测defined set of GOBLET cell基因不是included在GOBP 。 for比较 ，unlabeled points represent values for the full collection of 2.555 GOBP 基因 的 当前 价值sets 。(G) 分布 IL - 13 - enriched H3 K27 ac 峰 （ N = 387 ）分类 。（ Legend continued on next ）页 ）4Cell Genomics 细胞 基因 组 学3，100229 ， 1 月 11 日 ，2023llOPENACCESS访问Article文章Article文章llOPENACCESS 访问HBECs。大规模并行报告者分析（MPRA）技术允许同时描述其监管活动的序列和变量。20本 规范 性 元素 可 用于 治疗 目的 ， 纳入 缺乏 核 酶 的 基因 编辑 系统 ， 用于 转录 调制器 。CIS治疗 法 Therapy（ CRT ） 。21在此，我们利用多个基因组方法（RNA测序[RNA—seq]，H3K27 ac ChIP—seq，和单细胞RNA—seq [SCRNA—seq]）来表征基因，调控元件，以及参与IL—13气道上皮反应的途径，一种复盖基底，已适应的复杂细胞，以及不太常见的细胞类型。该研究已在相关系统中使用了一些方法。一项先前的研究使用SCRNA—seq来识别IL—13刺激对培养人类气管上皮细胞的细胞类型—特异性效应。22Another Study 其它 研究23使用 H3 K27分析 来 比较 健康 控制 个体 和 患有 哮喘 的 个体 所 培养 的 细胞 的 调节 性 景观 ， 尽管 这些 细胞 是 在 不 促进 细胞 分裂和 IL - 13 刺激 效应 的 条件 下 培养 的 。因为在这些先前的研究中，气道上皮样本类型之间存在重要差异，We chose touse a single model that has been well character . 我们 愿意 用一 个 已经 很 好 的 特点 的 单一 模型 。11，13，24让 我们 更 好 地关联 基因 表达 和 表 观 遗传 变化 。我们利用MPRA和个别记者分 析 来 识 别 IL—13—responsive 监 管 元 素 。 Using our topMPRA—derived element，a novel使用我们的顶级MPRA—衍生元素，一个新的元素SPDEF增强IL—13特异性和安全性细胞选择性，我们需要利用CRISPR干扰（CRISPRi）—基于治疗的方法来减少关键哮喘相关基因的表达。我们 的 结果 识别 气道 上皮 细胞 中 的 关键 基因 和 调控 元件 ， 并 演示 如何 增强 者可 用作 治疗 开关疾病 |结果Characterization 特性of IL - 13 反应 式基因关于 PathwaysWeused ScRNA-seq 问题两 个IDENTIFY 身份Il - 13 effects影响on primary HBECs（Figure 的1 a ） . HBECs Grown在Air Liquid 航空Interface 接口（ Ali ）Differentiate 区别和 再capitulate 气道 上皮 细胞 类型 湖泊在 vivo including 包括ciliated 的及GOBLET CELLS 。25HBECs from Four Were 个人Grown在阿里for 16 Days ，及then半of The Cultures 文化Were Treated 的 with Il - 13 for 7 Days 两个 induce 穆hyperplasia 的 。 11 ， 13CELL Were harvested ;及utilized forScRNA-seq ，yielding 的数据 for ~ 2,000 CELL for EACH条件（Figures 的S1 S1 C ） ？The 10 . 已知 数列 {an} 是 等差数列 ， 求 数列 {an} 是 等差 数列 {an} 的 首 项 ， 求 f（table S1）Were持续 性with our 我们Prior analyses of模拟器 Cul Tures By Flow （ 英 语 ： Cul Tures by Flow ）cytometry 的 。2403 - 13 张 春 芳 （ 03 - 13 张 春 芳 （Figures 1 数据B - 1D ;table S7）. to quanify 数量cell Type 选择 性效果 ，We used AA linear 模型with terms for cell类型 ，Cytokine 。效果 ，及The两 个 人 之间 的 互动 。在这个模型中，安全细胞与其他两种细胞类型的每一种细胞相比较。根据 IL - 13 刺激 之间 的 相互 作用 确定 的 IL - 13 细胞 类型 效应及cell type（ log 2Fold changeDifference 区别> 1及false discovery 错误 发现rate [ FDR ] <0.1for The interaction（ 术语 ） 。 cell Type-SPE - Pacific 类型effects 影响Were Found for 292基因在秘书 处CELL 166 个 基因 与 干 细胞 比较 。10—13张智霖（03—13张智霖（Figure 1的e；台式机S8）. 2013 年 12 月 21 日@下午 12 时 29 分 i = =邮政1 ， 则 b2 = （Serpinb 2 的2 型 2 型 哮喘 的 两 个 显著 特征 （ Two Established Markers of Type 2 - High Asthma ）2The支持 Type 2 inflammatory 相关基因C-C Motif Chemokine化学12 - 26 刘 文 强 （CCL 26 -05 - 25 王 思 聪 （ 05 - 26 刘亚 芳 （ALOX 15 的），26基因 在 细胞 功能 和 离子 秘密 中 的作用正如 预期 的 ， IL - 13 诱导 的 Tran - scripts 在 安全 细胞中 高度 丰富 的 goblet 细胞 基因 组 在 人类 肺 上皮 细胞 的SCRNA-seq 分析 中 预先 定义27（Figure 的1 f ） 。我们比较了我们的结果，来自对IL—13刺激对气管上皮细胞的影响的先前研究。22我们 发现 的 200 个 基因 中 ， 大多 数 是由 我们 诱导 的7 Days of Il - 13鼓励（ Fold ）increase 增加>1.98, FDR <05 （ The ）Previous Study Found Significant 重要的increase 增加for 71基因后 48 H of Il - 13鼓励及69基因After11 Days of Il - 13 stim-ulation ：（ defined AS Fold change>1.28, FDR <0.05在that Study ） 。在 总共 ， 103 of the 200most highly induced genes in our study were . 在 我们 的 研究是 200 最 高 诱发 的 基因 中 有 103诱导 的at 48 H and/or ：11Days在The Previous Study 。 given differences 有 什么 不同在cell Culture 模 型 （G ，Medium ， Il - 13 治 疗时 间（Treatment Duration ） 及 ScRNA-seq 问 题 平 台， thisPresents 介 绍 A A substantial overlap 基 本 叠 加 在 The 基 因IDENTIFIED 身份Between studies 。 However ，几乎 一半 的基因 ， 我们 确定 是 IL - 13 最 高 诱导 的不是IDENTIFIED 身份在The Prior Study 。 SPDEF，A A Transcription 转录fac -Torshownpreviouslytoberequiredforgobletcelldifferentiation and goblet cell 区别 及 需要 的 门MUC 5AC 的生产 ，12，13，28何 为Among 先生The 200 Most高 IL - 13 诱导 的基因 在 我们 的 研究 中 的 安全 细胞 （ 1.99 - fold ， FDR ）310-18）. Although 的SPDEF在 IL - 13 刺激 后 48 小时 或 11 天未 报告 的 显著 增加 。The Prior Study ，A A伪 时光analysisof that Prior数据Did Indicate 指数increased 增加expression ofSPDEF during 的 GOBLET cell differ - entiation 。 22By ApplyScRNA-seq 问题两 个The具体model系统 We Characterized 特性在our 我们Prior Work ，We IDENTIFIED 身份many 3 、 选择 性 诱导 的 附加 基因 Additional Genes that Were SelectivelyInduced By Il - 13 号To analyze whether the cell type—specific response to IL—13 was a general cytokine response phenomenon or limited toIL—13 ， we generated similar scrna—seq datasets for twoother cytokines：我们分析了细胞特定类型的反应，IL—13是一Cell Genomics 细胞 基因 组 学3， 100229 ，January 11 ， 20235种一般的细胞因子反应现象或有限的IL—13，我们生成了两种其他细胞因子的similar scrna—seq数据集：IFN——A A在IL—17。ifn -A A Produced a similar tran - scriptional （ 类似Tran - scriptional ） response 在 EACH of The 少 校 cell 类 型（Figures 的S1 D ，(H) Bulk 数量RNA-SEQ 的expression Changes在基因Closest两 个H3 K27 ac 问题Chip-seq 的Peaks that Were不是Significantly 重要 的Affected 影响（ P>0.1 ）By Il - 13（ no D，26,875 Peaks （重要 性 （ FDR ）

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