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SARS-CoV-2基因沉默:潜在siRNA和miRNA序列预测与治疗应用
+医学信息学解锁24(2021)100569潜在siRNA和人miRNA序列沉默orf1ab相关基因,用于未来的治疗,SARS-CoV-2Mahedi Hasan,Arafat Islam Ashik,Md Belal Chowdhury,Atiya TahiraTasnim,Zakia Sultana Nishat,Tanvir Hossain,Shamim Ahmed*生物化学和分子生物学系,Shahjalal科技大学,Sylhet 3114,BangladeshA R T I C L EI N FO保留字:基因沉默miRNAsiRNACOVID-19SARS-CoV-2转录后调控A B S T R A C T2019年冠状病毒病(COVID-19)是由称为严重急性呼吸道综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)的RNA病毒引起的持续大流行。SARS-CoV-2基因组全长约30 kbp。SARS-CoV-2基因组中含有最大的开放阅读框1ab(ORF 1ab)基因,编码与病毒转录和复制有关的多聚蛋白PP 1ab和PP 1a。几种疫苗已经得到世界各地有关当局的批准,以在人群中发展群体免疫力。与此同时,RNA干扰(RNAi)技术有可能加强对抗这种病毒的斗争。在这里,我们已经实现了一种计算方法来预测潜在的短干扰RNA,包括小干扰RNA(siRNA)和microRNA(miRNA),这被认为是对SARS-CoV-2具有内在活性。在此过程中,我们筛选了针对ORF1ab基因的miRNA文库和siRNA文库。我们利用一系列生物信息学工具预测了潜在的miRNA和siRNA候选分子。通过扩展分析,在24个潜在的pre-miRNA发夹和131个siRNA中,12个人miRNA和10个siRNA分子根据它们的GC含量、解链温度(Tm)、热容(Cp)、杂交和最小杂交自由能(MFE)被分类为潜在的抗SARS-CoV-2治疗剂。这项计算研究的重点是减少传统的基于试验和错误的湿实验室方法所需的大量时间和劳动力,它有可能成为未来研究人员开发成功RNAi治疗药物的基础。1. 介绍SARS-CoV-2是一种阳性单链RNA病毒,自2019年12月以来,它已使全球数百万人患病。由该病毒引起的疾病COVID-19最终导致呼吸衰竭,然后发展为多器官衰竭[1,2]。由于传播率较高,该病毒已扩散至全球各地,导致COVID-19疾病大规模爆发,随后,COVID-19被宣布为全球大流行[3]。自中国武汉市首次报告聚集性患者以来,该病毒已在全球范围内夺走了200多万人的生命,而且人数仍在日益增加[4]。终止在这场全球性的大流行中,研究人员正在与时间赛跑,开发疫苗和抗病毒药物。他们的努力正受到病毒频繁突变的挑战,这种突变导致了传播率更高的变异[5]。也有一些实例和报告,无效的一些批准的疫苗对新的变种[6SARS-CoV-2有几种变体,所有变体都具有共同的基本特征。该病毒已被归类为冠状病毒科,具有近30 kb长的ssRNA基因组,并且有四种主要类型的结构蛋白构建衣壳[9]。在感染的初始阶段,SARS-CoV-2将其刺突糖蛋白(S蛋白)发射到血管紧张素转换酶2缩略语:SARS-CoV-2,严重急性呼吸综合征冠状病毒2型; COVID-19,2019冠状病毒病; ACE-2,血管紧张素转换酶2; ORF,开放阅读框; RNAi,RNA干扰;miRNA, microRNA; siRNA , 小 干 扰RNA;Tm, 解 链 温 度 ;Cp, 热 容; TMPRSS 2, 跨 膜 蛋 白 酶丝 氨 酸 2; sgRNA, 亚 基 因 组 RNA; UTR , 非 翻 译 区 ; hsa-miR, 人microRNA。* 通讯作者。电子邮件地址:shamim1174-bmb@sust.edu,shamim1174@gmail.com(S。Ahmed)。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100569接收日期:2020年12月17日;接收日期:2021年3月26日;接受日期:2021年3月31日2021年4月8日网上发售2352-9148/©2021的 作者。发表通过 Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页:http://www.elsevier.com/locate/imuM. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)1005692图1.一、整个步骤的流程图。总结了本研究中采用的完整过程的图形表示血管紧张素转换酶-2(ACE-2)受体,主要在人体的肺和气道中丰富。在宿主细胞外表面发现的弗林蛋白酶或跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)等酶在几个特定位点切割S蛋白,以暴露融合肽,帮助SARS-CoV-2膜与宿主细胞膜融合。这融合允许SARS-CoV-2的RNA基因组进入宿主细胞[10]。SARS-CoV-2的复制-转录复合物(RTC)转录病毒负链亚基因组RNA(sgRNA)翻译结构性和非结构性辅助蛋白。在包括SARS-CoV-2在内的所有冠状病毒基因组中,M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)1005693=ORF编码结构蛋白,如S蛋白、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)[11]。ORF1ab的5′端区域(21,291个核苷酸长)含有重叠的开放阅读框编码多聚蛋白PP1ab和PP1a。这两种多聚蛋白都作为16种非结构蛋白(nsp 1至16)的前体[9],除此之外,这两种多聚蛋白在病毒复制、转录、免疫应答调节中具有重要作用[12,13]。由于这些蛋白的重要功能,pp 1ab和pp 1a沉默的相应基因可以下调SARS-CoV-2的所有基因组和复制子组分的整体表达。因此,ORF1ab可能是RNAi介导的基因沉默的靶点。RNAi是由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默机制,所述双链RNA是内源性pre-miRNA前体或外源性较长siRNA [14,15]。因此,dsRNA可用作病毒基因的同源mRNA的降解剂[16因此,病毒活性也可以通过RNAi技术控制。RNAi机制起始于RNA酶-III样蛋白Dicer切割dsRNA,导致较短的RNA酶切割。具有2-3个核苷酸突出端的21 所产生的较短的干扰RNA随后被掺入。RNA诱导沉默复合物(RISC)[20]。由RNAi相关解旋酶介导的较短dsRNA的解旋导致一条链(过客链)的丢失[21]。RNAi(miRNA或siRNA)的另一条链(引导链)指导RISC介导的靶mRNA的识别和切割(与病毒反义寡核苷酸strand)[22miRNAs存在于高等真核生物基因组中,在转录后水平调控基因表达。通常,RNA聚合酶II转录长发夹结构的初级miRNA(pri-miRNA).DGCR 8(dsRNA结合蛋白)和Drosha(RNA酶III蛋白)微处理器复合物切除pri-miRNA以制备前体miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA分别通过exportin蛋白输出到细胞质中,并被RNase III型Dicer蛋白切割成短的双链miRNA。然后,加工的miRNA反义引导链被RISC识别并结合部分互补的靶mRNA。miRNA引导链与mRNA的部分结合通过抑制核糖体导致翻译抑制,有时在RISC Argonaute蛋白的帮助下导致mRNA降解[25]。然而,siRNA是基因组完整性和对外源侵入性核酸(如病毒基因组)的反应的捍卫者[26]。siRNA本质上是外源性的,或通过实验设计,在纳米颗粒载体的帮助下,通过在细胞质中引入长的非编码双链RNA,在转录后水平调节基因表达[27]。siRNA导入细胞后,被RNase III型Dicer蛋白切割,成为短的双链siRNA。与miRNA的作用机制相似,siRNA也 结合到 的 互补 mRNA。 不像 miRNA, 一个完美互补性 之间 siRNA 引导 链 和 目标 mRNA是这对于保证RISC的Argonaute蛋白降解mRNA至关重要[28]。在最近的一些研究中,已经探索了miRNA和siRNA作为一种新的治疗方法。针对多种病毒的抗病毒防御,包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)[292018年,一种siRNA药物(Patisiran)获得了美国食品和药物管理局的(FDA)[41].使用miRNAs作为抗HCV治疗在早期试验中显示出有希望的疗效和安全性结果[37],shouldn’t be overlooked that siRNA has already been applied乙型肝炎感染[42]。因此,可以推测RNAi治疗剂将能够以序列特异性方式有效地抑制SARS-CoV-2的mRNA,因此可以作为潜在的抗病毒治疗剂[41]。由于COVID-19的不稳定局势,要求寻找不同的替代解决方案来共同对抗病毒,因此开发有效的治疗方法已经发挥作用。利用基于RNAi技术的治疗方法对抗COVID-19具有特异性和有效作用于靶点的潜力[43,44]。在本研究中,SARS-CoV-2病毒基因组扫描,以确定潜在的siRNA和细胞的miRNA分子的沉默的ORF 1ab编码的mRNA使用计算方法。 本研究中采用的计算方法使用编码SARS-CoV-2 mRNAs的ORF 1ab来预测作为抗SARS-CoV-2的抗病毒药物的miRNA和siRNA。通过预测平台VMir筛选候选miRNA,该平台通过从头计算方法完全预测来自任何给定病毒基因组的pre-miRNA [45]。与miRNA一起,通过siDirect程序(http://sidirect2.rnai.jp/)鉴定来自病毒基因组序列的siRNA,所述siDirect程序实施快速且灵敏的同源性搜索算法以确保用于哺乳动物RNAi的功能性和脱靶最小化的siRNA设计[46,47]。基于不同的参数,如GC含量、折叠自由能、结合自由能、解链温度、来自最初发现的候选RNAi分子的功效预测,对几种最佳siRNA和miRNA分子进行了分类(图1B)。 ①的人)。COVID-19造成的损害程度与日俱增。的从分析中预测的siRNA和人miRNA将能够有助于对抗SARS-CoV-2。此外,对于可用的插入技术,特异性和成本效益[48],RNAi将成为下一代治疗方法,因此,这项研究可能为建立针对SARS-CoV-2的RNAi治疗方法作为COVID-19的有效治疗2. 材料和方法2.1. 序列采集与分析使 用 从 National Biochemistry 数 据 库 获 得 的 核 苷 酸 序 列 ( GB :NC_045512.2)进行针对SARS-CoV-2的RNAi预测。中心为生物技术信息(NCBI)。为 的“ORF1ab NCBI 图形 数据库 是 使用 到 获取 的266-21,555bp的核苷酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/comnuccore/NC_045512.2?报告图表)。检索ORF 1ab基因序列后,使用BLAST(基本局部比对搜索工具)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)观察GenBank(美国国立卫生研究院(NIH)遗传序列数据库)中全球所有可用的SARS-CoV-2毒株之间的序列利用在线工具ORF finder从参考序列中筛选检索到的ORF 1ab基因的编码区。2.2. 潜在的miRNA和siRNA设计使用VMir Analyzer程序仔细检查SARS-CoV-2病毒基因组的ORF 1ab基因的核苷酸序列中发夹结构的miRNA前体[49,50]。VMir是一种分析程序,专门设计用于识别病毒基因组中发夹结构的pre-miRNA。通过VMirviewer,观察到潜在的发夹样结构作为候选miRNA前体。为了从VMir中获得真正的pre-miRNA,自定义设置最小60个核苷酸,最大220个核苷酸和最小115个发夹评分的[51]使用。通过应用miRBase [52,53]的重复性方法,筛选从VMir中提取的候选发夹miRNA序列与所有人microRNA的序列相似性,miRBase是一 个可 搜 索 的已 发 表miRNA 数 据库 。 在 miRBase 数 据库 中 , 使用BLAstarch搜索算法检索病毒pre-miRNA发夹与人miRNA之间的序列同源性,E值为10。siDirect 2.0版[54]是一个设计siRNA的在线网络服务器,用于预测靶基因ORF1ab的可能siRNA。这个更新的网络服务器使用快速,灵敏的同源性搜索算法,以确保哺乳动物RNAi的功能和脱靶最小化siRNA设计在siDirect位点标记了几个参数以获得潜在的siRNA,包括低于21.5°C的解链温度,GC含量31.6%-M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)1005694=-图二. SARS-CoV-2基因组VMir分析的图形视图。A. 默认B。过滤后预测的pre-miRNA(最小发夹大小:60 nt,最大发夹大小:120 nt,最小发夹评分:115,最小窗口计数:25)。蓝色三角形表示正向,绿色菱形表示反向。(有关此图例中颜色的解释,请读者参阅本文的Web版本[55]组合规则(算法 有 给定 在 补充表S1)。并计算了种子-靶标双链体稳定性(Tm),这是RNA双链体形成的基础。2.3. 脱靶最小化和GC含量计算使用默认参数针对人基因组加转录物数据库操作siRNA的核苷酸BLAST(BLASTn)程序,以检查基因组中任何非靶向位点的脱靶序列 。 因 此 , 使 用 基 于 网 络 的 服 务 器 GC Content Calculator(http://www.endmemo.com/bio/gc.php)来计算预测的siRNA和miRNA中GC含量的确切百分比。2.4. RNA-双链体的热容和浓度图的计算RNA-双链体的集体热容表示为Cp,并且在将其绘制为温度的函数之后,解链温度TmCp是热容曲线的局部最大值。使用包含热容图,其中解链温度Tm(Conc)表示双链分子浓度变为其最大值的一半时对于miRNA和siRNA,使用DNAmelt Server [ 60,61 ]测量TmCp和Tm(Conc),包括两条不同 链 的 杂 交 选 项 ( http : //unafold.rna.albany.edu/? qDINAMelt/Hybrid 2),具有默认值和简单形式的标记RNA选项。热容图是由服务器基于相对于温度的组合自由能分布的数值微分计算绘制的。2.5. miRNA的杂交及二级结构预测使用在线免费访问的RNA杂交网络服务器[62,63]来预测杂交并计算病毒前体miRNA与潜在人miRNA的互补模板为了选择潜在的miRNA,使用10 kcal/mol的能量阈值作为截止分数。根据配对能对RNA杂交结果进行分类。RNAfold是预测单链RNA或DNA序列的二级结构的另一个网络服务器(na.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi获得了两种类型的杂交模式从RNA折叠此Web服务器已验证结果M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)100569表55前体miRNA发夹序列与人miRNA的比对,相应的VMir评分、E值、TmCp和Tm(C onc)。基于MFE和质心模型之间生成的集合多样性和相似性。2.6. 预测的siRNA分子为了检查siRNA分子的有效性和实际功效,在线免费访问服务器siRNApred(http://crdd.osdd.net/raghava/sirnapred/)。在该方法中,使用支持向量机算法和二进制模式预测方法针对Main21数据集筛选siRNA分子。 为了评估有效性程度,与siRNApred一起,还使用i-Score Designer工具[64]基于计算i-score和s-Biopredsi评分的第二代算法来检查预测的siRNA分子。2.7. siRNA的二级结构预测及RNA-RNA相互作用使用MaxEX pect [65]程序预测siRNA的二级结构以及各自的折叠自由能,RNA结构网络服务器[66]。这里,预测的siRNA的引导链经受RNA结构网。在MaxEX pect程序中,核酸序列不得超过4000个核苷酸,而其他参数保持默认值。此服务器使用SHAPE映射数据进行折叠。之后,为了计算病毒siRNA和靶序列之间的热力学相互作用,RNA结构网络服务器,包含bifold部分(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/bifold/bifold.html)。这两个序列都不超过250个核苷酸,这是该服务器的双折叠部分的先决条件之一。其他参数,如最大能量差百分比和温度保持在其默认值。3. 结果3.1. VMir预测的潜在前体miRNAORF 1ab基因占SARS-CoV-2全基因组的三分之二,是SARS-CoV-2中第一个含有M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)1005696表2microRNA和病毒大发夹RNA之间的能量有利的杂交,GC%和与靶标结合的最小自由能(MFE)。所有重要的编码区经BLAST分析,GenBank中所有SARS-CoV-2毒株的ORF 1ab基因序列同源性为99.99%。因此,利用保守序列设计miRNA和siRNA将具有更广泛的功效。使用VMir Analyzer程序仔细检查ORFlab基因的发夹结构的miRNA前体,并通过VMir Viewer用评分长度和评分以图形方式可视化候选miRNA前体。在默认设置中,发现了61个候选发夹,如图2A所示。通过使用自定义设置,发现了24个潜在的pre-miRNA发夹用于进一步分析,如图1B所示。 2 B.3.2. 利用miRBase从前体pre-miRNA预测相同的人类miRNAs通过miRBase在线服务器搜索前体miRNA的候选前体序列与所有人miRNA的基于显著的序列相似性,将12个序列鉴定为候选miRNA前体[示例表S2],其显示与人miRNA的最小16 bp相似通过正向(MD)和反向(MR)区分pre-miRNA的前体。所有12个pre-miRNA前体均为MD 7,MD18、MD23、MD42、MD55、MD64、MD66、MD70、MR11、MR33、MR38、MR 43与16种人miRNA具有相似的同源性(表1)。3.3. 使用siDirect进行在siDirect位点标记几个参数以获得潜在的siRNA。参数包括Ui-Tei、Renold、Amarzguioui组合规则,GC含量从31.6%到57.9%,熔融温度低于21.5℃,以减少种子依赖性脱靶效应。基于这些根据siDirect位点的上述参数,发现了131种潜在的siRNA(补充表S2)。利用最近邻模型和siRNA双链体形成的热力学参数,预测了种子-靶双链体,并对所有siRNA双链体进行了预测。观察到Tm值低于21.5° C(补充表S3)。3.4. miRNA和siRNA的显著GC含量以及siRNA的通过GC含量计算器计算预测的miRNA分子和siRNA分子M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)1005697图三. 预测的SARS-CoV-2潜在候选发夹的二级结构。 仅描绘了质心结构。M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)1005698--表3具有GC%、与靶标的结合自由能(MEF)、TmCp、Tm(Conc)、有效性(二元)、s-Biopredsi评分和i-Score的有效siRNA分子地点:mRNA内靶点mRNA内的siRNA靶向预测的siRNA双链体siRNA候选人在37摄氏度GC%(%)MFE(kcal/mol)TmCpCTm(浓度)C有效性(二进制)s-Biopredsi评分i-分数s1 3051CAGUUGUUCAGACUAUUGAAGs2 3136GGAAGAAGCUAAAAAGGUAAAs3 3318卡卡卡s4 3869GUUCAAGAGGGUGUUUUAACUs5 8981GGUGUUGUGUAUCUACUAGUs6 9002GGGUAGAUGGGUACUUAACAAUs7 11664CUCAAUGUGUCCAGUUACACAs8 13404CUCUAACUACCAAACUGAGAGAs9 17690GARTAUGUCUGAUAGAGACCs10 18338GCUUUGAGUUGA38.1-34.80 81.4 80.7 1.008 0.830 66.938.1-33.90 83 81.6 1.062 0.863 84.442.86-35.00 83.1 81.9 1.072 0.807 67.333.33-31.50 82.5 81.3 1.031 0.781 66.838.1-34.40 82.6 81.2 1.001 0.873 78.842.86-36.80 84.7 83.4 1.024 0.762 69.747.62-38.40 84.9 83.8 1.003 0.643 62.733.33-32.70 81.2 79.9 1.018 0.832 71.333.33-33.00 80.2 79.3 1.049 0.838 72.138.1-34.80 83.3 82.1 1.037 0.849 75.9miRNA和siRNA的所得GC含量分别为33.94%-45.21%(表2)和33.33%此外,预测的siRNA的脱靶率低于其他siRNA。siRNA,并且与人类基因组和转录物序列数据库没有显著的序列相似性,这使得它们仅对靶位点非常有效。3.5. 根据热容和RNA双链体浓度,使用DNAmelt Server,测量miRNA和siRNA的TmCp和Tm 这两个熔融温度的较高值-结果表明RNAi种类的效率更高。TmCp和Tm(浓度)值范围为43 ℃至87.8 ℃和40.4℃至87.8 ℃。79.6对于miRNAs,分别为0.0000000和0.0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 类似地,siRNA的TmCp和Tm(Conc)值范围为79.6℃至87.6℃,78.286.3° C(补充表S2)。3.6. miRNAs的杂交及二级结构预测RNA杂交网络服务器[63]用于显示潜在病毒前体miRNA与潜在人miRNA的复合模板之间的它们相应的最小杂化自由能在表2中给出。最小杂交自由能为10 ~ 17.2 kcal/mol。 RNAfold用于预测预测的miRNA的二级RNA结构,如图1B所示。3.第三章。后来,基于显著的序列相似性、杂交和所有其他参数,预测了12种潜在的靶向SARS-CoV-2的细胞miRNA所有的预测的人miRNA分别是hsa-miR-3675-3p、hsa-miR-492、hsa-miR3.7. 预测siRNA的验证最可能siRNA的选择&siRNAPred用于检查预测的siRNA分子的有效性和有效性,并且大于1的值被认为是高度有效的。 在131个 siRNA 分子,29个siRNA 关于orf1ab结果显示,这是非常有效的(数值>1)。这29个siRNA分子是主要选择为进一步分析.此外,为了为了证实预测的siRNA,使用i-Score Designer来检查来自siRNAPred的siRNA的一致性。两种情况下的结果基本相似(表3)。3.8. 利用RNA-RNA相互作用预测SARS CoV-2 ORF 1ab的siRNAsRNA结构网络服务器用于可视化可能的折叠和折叠的相应MFE(图4)。正值(值>0)表示更好的申请者,因为那些分子不太容易折叠。预测的siRNA的值在1.5-1.8的范围内。根据引导链的折叠结构模式,筛选出10个siRNA,选择,这表明不成对的终端和较少的折叠程度。此外,通过使用RNA结构网络服务器的bifold部分,预测所选siRNA和靶序列的杂交RNA结构(图5)以及它们相应的杂交MFE(表3)。最后,根据GC百分比、Tm值、siRNA有效性、自由能和折叠等指标,筛选出10个最有可能针对SARS-CoV-2 ORF 1ab基因的siRNA4. 讨论冠状病毒拥有RNA病毒中已知最大的基因组之一[67,68],其导致多种物种的呼吸道疾病,包括蝙蝠,鸟类,猫,狗,猪,小鼠,马,鲸鱼和人类。迄今为止,已发现七种类型的冠状病毒传播给人类[69],其中SARS-CoV-2已被证明是最致命的。SARS-CoV-2的基因组含有编码orf 1ab多聚蛋白的ORF 1ab基因,该多聚蛋白负责病毒RNA的复制和转录[70]。该基因还编码16种非结构蛋白[9],这些蛋白在欺骗宿主免疫系统中起着至关重要的作用。本研究利用ORF 1ab的RNA序列预测了针对SARS CoV-2的干扰RNA分子干扰RNA是小的非编码RNA,其通常在靶mRNA表达的负调控中起作用,在靶mRNA表达的后-转录水平上起作用。转录阶段在miRNA的情况下,部分互补性(2-7 bp长)足以阻断翻译。另一方面 mRNA的3 ′非翻译区(UTR)的 完 全 互 补 性siRNA的种子区域导致基因表达的有效沉默[71]。miRNA和siRNA在许多关键的生物学过程中发挥重要作用,如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育和细胞凋亡[72]。像差M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)1005699图四、分别针对SARS-CoV-2的ORF1ab序列的预测siRNA引导链的二级结构的可能折叠和最小自由能值的表示,s1。 UCAAUAGUCUGAACAACUGG,s2.UACCUUUUUUAGCUUCUUCCAC , s3. UGUUUAGCAAGAUUGUGUCC , s4.UUAAAACACCCUCUUGAACA , s5.UAGUAGAUACACAAACACCAG , s6.UGUUAAGUACCUCACC , 第 7 节 。 UGUAACUGGACACAUUGAGCC , s8.UUGUUGGUAGUUAGAA,s9. UCUCUAUCAGA UAUGCAA,和s10。AUAGAUGUCAACUCAAAGCCA。siRNA与表3中提供的信息对称。这些RNA的功能已经与各种疾病有关,如癌症[72,73],心血管疾病[74,75],精神分裂症[76,77]和牛皮癣[78]。如今,研究正集中于利用miRNA和siRNA的基因沉默机制来治疗包括癌症[79]和心血管疾病[80]在内的疾病。基于这些研究的见解,我们利用了几种生物信息学工具来预测基于miRNA的SARS-CoV-2治疗方法。为了确定有效的和靶特异性的miRNA,首先通过VMIir分析仪分析ORF 1ab基因序列,其中发现了24个pre-miRNA发夹。这些pre-miRNA根据内切酶切割的方向(正向或反向)分为MD或MR。MD被分类为功能活性miRNA双链体,裂解 通过 的 rna酶 III 内切酶 Dicer 从 的 5 ′ 结束pre-miRNA。另一方面,MR被分类为功能活性的miRNA双链体,其被相同的酶切割,但从pre-miRNA 的3′ 端切割。对于任何给定的pre-miRNA,加载在Argonaute蛋白上的正向或反向miRNA链主要取决于细胞类型或细胞环境[81,82]。之间 如表1所示,发现24种前体miRNA发夹,12种符合依赖于与所有人miRNA的显著序列相似性的标准。miRNAs种子区(2-7 bp)位于3 ′端的部分比对已经发现候选miRNA前体的UTR在基因沉默期间是显著的[51]。基于所分选的miRNA前体分子与宿主miRNA序列的序列相似性,这些可用于预测针对SARS-CoV-2感染的抗病毒治疗。理论上,人miRNA应该具有通过结合mRNA的特异性序列而潜在地沉默相应病毒基因的能力。由于人(宿主)miRNA可以通过转录后mRNA衰减使相应的基因内源性沉默,因此它们的agomiR(选择的相似测序的miRNA前体)也将能够使外源途径中的基因表达沉默。在本研究中,通过GC含量计算器测定,所有选择的pre-miRNA发夹含有33.94%-45.21%的GC含量。 在选择miRNA时避免富含GC的靶位点以减少自身二级结构形成的潜在机会。除了最小的自由能杂交,杂交之间的PO-确定潜在病毒前体miRNA和潜在人miRNA的互补模板,其中观察到最显著的结合(表2)。最后,经过三个步骤的过滤(最小自由能,GC含量和显著的杂交),12个中只有8个miRNA前体保留下来。从MD7,MD18, MD55, MD64,MD66, MD70、MR33和MR43发夹将 被 的 最好 候选人 靶向 人细胞其中发夹MD55的miRNA与hsa-miR-548 b-5 p、hsa-miR-624- 5 p、hsa-miR-4640- 5 p表现出显著的序列相似性。hsa-miR- 624 - 5 p位于人染色体14 q12 [ 74,83 ],其赋予治疗相关性。hsa-miR-624-5 p可以在体外抑制肝母细胞瘤细胞的生长[ 84 ],也可以作为病毒检测生物标志物[85].其他7种miRNA前体也显示出与另外9种人miRNA的相互作用,分别如表2所示,并且可以 在宿主-病原体相互作用中起重要作用。然而,miRNA在人体组织中的表达频率并不相同[86]。人类基因组中有超过2000种miRNAs,它们总是在不同的组织中以不同的量表达并维持基因的表达[20]。尽管miRNA是内源性调控非编码RNA分子,但已知如果内源性miRNA表达过低,miRNA也可以通过agomiR递送机制外源性递送至靶细胞中以诱导其相应功能[87]。因此,由于具有使ORF 1ab基因沉默的所有必要特征,预测的人miRNA或其agomiR将能够作为针对COVID-19的潜在抗病毒药发挥作用。作为 提到 以上, siRNA 规定 最大互补性M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)10056910图五、SARS-CoV-2潜在靶点-siRNA双链体的二级结构在siRNA引导链和极其特异的靶mRNA之间。转录物与7个核苷酸的种子区域具有互补性,其中siRNA可以下调生长体中的非预期基因。因此,脱靶基因沉默可能经常提供导致误解的不一致结合。因此,siDirect 2.0软件利用有效算法来设计具有最小脱靶效应的功能性siRNA,所述脱靶效应基于被认为是哺乳动物RNAi的价值的机制特征。另一方面,种子依赖性脱靶效应与双链体形成的热动力学稳定性高度相关[57]。种子-靶双链体的Tm与诱导的种子依赖性脱靶效应,这表明21.5μ C的Tm(表4)可以作为区分几乎无脱靶种子序列与脱靶阳性种子序列的基准[54]。尽管如此,使用来自NCBI的BLASTn相似性搜索来验证脱靶,其中所有预测的siRNA都经历BLASTn。在这里,总共131个针对SARS CoV-2的ORF 1ab基因的siRNA分子被用于不同参数的进一步分析,以确定它们的完美性。siRNA双链体的GC含量是可能影响siRNA功能性的关键参数之一,并且观察到siRNA功能性与GC含量之间的最强相关性[88]。对于推定的M. Hasan等人医学信息学解锁24(2021)10056911------≥表4预测的siRNA(引导链和过客链)的Tm值这在这方面是有用的,并且它解释了预测的RNAi与靶位点的强结合[93]。在我们目前的研究中,杂交和RNA寡核苷酸序列21nt指导(5′→3′)21 nt乘客(5′→3′)UCAAUAGUCUGAACAACUGGUCAGUGUUCAGACUAUUGAAGUACCUUUUUUAGCUUCCACGGAAGAAGCUAAAAAGGUAAAUGUUUAGCAAGAUUGUGUCCGGACACAAUCUUGCUAAACACUUUAAAACACCCUCUUGAACAAGUUCAAGAGGGUGUUUUAACUUAGUAGAUACACAAACACCAG种子双链体稳定性(Tm)oC引导乘客11.6℃17.8℃17.3 ℃ 19.1 ℃20.9 ℃ 19.3 ℃7.2° C 20.4° C18.9 ℃ 19.3 ℃使用用于miRNA的RNAhybrid网络服务器和用于siRNA的RNA结构网络服务器的bifold部分预测最小结合自由能。预测的潜在miRNA分子与靶标结合的自由能范围为10 kcal/mol至17.2 kcal/mol(表2),siRNA分子为34.80、33.90、35.00、31.50、34.40、三十六块八,三十八块四,32.70, 33.00, 34.80 kcal/mol(表3)和它们各自的RNA-RNA二级结构如图3所示。 五、在RNAi中,引导RNA将RISC引导到它们的mRNA靶点,从而实现导致基因沉默的切割。向导RNA二级结构形成的程度越小,通过siRNA沉默因为非结构化的引导链可以介导GGUGUUGUGUAUCUACUAGU◦ ◦通过与mRNA结合有效沉默mRNA,而碱基配对UGUUAAGUACCENTUCUACCACGGUAGAUGGGUACUUAACAAUUGUAACUGGACACLUGAGCCCUCAAUGUGUCCAGUUACACAUUGUUGGUAGUUAGAGAACUCUAACUACCAAAGAGAUCUCUAUCAGAUAUGCAAGAAUGUCUGAUAGAGACCAUAGAUGUCAACUCAAAGCCA12.9 C 20.3 C19.0° C 20.5° C20.5 ℃ 18.9 ℃20.2 ℃ 5.6 ℃20.3 ℃ 16.6 ℃引导链的末端使siRNA失活并且最小化。能与互补mRNA结合[94]。在该分析中,该方法该分析的这些预测的siRNA还显示了指导RNA结构中的末端核苷酸的可用性,以及较小程度的干扰。引导RNA的折叠。这些标准确定了所选siRNA引导链对靶mRNA的强烈沉默。现在有充分的证据表明,siRNA由于其最大的序列相似性而比miRNA更好,其对靶点由于GC含量太高,暂时与RISC [89]复合物[21]相关的解旋酶和靶mRNA的抑制性二级结构可能会减慢siRNA双链体解旋。然而,过低的GC含量可能降低靶mRNA识别和杂交的效率。 在我们的研究中,所有选择的siRNA分子的GC含量在33.33%-47.62%之间GC含量计算器,其在支持那些siRNA的可行性的合适范围内[55]。因此,我们预测的siRNA双链体已经通过各种参数证明结构稳定而优化。在热容图中,Cp被绘制为温度的函数,并且当Cp是Tm的函数时,其被指示为TmCp。热容量曲线的局部最大值定义了TmCp。类似地,当将摩尔分数作为温度的函数作图时,它代表浓度图,并且用 Tm表示为 Tm(Conc)。Tm(浓度)是双链分子浓度为其最大值的一半时的点[61]。通过DNAMelt网络服务器估计整个平衡熔融曲线作为温度的函数。此处,TmCp和Tm(Conc)值越高,RNAi分子越好,并且我们预测的miRNA和siRNA显示高解链谱,如表1和3所示。此外,通过siRNAPred分析初步选择的siRNA分子的验证,以了解siRNA在抑制其靶mRNA方面的功效。在这种情况下,预测10种潜在的siRNA分子是潜在的抗病毒候选物,因为它们的有效性得分高(值1)(表3)。为了进一步保证该验证结果,使用了另一种软件i-Score Designer,
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