可用于MADP 1相互作用的SL1和SL2区域内的 SARS-CoV-1的5
′
UTR,
基于选择这些区域内的残基进行对接。在本研究中,由于SARS-CoV-1的
已发表数据,主要关注MADP 1在5
′
UTR内的相互作用,而没有关于
SARS-CoV-1和SARS-CoV-2中hnRNP-1相互作用的实验数据。已知HnRNP
1在TLR-s处结合其他冠状病毒,并且它们在TLR-s处共享相似的序列,
因此假设hnRNP 1也可能在病毒转录方面起重要作用。在两个不同的力
场中进行关于MADP 1的模拟,在Schrodinger 2021.1中释放的OPLS 4和
在Gromacs 18.1中释放的AMBER99SB,以探索突变在亲和力方面的影
响,并且茎环SL 1、SL 2、SL 3的动力学在与宿主因子结合或不结合方
面相同。由于两个原因,模拟重复进行。第一,检查系统稳定性方面模
拟数据的可重复性。第二,了解宿主因子MADP 1从突变体RNA上的解离
是否实际上是一种观察到的现象,或者仅仅是Desmond运行中的人为现
象。在hnRNP1的情况下,仅在薛定谔中进行模拟。
3.1.
SARS-CoV-2
基因
5
′
UTR
区结构差异分析
野 生 型 和 突 变 型 ( C241 T) 病 毒 5
′
UTR序 列 的 核 苷 酸 序 列 取 自
GenBank登录号MN908947.3,并生成二级结构(补充表S1)。使用点
括号格式的X3-DNA-DSSR预测RNA二级结构[36],并在Varna-GUI中可视
化数据,并解释C241 T引起的结构差异。此外,使用RNA composer生成
5
′
UTR的三级结构,以关联通过X3-DSSR获得的结果[37]。由SNP引起的
RNA结构变化的表示在表1中阐明。与突变体相比,野生型RNA的碱基对
数量减少了2个,这反过来也影响了整个5
′
UTR序列中存在的螺旋、凸起
和内环的数量。两种RNA结构的拓扑差异见补充图S2。而RNA茎-环的结
构特征在图1中描述。在突变体RNA中,在SL-4中观察到一个主要变化
(101 G-111 U至101 G-112 U),这进一步导致SL 4的环结构的变化
(图1B)。SL 4的变化也改变RNA的三级结构;进一步诱导SL 1、SL 2和
SL 3的几何结构差异(图1D和E)。两种RNA序列在SL 1、SL 2和TLR序
列内均显示出结构和折叠差异(图1D-3D&1 E-3E)。 野生型RNA结构
共享SL1、SL2和SL3的邻近几何结构,突变型RNA共享相同的远离几何
结构SL1、SL2、SL3和SL4
表1
表格 表 示示出 了在两个RNA序列 中 的 结构 差 异的背景 下X3-DNA-DSSR的输
出
。与突变体相比,野生型RNA序列在碱基对、凸起、内环和基于原子的加帽
功能方面发生了变化上述参数的变化引起SL1、SL2和SL3折 叠 的 变 化 (如图
1B所示)。 ①的人)。
似乎形成了一个用于结合转录因子的空腔。基于输出,使用X3-RNA-
DSSR以点括号形式生成的二级结构与代表茎环和螺旋的相同报告的实验
数据完全匹配[20,22,32]。为了将RNA结构中的这些变化与宿主转录
因子的有利或不利结合相关联,计算蛋白质-RNA对接和所得结合能以鉴
定野生型和突变体(C241 T)RNA序列之间的结合效应。
3.2.
宿主转录因子与
5
′
UTR
变异体的对接
已知MADP 1在Nsp 1蛋白的帮助下结合RNA的SL1和SL2,用于病毒
复制和转录[16]。已知另一种蛋白质hnRNP 1结合在IBV、TGEV和MHV
的TLR-S序列处[3]。MADP 1与SARS-CoV-1的5
′
UTR结合的体外研究是可
用的,但没有hnRNP 1 [16]。SARS-CoV-2的5
′
UTR折叠,使得SL 1、SL
2、SL 3和SL 4共享相邻折叠,这可能增加了这些蛋白的结合表面积。我
们主要关注MADP 1介导的5
′
UTR区域两种变体的SL 1和SL 2区域的结
合,因为在SARS-CoV-2中进行了确证性的体外研究。在大多数
冠状病毒
科病毒中 , 已 知hnRNP 1结合 于5
′
UTR的TLR-S序列[13, 30]。推测
hnRNP 1也可能与SARS-CoV-2的TLR-S结合,促进病毒增殖。在对接研
究后,还观察到宿主因子与两种RNA序列结合的变化。此外,还分析了
宿主因子-RNA复合物的稳定性,以比较两种5
′
UTR变体之间的亲和力。
野生型和突变体RNA与来自HADDOCK的宿主因子蛋白的对接结果描
绘了RNA三级结构中茎环SL 1、SL 2和SL 3折叠的变化,这反过来介导了
所有四种复合物内结合的差异。对于MADP 1,在HADDOCK中,野生型
复合物的8个簇中共有117个结构,代表水精制模型的58.5%,而突变序
列(C241T)的8个簇中产生119个结构,代表水精制模型的59.5%.对于
HNRNP1,HADDOCK将107个结构聚类在13个簇中,这代表了野生型复
合物生成的水精制模型的53.5%,而14个簇中的92个结构,这代表了突
变体复合物生成的水精制模型的46.0%。
基于对接得分,野生型RNA显示出具有更好的
具有高结合常数值(更负)的结合概况,
143.0 ± 3.5,与突变复合物138.4 ± 1.6相比,以及MADP 1的RMSD值为
0.9 ± 0.6,与突变(C241 T)序列为1.1 ± 0.7相比(详见表2MADP 1与
RNA结构的结合位姿如图2所示。如图2E和F所示,与突变的复合物相
比,MADP 1覆盖SL1、SL2和SL3的更高部分用于结合。这些区域内的氢
键形成也显示与图2A和B中所描绘的突变复合物(H-键:14)相比,野
生型复合物(H-键:17)中MADP 1的更好结合。
对于hnRNP1,对接评分和RMSD值未观察到显著变化。然而,与具
有1.5的突变体相比,具有宿主因子的野生型RNA-2.5的簇之间的平均标
准偏差(负Z分数)指示复合物之间更好的对接。(表2)。对接结果清
楚地说明静电能和范德华能有利于蛋白质-RNA复合物的形成,而去溶剂
化能则阻碍了复合物的形成。对接姿态相对于两个主机因素如图所示。
二、
还在NP Dock、H-Dock和PATCH Dock等各种平台中进行对接(补充
表:2)。基于从HADDOCK和其他对接平台获得的对接评分,野生型
RNA与突变体RNA相比显示出更好的结合
为了进一步验证这些发现,研究了WT和MUT蛋白-RNA复合物的分子
动力学,以发现结合能和稳定性。