2020年环境科学与生态技术3 - 厌氧消化微生物组的生态学与过程控制挑战及解决方案

环境科学与生态技术3（2020）100032透视厌氧消化微生物组的下一个前沿：从生态学到过程控制若·德·弗列兹根特大学微生物生态与技术中心（CMET），Coupure Links 653，B-9000，Gent，BelgiumA R T IC L EIN F O文章历史记录：接收日期：2020年3月17日接收日期：2020年2020年5月5日接受保留字：扩增子测序厌氧消化指纹分析产甲烷微生物组A B S T R A C T一个多世纪以来，厌氧消化过程一直是从有机废物流中回收可再生能源的关键过程之一通过新技术的不断发展，厌氧消化微生物组正在从一个黑盒子演变成一个定义明确的财团，但我们还没有达到这个目标。从这个角度来看，我提供了我对厌氧消化微生物组的现状和挑战的看法，以及利用它的机会和解决方案我认为厌氧消化微生物组的识别和指纹识别是监测厌氧消化微生物组的补充工具。然而，数据的可用性、方法固有的偏差和正确的分类鉴定阻碍了厌氧消化微生物组特征化的准确性和可重复性。厌氧消化和其他工程系统中微生物组研究的标准化在未来几十年将是必不可少的，为此我提出了一些有针对性的解决方案。这将使厌氧消化从单一用途的能量回收技术发展成为综合资源回收的多功能过程。我认为，微生物组的开发将是创新的驱动力，它在未来几十年的生物经济中发挥着关键作用。©2020作者（S）。出版社：Elsevier B.V.我代表中国环境科学学会哈 尔 滨 工 业 大 学 、 中 国 环 境 科 学 研 究 院 。 这 是 CCBY 许 可 下 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。1. 介绍可再生能源的恢复和供应可以被认为是我们目前不断变化的世界人口不断增加的关键挑战之一。欧盟委员会最近（2019年底）做出了一项雄心勃勃的承诺，即到2050年实现无温室气体净排放这个所谓的欧洲绿色协议（COM/2019/640 final）显然意味着其他国际合作伙伴也有同样的雄心，以避免为了实现这一宏伟目标，已经提出了多种可再生能源供应系统，包括光伏发电、陆上和海上风能、水电、地热和生物质[2，3]。从生物质中回收可再生能源的关键技术之一是厌氧消化，它可以生产富含能量的沼气。于二零一八年，可再生能源占欧盟最终能源总消耗约18%[4]。沼气约占可再生能源供应的8%（2015年估计），每年仍在增加[5]。这些电子邮件地址：jo. ugent.be。网址：https://www.cmet.ugent.behttps://doi.org/10.1016/j.ese.2020.100032数字表明，厌氧消化不是可再生能源回收的主要解决方案，但在这里，我将强调这项技术的巨大潜力，通过利用厌氧消化微生物组，以及其未来发展的可能性，而不仅仅是能源回收。因此，这一观点的主要目标是为厌氧消化中微生物组工程的现有和新出现的问题提供解决方案，并考虑未来几十年的研究方向。2. 厌氧消化微生物组2.1. 现状和面临的挑战厌氧消化是一个依赖于平衡良好的混合微生物群落的过程，其历史可以追溯到近140年[6]。这些年来，随着新型监测技术和分子/微生物方法的发展，有关关键工艺参数和微生物群落组成、组织和活性的知识有 所 增 加 。 关 键 工 艺 参 数 的 识 别 ， 即 ： 、 总 氨 （ NH+4CH3NH3）、剩余体积（VFA）、pH、salinity，2666-4984/©2020作者。由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院出版。这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表环境科学与生态技术期刊主页：www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.com2J. De Vrieze/环境科学与生态技术3（2020）100032温度和污泥停留时间[7，8]，已经相当简单。最近已经开发了更先进和/或综合的理化监测方法，用于早期预警指示[9，10]和/或基于替代参数或通过新方法[11e13]。微生物群落的监测和/或评价可以在两个层面上考虑，即分类群、基因、转录物、蛋白质和代谢物的鉴定，或通过指纹技术将微生物群落表征为一个连贯的实体，在我看来，每一种方法都有其优点。为了论证的目的，在这里，我将考虑这种方法用于分类群，但这也适用于基因，转录本和代谢物，在我看来，所有这些在未来几十年内将变得越来越突出，用于基于微生物组的过程工程。第一个层次涉及在不同系统发育水平上鉴定分类群，这使得能够鉴定“核心微生物组”[ 14 e17 ]和工艺性能的指示分类群[ 18 e 20 ]。此外，每个单独的厌氧消化都被确认为拥有独特的微生物组[21，22]。虽然分类群的识别能够监测具有早期预警潜力的关键分类群，用于过程故障检测[23]，但它没有考虑冗余的整体概念[24]，这在厌氧消化中可以被认为是至关重要的[25e 27]。 这种与冗余相关的动态监测需要另一种方法，即通过指纹技术提供对微生物群落的总体看法。微生物指纹可以被认为是微生物群落监测的第二级，并不一定意味着需要分类群、基因、转录物、蛋白质或代谢物鉴定。这使得可以使用更传统的方法，如末端限制性长度多态性（T-RFLP）[28，29]或变性梯度凝胶电泳[30，31]。 尽管这些“老派”技术有其优点，但高通量扩增测序和“组学“应该是首选方法，因为它们允许鉴定和整体微生物群落指纹。在未来的几十年里，指纹识别方法将超过基于DNA的扩增子测序水平，超过基于RNA的方法，无论是在16S水平[32]还是整个转录组，以及通过流式细胞术进行表型指纹识别[33，34]。 这样的指纹捕捉到了多样性，例如，、丰富度、均匀度和总体多样性[35]，以及b-多样性参数，以表征厌氧消化器中和厌氧消化器之间的（不）相似性和动态[18]。 即使这些指纹技术估计微生物群落组织（a-多样性）和微生物群落的关键应激反应机制，即，、抗性、恢复力或冗余性[24，36]，但它们不能鉴定关键的分类群、基因、转录物、蛋白质和代谢物，并且通常不能提供关于微生物群落性能的直接答案[37]。因此，在我看来，关键分类群、基因、转录物或代谢物鉴定和不同水平的整体微生物群落指纹的组合互补方法对于厌氧消化中向新水平的“微生物群落监测“过渡至关重要。厌氧消化中的微生物群落监测，以及其他微生物生态系统，是以方法固有的偏见和缺乏，甚至是研究领域特定的标准化为代价的[38]。样品储存、DNA提取方法、引物选择、16S rRNA基因选择中的可变区、扩增子测序平台和数据处理管道的连续性需要一系列选择，这些选择可能会强烈影响最终微生物群落特征（图1）。如果使用相同的方法，可以获得可靠和稳健的结果，但这会使使用不同方法的研究之间的数据比较复杂化。如粪便样本所示，在样本储存时，微生物群落组成和指纹已经被破坏[39]。 随后的DNA提取样品厌氧Fig. 1. 从厌氧消化器获得微生物群落特征（操作分类单位（OTU）表）过程中潜在方法固有偏倚的示意图概述。对于该过程中的每个步骤，列出了三个潜在的选项（即使有更多的可能性），总共有36种可能性和潜在的不同微生物群落特征。不同颜色的箭头（蓝色、绿色和红色）表示不同的方法选择顺序，从而导致可能不同的微生物群落特征。(For有关本图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版。）消化器似乎对微生物群落特征具有与方案相关的影响[ 40 ]，甚至可以通过方案中的微小修改来影响[ 41]。引物的选择，无论是否与16SrRNA基因中可变区或V区的差异有关，也会强烈影响微生物群落特征[41e43]。 尽管Illumina已经成为扩增子测序的标准，其中包括2013 年 停 止 的 454 焦 磷 酸 测 序 ， 但 Ion Torrent ， Paci ficBiosciences，特别是Nanopore MinION技术[44]正变得越来越受欢迎。然而，即使对于模拟微生物群落[43]和基因组分析[45]也观察到它们不同的微生物群落特征结果，这也将对厌氧消化微生物群落特征产生影响。最后，数据处理管道（例如，，Mother，QIIME 1 2）及其（固有）设置已在模拟群落特征中显示[46]，这无疑也反映了厌氧消化中复杂微生物群落的特征这些固有的方法相关的偏见构成了一个巨大的J. De Vrieze/环境科学与生态技术3（2020）1000323和扩大的挑战，厌氧消化，而且其他（工程）微生物生态系统。一个关键的问题仍然是人们是否在寻找实际的微生物群落或更确切地说，在方法相关的人工制品，这反过来又使一个问题的整个概念的微生物群落扩增子测序厌氧消化（和超越）。与分类单元鉴定相比，指纹图谱的方法依赖性更小，正如在比较T-RFLP与Illumina扩增子特征时所观察到的那样[47，48]，但是，如前所述，应该与分类单元鉴定相结合。因此，在我看来，这构成了未来研究和方法标准化的关键挑战，以实现厌氧消化中准确和可靠的微生物群落监测。2.2.机会和解决办法十五年的高通量扩增子测序[49]已经导致了大量关于厌氧消化微生物组的研究，无论是在实验室规模的实验还是全规模的消化器中。几位研究人员进行了Meta数据研究[50，51]，每一项研究都扩展了我们对厌氧消化微生物组的整体知识，但也偶然发现了几个问题/操作。 第一个问题涉 及原始（ fastq ）和 处理后（ 操作分类单 位（OTU）表）数据文件的可用性。一般而言，这些资料档案应可透过网上存放处查阅，例如：、国家生物技术信息中心（NCBI）或欧洲核苷酸档案馆（ENA）。然而，特别是在高通量测序的早期，由于各种通常有效的原因，作者经常放弃这种责任。这使得其他研究人员无法访问这些有价值的数据。我认为，原始数据（在线存储库）和处理后的数据（补充信息或在线存储库）都应该直接提供给读者，以便他们（1）直接使用原始文件，（2）将数据处理后的结果与作者的处理数据进行比较。第二个问题来自第一个问题，即。引物组、V区和测序平台的多样性为了解决这个问题，需要采取三项基本行动。首先，一项全面的研究将是至关重要的，该研究记录了DNA提取方法、引物选择、16S rRNA基因选择中的可变区、扩增子测序平台和数据处理管线对厌氧消化微生物组（分类群识别和指纹）的影响这应该通过合并现有的实验室和全尺寸研究来完成第二，该信息应当使得能够选择（一组）合适的技术，其充当标准以避免或至少限制扩增子测序技术中的未来基于方法的偏差。类似的方法标准化方法应用于地球微生物组项目[52]和人类微生物组项目[53]，这也应该找到进入厌氧消化和其他工程微生物生态系统的方法。第三，在选择标准化方法后，应选择与厌氧消化微生物组数据相关的关键参数，特别是在全规模下，因为目前，研究之间的操作数据纳入差异很大。第三个问题涉及关键分类群的识别，即使当消除方法相关的偏倚时，对不断发展但仍不完整的大量微生物数据库提出了重要挑战[54]。生态系统特定的数据库，例如活性污泥[55]和厌氧消化[56]的MiDAS数据库，可以通过更有针对性的微生物分类群识别方法来解决这个问题。尽管如此，对MiDAS数据库[57]进行的持续更新对于保持生态系统特定数据库与全球数据库保持一致全长16S rRNA基因测序甚至可以建立一个更完整的生态系统靶向数据库，在MiDAS的情况下，用于活性污泥和厌氧消化，超过了大规模通用数据库的限制[57]。应用扩增子序列变体（ASV）而不是OTU，可以独立于参考数据库更精确地分辨单核苷酸差异[58]，这是一种可以更准确地识别分类群的要纳入微生物数据库的新分类群的鉴定和表征仍然是厌氧消化的关键问题，因为（1）厌氧条件和（2）复杂的相互作用，这使得关键分类群的纯培养物生长具有挑战性。尽管我们正处于（部分）取代经典微生物学方法的高通量方法时代，例如饮用水[59]，但（基础）微生物学在未来几十年内仍将非常重要，以巩固和扩展有关厌氧消化微生物组的知识。我在扩增子测序水平上说明了这些挑战，因为这些挑战在过去十年中已经迫在眉睫，然而，这些挑战同样适用于关键的挑战是克服这些问题，我更愿意将其视为未来几十年的挑战/机遇，我们拥有这样做的技术/知识。这将使我们能够扩展我们对厌氧消化微生物组的知识，并有可能从单纯的事后描述转变为综合和主动的过程指导和工程。3. 厌氧消化微生物组正如伏尔泰在18世纪雄辩地说的那样：“爱是幸福的（更好是好的敌人。使用基于微生物组的参数来监测和引导厌氧消化过程的愿景应该超越现有知识的边界，并应该带来新的机会，而不是改写或确认当前的过程引导方法。 厌氧消化作为一种工艺已经经历了一个多世纪的发展和优化[6]，但目前达到了极限，这与沼气固有的低经济价值有关。在欧洲绿色协议中，气候变化的紧迫问题将要求厌氧消化迈向一个新的水平，以跟上其他可再生能源提供技术，如光能和风能。因此，厌氧消化需要发展成为一个超越单纯的能源回收到综合资源回收的过程，否则将与无法满足当今可持续性要求的其他技术一起消亡。厌氧消化微生物组可以在这一转变中发挥关键作用，如果我们成功地完成上述机会。厌氧消化微生物组知识可以为我们提供关键/指标/标记（无论您喜欢如何命名）分类群，以便我们开发合适的方法。它将使我们能够通过指纹识别来跟踪微生物组的稳定性，为此我们应该开发合适的基准，无论是针对具体情况还是一般情况。它将使我们能够超越类群的关键/指标/标记基因（及其转录本）和途径（通过应用这种具有高潜力的方法的一个关键例子在于通过流式细胞术[34]监测F420辅因子或通过液相色谱法[60]监测F430辅因子，这两种方法都可以提供对产甲烷活性的准确和直接的看法。它将使我们不仅能够监测分类群，而且还可以应用策略来选择性地丰富分类群（甚至基因和4J. De Vrieze/环境科学与生态技术3（2020）100032生物强化的潜力有限[61]。这些机会与最初引用的伏尔泰，作为厌氧消化过程的进一步发展是必不可少的，以应对今天的（新兴的）挑战。厌氧消化有潜力扩大其在生物基循环经济中的核心作用，不仅是可再生能源回收的灯塔，也是新的/具有挑战性的废物流的价值，例如。在生物矿内，综合资源回收（氮、磷、钾及其他）及目标产品产出（除沼气外）为商品化学品，例如：通过超干重整[62]，聚羟基链烷酸酯，中链和长链脂肪酸[63]，以及用于食品/饲料应用的微生物蛋白[64]。这将使厌氧消化重新成为生物循环经济中的一个关键过程，其中微生物生态学将发挥关键作用。因此，我的愿景是，厌氧消化微生物组将成为厌氧消化过程和混合培养发酵过程创新的驱动力，以应对未来几十年我们当今社会的主要挑战竞争利益作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作致谢Jo De Vrieze是佛兰德斯研究基金会（FWO-Vlaanderen）的博士后 研 究 员 。 作 者 要 感 谢 Kankana Kundu 、 Ruben Props 和 JanaWijnsouw的投入和仔细阅读手稿。引用[1] G. Liobikiene_，M. Butkus，经济增长，外国直接投资，城市化和贸易影响温室气体排放的 规 模 ， 组 成 和 技 术 效 应 。 能源132（2019）1310E 1322。[2] D. Gielen，F. Boshell，D. Saygin，医学博士Bazilian，N.瓦格纳河可再生能源在全球能源转型中的作用，能源战略。Rev. 24（2019）38e 50.[3] M. Simionescu，Y. Bilan，E. Krajnakova，D. Streimikiene，S. Gedek，电力部门的可再生能源和欧盟人均GDP，能源12（13）（2019）15。[4] 欧盟统计局，可再生能源统计，欧盟委员会，2018年。[5] N. Scarlat，J.- F. Dallemand，F. Fahl，沼气：欧洲的发展和前景，更新。能源129（2018）457e 472.[6] P.L. McCarty，厌氧处理的百年历史，厌氧消化。（1981）第3集第22集。[7] L. Appels，J. Baeyens，J. 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Seger，A.塞甘-奥兰多湖塞尔丁，L.M. 塞勒湾Shakhsheer，G.M.床单，C.C.沈，Y.Shi，H.D.阿信B.D. Shogan，D.Shutler，J.Siegel，S.Simmons，S.Sjoling，D.P.史密斯，J.J.索勒，M. Sperling，P.D.斯坦伯格湾Stephens，M.A.Stevens，S.塔加维河谷Tai，K.泰特，C.L. Tan，N.塔斯Taylor，T.托马斯岛Timling，B.L.Turner，T.尤里克，L.K. Ursell，D. van der Lelie，W.范特鲁伦湖 vanZwieten，D.瓦加斯-罗伯斯6J. De Vrieze/环境科学与生态技术3（2020）100032R.V. Thurber，P.Vitaglione，D.A.华盛顿州沃克沃尔特斯，S。Wang，T.小 王，T. 北