UASB颗粒污泥中苯酚降解菌的生态位分化

工程9（2022）61研究先进水科学与技术荧光原位杂交技术研究UASB颗粒污泥中苯酚降解菌的生态位分化Kengo Kubotaa，Kai，Kei Igarashia，Masayoshi Yamadab，Yasuyuki Takemuraa，Yu-You Lia，HidekiHaradaa，ca东北大学土木与环境工程系，日本仙台980-8579b日本雾岛899-5193国立技术大学鹿儿岛学院城市环境设计与工程系c日本仙台东北大学新产业创造孵化中心980-8579阿提奇莱因福奥文章历史记录：2020年12月7日收到2021年3月22日修订2021年5月24日接受2021年7月13日在线提供关键词：隐孢子虫荧光原位杂交厌氧苯酚降解合养属UASB颗粒污泥A B S T R A C T采用荧光原位杂交（FISH）技术和克隆文库构建技术，对厌氧污泥床反应器处理含酚废水的颗粒污泥微生物群落结构观察到合养杆菌科和隐杆藻的克隆负责苯酚降解。为了准确的分类分配的隐孢子虫克隆，系统发育分析，使用近全长16S核糖体RNA（rRNA）基因序列是必要的。设计了三种寡核苷酸探针来检测以下三个分类组：合养杆菌科、隐杆藻和合养属。厌氧颗粒的薄切片的FISH分析显示细菌和古菌的随机分布。然而，观察到了一个明确的分布，Syntrophorhabdaceae，Cryptanaerodium，和Syntrophus。隐杆藻属和合养藻属分布于颗粒的外层，它们之间的亲缘关系较近，而合养杆菌科则分布于颗粒的深层。细菌的这种特定分布观察到颗粒污泥中的苯酚降解以如下方式进行。首先，隐藻将苯酚转化为苯甲酸盐，然后被Syntrophus降解为乙酸盐。苯酚的这种互养降解发生在颗粒表面附近，此处苯酚浓度高。在颗粒的较深部分，苯酚浓度较低，合养杆菌科降解苯酚为乙酸。我们观察到互养杆菌科不太可能产生苯甲酸盐作为中间体来喂养邻近的生物，这与以前的研究提出的理论相矛盾。©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍苯酚是一种用途广泛且在工业上重要的化合物。因此，苯酚也是树脂成型、煤气化、炼油、采矿等行业产生的废水中的常见污染物[1]。苯酚在水中的高溶解度增加了其流动性，并导致环境的广泛污染。已经开发、测试并实施了几种技术，用于从各种类型的废水中降解和去除苯酚[1厌氧生物降解苯酚因其具有完全降解*通讯作者。电子邮件地址：tohoku.ac.jp（K. Kubota）。苯酚、其低能耗和其以甲烷气体形式产生生物能的潜力已经广泛研究和调查了厌氧微生物聚生体降解苯酚[2，4然而，目前对参与苯酚降解的微生物及其作用的研究还很缺乏.据 报 道 ， 参 与 苯 酚 降 解 的 主 要 微 生 物 类 群 为 互 养 杆 菌 科 、Pelotomaculum、脱硫肠状菌、互养菌和梭菌[2，7，9，10]。关于各种其他微生物在苯酚生物降解中的作用也有不同的说法。嗜香合养杆菌（ Syntrophorhabdus aromaticivorans ， S. aromaticivorans ） [11] 和Cryptanaerophenolicus（C. phenolicus）[12]是两种已知的可以利用苯酚在产甲烷环境中生长的物种。许多研究将苯酚降解途径描述为苯酚https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.05.0122095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engK. 久保田角Igarashi，M.Yamada等工程9（2022）6162·········在与氢营养产甲烷菌的互养联合中被互养杆菌降解为乙酸盐这些研究还表明，苯酚首先通过合养杆菌属或Pelotomaculum转化为苯甲酸盐，然后通过Pelotomaculum、脱硫肠状菌属或合养杆菌属转化为乙酸盐[4，5，8，13然而，在任何已发表的报告中，都没有明确的证据表明任何纯培养的Pelotomaculum因此，Pelotomaculum不太可能将苯酚转化为苯甲酸酯。此外，它是不太可能的Syntrophorhabdus可能是一个苯甲酸盐生产商为其他苯甲酸盐清除剂，因为苯酚转化为苯甲酰辅酶A（CoA）的S。食aromaticivorans是一种消耗三磷酸腺苷（ATP）的过程。S.食芳香剂需要进一步降解苯甲酰辅酶A以获得能量[16]。这一推理引出了两个关键问题：①如果共养杆菌产生苯甲酸作为中间产物，然后被其他微生物消耗，那么共养杆菌是如何从这个过程中获益的？②如果互养微生物，如互养菌和Pelotomaculum，不以互养杆菌产生的中间产物为食，那么使它们在苯酚降解菌群中保持丰度的主要底物是什么？为了回答这些问题，我们研究了从处理苯酚的升流式厌氧污泥床（UASB）反应器中通过构建16SrRNA基因克隆文库，分析了苯酚降解菌的群落结构，并利用荧光原位杂交技术（FISH）研究了苯酚降解菌的空间分布。颗粒污泥的一个优点是，在颗粒的深度上有明显的苯酚浓度梯度[17]。因此，存在于颗粒的不同深度处的换句话说，微生物在颗粒中的分布和生长此外，通过对特定微生物组的原位染色，可以观察到交叉喂养关系。在这项研究中，第一次，我们解释的作用和相互作用的微生物中发现的苯酚降解厌氧颗粒财团。2. 材料和方法2.1. 反应器运行和颗粒污泥取样实验室规模的UASB反应器（体积为11 L）在中温条件（35 °C）下运行超过1000 d，以苯酚作为唯一碳源，并补充营养物质（附录A表S1）。UASB反应器的水力停留时间（HRT）设定为9.2h。UASB反应器启动时，投加630 mg L-1苯酚，相当于1500 mg以重铬酸钾为氧化剂测定的化学需氧量（CODCr L-1）。苯酚浓度逐渐增加到1260 mg L-1（3000 mgCODCr L-1），相当于7.8 kg CODCr（m3d）-1的COD负荷。反应器对COD的去除率在60%在这项研究中，颗粒污泥从底部的UASB反应器进行了采样。将样品用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次后用于DNA提取。将用于FISH分析的样品用PBS洗涤两次，在4 °C下在3%多聚甲醛溶液中固定15小时，再次用PBS洗涤两次，然后在室温下储存在乙醇/PBS溶液中。-20°C。2.2. DNA提取、克隆、系统发育分析、探针设计和验证使用ISOIL for Beads Beating试剂盒（NIPPON GENE，Japan）进行DNA提取分别使用引物对Eub 8 F-Univ 1500 R [18]和Arc 109 F-Univ 1500 R [19] 对 细 菌 和 古 细 菌 的 16 S rRNA 基 因 进 行 扩 增 用MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen，Germany）处理后，按照制造商的说明书，随机挑取117个细菌克隆和38个古细菌克隆。对包括16 SrRNA基因的V3-V4区在内的约600个碱基进行测序。使用mothur算法将获得的序列聚类成操作分类单位（OTU），阈值为97%序列同一性[20]。对于选择的重要OTU，对基因的全长进行测序。将序列保存在日本DNA数据库（DDBJ;编号见附录A表S2）中。使用ARB软件和SILVA Release 138数据库进行系统发育分析和探针设计[21]。使用mathFISH评价设计的探针[22]。在预期亲和力较低的情况下，引入锁核酸（LNA）[23]。如别处所述，使用克隆-FISH进行探针验证[24]。2.3. 原位杂交和共聚焦激光扫描显微镜本研究中使用的寡核苷酸探针见表1[25使用等量的Eub338 I IV和Eub338 II III探针的混合物来检测细菌。在46℃下，在含有0.5 lmol L-1每种探针的杂交缓冲液（0.9 mol L-1 NaCl，20 mmol L-1Tris-HCl（pH 7.5），0.01%十二烷基硫酸钠）中进行杂交3-通过向杂交缓冲液中加入甲酰胺来调节杂交严格性（表1）。通过在48 °C下将载玻片浸入具有甲酰胺的杂交缓冲液中15分钟来去除过量的探针。为了增强一些探针的信号强度，在30和50末端标记荧光染料[28]。干燥后，用ProLongGold（Invitrogen）覆盖样品，并用落射荧光显微 镜 （ BX 50 ， Olympus ， Japan ） 或 共 聚焦 激 光 扫 描显 微 镜（LSM 710 ， CarlZeissMicroscopy ， Japan ）进行评价 .通过将FISH阳性细胞的数目除以40，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的细胞的数目来计算细胞丰度（以百分比表示）3. 结果和讨论3.1. 微生物群落组成通过对117个和38个克隆进行测序，分别构建了细菌和古细菌文库在所有的克隆中，获得了30个细菌OTU和5个古细菌OTU细菌群落组成见表S2。三个OTU与已知的苯酚降解菌S.食芳香菌（OTU B1和B15）和C. phenolicus（OTU B4）。S.在厌氧环境中与产甲烷菌互养 结 合 时 ， 食 芳 香 菌 能 够 将 苯 酚 降 解 为 乙 酸 盐 [11] 。 C. 已 知Phenolicus将苯酚转化为苯甲酸酯[12]。将OTU B4指定为C. 苯酚并不是直来直去的。虽然使用美国国家生物技术信息中心（NCBI ）数据库的基本局部比对搜索工具（ BLAST ） 搜 索 显 示 OTU B4 与 Pelotomaculum apricicum（ P.apricicum ， 96% ） 的 序 列 同 一 性 高 于 与 C. 酚 类 芽 孢 杆 菌（95%），直接序列匹配显示，K. 久保田角Igarashi，M.Yamada等工程9（2022）6163表1研究中使用的探头列表名称顺序（50目标甲酰胺（%）引用Eub338 I IVGCW GCC TCC CGT AGG AGT细菌20[25，26]Eub338 II IIIGCW GCC ACC CGT AGG TGT细菌20[26日]Arc915GTG CTC CCC CGC CAA TTC古细菌20[27日]Syha828ATT ACA CCT CCC ACA CC合养杆菌科10本研究Syphu459L一般临时助理人员合养属10本研究Cph 1269CCG GCT TTT WTC GGA TTT GCT CCA隐甲藻10本研究cCph 1269CCG GCT TTT WTC GGA TTT GCT CCG CCCph 1269的竞争探针10本研究a具有LNA的La：腺嘌呤碱基。OTU B4更接近C.与P. phonolicus（1499个碱基中的1431个碱基匹配）相比，P. phonolicus与P. phonolicum（1488个碱基中的1422个碱基匹配;表S2）的差异更大。为了进一步明确OTU B4的系统发育位置，构建了系统发育树，结果表明OTU B4与隐藻属成员的亲缘关系比与Pelotomaculum的亲缘关系更近。分类学分配的数据分析方法中的这种异常可以解释为什么许多研究提到在苯酚降解聚生体中存在Pelotomaculum而不是Cryptanaerodium[2，15]。下一代测序提供了更高数量的序列读段，尽管长度较短，可能不足以区分隐气菌和Pelotomaculum。即使获得了几乎全长的16S rRNA基因序列，结果仍然可能偏向于Pelotomaculum，特别是如果不进行系统发育分析。Ju等人[5]报告了在使用全长或接近全长16S rRNA基因序列进行系统发育分析后，在环境、嗜中温和嗜热厌氧苯酚降解聚生体中隐藻属的相对丰度较高，而Pelotomaculum属的亲属不存在这些结果表明，利用16SrRNA基因的近全长序列进行系统发育分析，对于更准确地确定隐囊藻的分类地位是必要的。第二丰富的OTU（OTU B2，17%相对丰度，舞蹈在图书馆）密切相关的Syntrophus buswellii，这是已知的苯甲酸盐转化为乙酸盐[29]。第三丰富的OTU（OTU B3，10%相对丰度）属于FCPU426门。该门中的宏基因组组装基因组是使用从融化的永久冻土中获得的样品构建的[30]，但尚未获得关于其代谢功能的任何详细报告。还获得了高丰度的属于脱硫弧菌属的OTU：B6（四个克隆）、B9（三个克隆）和B13（两个克隆）。其他几项研究也提到了脱硫弧菌在苯酚降解聚生体中的存在Chen等人[9]观察到脱硫弧菌存在于嗜温苯酚降解富集培养物中，但没有讨论其作用。脱硫弧菌可能参与使用硫酸盐的氢消耗（表S1）。其对氢消耗的贡献可能导致与氢营养产甲烷菌相关的古细菌克隆的回收率较低（表S2）。关于古细菌文库（表S2），属于甲烷菌属是一种乙酸分解型产甲烷菌，占优势，因为乙酸是厌氧苯酚降解过程中的主要子产物。低相对丰度的OTU，这是有关的氢营养型产甲烷菌，即甲烷菌和甲烷杆菌。3.2. 穿刺针设计和确认图11给出了为与合养杆菌属、隐管线虫属和合养属接近的OTU构建的系统发育树。1.一、设计了三种寡核苷酸探针，即Cph1269、Syha828和Syphu459L，合养杆菌科（Syntrophorhabdaceae）和合养杆菌属（Syntrophus）分别为（表1）。设计的探针的Phylogenetic覆盖率如图1所示。使用克隆-FISH方法进一步验证和优化设计的探针（附录A图S1）。在这三种探针中，靶向Syntrophus的Syphu 459显示出DNA探针的低信号强度，即使在5- 0和3- 0端上用荧光团标记后也是如此[28]。因此，引入LNA以提高杂交效率[23]。在取代两个腺嘌呤碱基（Syphu459L）后，获得更亮的信号。为了检测隐球菌，最初设计了探针Cph 1271（图S1）。该探针仅在30 bp处有一个碱基错配， 端丙酸粪肠菌（P.propionicum）。因此，还设计并应用了竞争探针cCph 1271（图S1）与Cph1271结合。即使使用cCPh 1271，也不能消除与丙酸杆菌的非特异性杂交。 然后通过在30末端添加两个胞嘧啶碱基（命名为Cph 1269）来延长探针，并与竞争探针cCph 1269一起应用。这种组合导致隐藻和P之间的明显区别。 丙酸。3.3. 苯酚降解菌在UASB颗粒污泥原位定位将所设计的探针应用于超声均质后的颗粒样品。所有三种微生物类群--即合养杆菌科、隐杆藻和合养菌--都被成功检测到（图2）。每种探针检测到的细胞百分比为：互养小杆科22% ± 0.6%，隐杆藻3.5% ±1.5%，互养属14.4% ± 0.6%。这一结果与克隆文库中发现的它们的相对群体非常一致。接下来，制备颗粒样品的薄片以揭示苯酚降解聚生体沿颗粒深度的分布。最初，应用了针对细菌和古细菌的探针。结果表明，细菌和古菌分布在整个颗粒。在颗粒的中心，有一个非活性区或矿物质样物质发射自发荧光（图3）。接下来，应用三种设计的探针，同时靶向合养杆菌科、隐杆藻和合养属。发现隐杆藻和Syntrophus在空间上密切相关，并且位于颗粒的外部，而Syntrophorhabdaceae存在于颗粒的较深部分（即，隐藻层和Syntrophus层与中心非活动区之间;图。 3）。3.4. 厌氧苯酚降解菌群的生态学研究在本研究中，我们成功地展示了现场分布的苯酚降解微生物的颗粒污泥用于处理含酚废水。苯酚降解颗粒和生物膜K. 久保田角Igarashi，M.Yamada等工程9（2022）6164Fig. 1. OTU的系统发育位置与（a）隐杆藻和（b）合养杆菌属和合养属相关。获得的克隆数显示在括号中。设计的探针的覆盖范围以颜色显示：Cph 1269为蓝色，Syha 828为粉红色，Syphu 459 L为绿色使用ARB程序中实现的邻接方法构建基于16S rRNA基因的树比例尺指示每个序列位置的核苷酸变化的数目以前曾报道过[7，9，10，14]，我们的结果与这些观察结果一致。有趣的是，在这项研究中，FISH分析显示，不同的细菌物种在颗粒污泥中的分布有明显的区别。颗粒中的特定微生物分布可能是由于诸如苯酚降解性、代谢关联、对苯酚毒性的抗性以及隐杆藻和合养杆菌科的生长速率 的 差 异 等 因 素 。 隐 杆 藻 可 能 有 一 个 更 快 的 增 长 速 度 比Syntrophorhabdaceae，这有助于前者获得一个生态位上的外部部分的颗粒竞争的Syntrophorhabdaceae的苯酚利用。根据信息，隐藻产生的苯甲酸盐可以被合养杆菌和合养杆菌从克隆文库中获得（表S2）。FISH结果表明，高丰度的合养空间接近隐杆藻，表明合养胜过合养杆菌科苯甲酸盐的利用。之前已经报道了在苯甲酸盐利用方面，合养菌属优于合养杆菌科[9];在同一项工作中，当底物从苯酚转换为苯甲酸盐时，观察到从合养杆菌科到合养菌属的种群转移。这些观察结果表明，苯酚降解发生在隐气杆菌和Syntrophus的外部部分的颗粒之间的互养协会。虽然合养杆菌科的成员具有较慢的生长速率，但与隐杆藻相比，它们可能对苯酚具有更高的亲和力，并且已经在微生物中找到了它们的生态位。K. 久保田角Igarashi，M.Yamada等工程9（2022）6165··图 二 . 用 （ a ） Syha 828 探 针 （ Syntrophorhabdaceae ） 、 （ b ） Cph 1269 探 针（Cryptanaerodae）和（c）Syphu459L探针（Syntrophus）原位杂交后处理苯酚的颗粒污泥样品的显微照片。每个双图描绘了DAPI（左）和探针染色（右）。该条代表10升米。更深的部分的颗粒。本研究中的反应器进料有高浓度的苯酚（1260mg L-1），但由于微生物苯酚降解，可能会沿颗粒深度形成陡峭的苯酚浓度梯度[17]。因此，颗粒较深部分的苯酚浓度可能显著较低，这可能有助于存活，生长，和流行的Syntrophorhabdaceae更深的颗粒内。Chen等人[14]报道了在全规模厌氧流化床反应器中，当进料低浓度的苯酚（2530 mg L-1）。此外，发现在低浓度苯酚的富集培养物中，共养杆菌科是优势微生物[31]，但当苯酚浓度高时，发现Pelotomaculum和Syntrophus是优势微生物[2，7，10]。虽然没有研究集中在这些微生物对苯酚的亲和力，但本研究中颗粒中的微生物分布和可能的苯酚浓度梯度表明，与隐杆藻相比，合养小杆藻对苯酚的亲和力可能更高。生态位的分化也表明了厌氧微生物在苯酚降解中的不同作用。一些研究报告称，合养杆菌属可能是将苯酚降解为苯甲酸盐的关键微生物，之后苯甲酸盐降解由合养杆菌属和Pelotomaculum进行[4，14]。然而，共养杆菌不太可能总是产生苯甲酸盐作为中间体来喂养其他微生物，因为共养杆菌这样做几乎没有好处[16]。FISH结果表明，在颗粒的较深处，合养杆菌科是单独存在的，而不是与合养杆菌属一起存在。这一发现表明，在颗粒中，互养杆菌科与互养属没有交叉取食关系。另一方面，有报告称，在处理低浓度苯酚的生物膜表面附近存在互养杆菌科和互养菌属的随机分布[14]，这表明微生物相互作用与我们的发现不同。微生物间的相互作用可能受到几种不同环境因素的影响，如苯酚浓度、有机负荷和生物膜厚度。在这项研究中，我们证明了系统发育的重要性用几乎全长的16S rRNA基因序列进行分析，以正确鉴定隐藻，从而将其与Pelotomaculum区分开。以前的一些研究可能将隐气杆菌误认为苯酚降解菌群中的Pelotomaculum本研究确定了负责苯酚降解的微生物，并提出了它们在厌氧颗粒生物膜环境中的作用图三.苯酚处理颗粒切片的原位杂交。将切片同时与（a）用于细菌的Eub338混合物（红色）和用于古细菌的Arc915（蓝色）杂交，或（b）与靶向隐球菌的Cph 1269探针（绿色）、靶向Syntrophu的Syphu459L探针（红色）和靶向Syntrophorhabdaceae的Syha 828探针（蓝色）杂交。显示了与三种探针（Cph 1269、Syphu 459 L和Syha 828）同时杂交的横截面的（c）外部和（d）较深部分的更高放大倍数视图。柱代表（a，b）200l m和（c，d）20l m。K. 久保田角Igarashi，M.Yamada等工程9（2022）6166我是说。最后，这项研究能够回答两个关键问题：①互养小杆菌科通过降解苯酚为乙酸盐获得能量，而不向邻近的微生物提供苯甲酸盐;②互养小杆菌属从隐杆藻中获得苯甲酸盐作为主要底物。致谢感谢Höganäs Environment Solutions，LLC（USA）的MadanTandukar博士阅读本文。本研究得到了日本科学振兴会的科学研究补助金（B）（JP18H01564）的支持。遵守道德操守准则Kengo Kubota、Kei Igarashi、Masayoshi Yamada、YasuyukiTakemura、Yu-You Li和Hideki Harada声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.05.012上找到。引用[1] 放大图片作者：J. 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