基于统计学习的QSAR、虚拟筛选和分子动力学的组合发现新的TLR7激动剂

医学信息学解锁27（2021）100787通过基于统计学习的QSAR、虚拟筛选和分子动力学的组合发现新的TLR7激动剂Ardavan Abiria，*，Masoud Rezaeib，**，Mohammad Hossein Zeighamia，Younes Vaezpour c，Leili Dehghana，Maedeh KhorramGhahfarokhi da药物化学系，药剂学院，克尔曼医科大学，克尔曼，伊朗b伊朗克尔曼，克尔曼医科大学医学院c伊朗克尔曼，克尔曼医科大学学生研究委员会d伊朗克尔曼，克尔曼医科大学药剂和药物科学系A R T I C L EI N FO保留字：TLR7抗病毒统计学习药物设计QSAR分子动力学A B S T R A C T由于COVID-19危机，在过去两年中，对新的抗病毒药物的研究激增。Toll样受体7（TLR7）是先天免疫中最重要的TLR蛋白之一，负责广泛的抗病毒应答和免疫系统控制。TLR7激动剂作为疫苗佐剂和免疫应答调节剂，不仅是我们当代病毒大流行病的首选药物，而且也是其他疾病的首选药物。TLR7的激动剂已被用作疫苗佐剂和抗病毒剂。 在这项研究 中，我们将基 于统计学习的QSAR模型与分 子对接和分子动 力学模拟相结 合，通过DrugBank数据库的药物再利用来提取新的抗病毒药物。首先，我们手动策划了一个由TLR7激动剂组成的数据集。提取了这些化合物的分子描述符，并进行了特征工程，将特征数量限制为45个。我们采用了统计启发的偏最小二乘法（SIMPLS）的修改，建立我们的QSAR模型。在下一阶段，DrugBank数据库使用分子对接进行结构上的虚拟筛选，并鉴定TLR鸟苷结合位点的顶级化合物。通过基于配体的QSAR方法再次筛选分子对接的结果，以消除通过先前训练的模型不显示强EC50值的化合物。然后，我们将最终结果进行分子动力学模拟，并将我们的化合物与咪喹莫特（FDA批准的TLR7激动剂）和化合物1（体外对TLR7最具活性的化合物，EC50= 0.2 nM）进行比较。我们的研究结果显然表明，头孢菌素和核苷酸类似物（特别是无环核苷酸类似物，如阿德福韦和西多福韦）是计算有效的TLR7激动剂。最后，我们回顾了一些关于头孢菌素的出版物，就像拼图一样，完成了我们的结论。1. 介绍TLR7作为Toll样受体（TLR）家族的一员，位于在内体区室中。TLR7主要在类浆细胞树突细胞和B细胞中表达，但在非免疫细胞如肝细胞、上皮细胞和角质形成细胞中可观察到其低水平表达。树突状细胞中TLR 7的刺激导致这些细胞产生各种白细胞介素，如IL-12和I型干扰素（IFN）。IL-12增强T淋巴细胞和自然杀伤细胞的细胞毒活性[1]。TLR7受体能够识别病毒单链病毒RNA（ssRNA）以及合成三环类药物属于咪唑并喹啉系列，使用两个不同的口袋[2]。TLR激活中触发的途径由髓样分化初级应答基因88（MyD 88）或含TIR结构域的衔接子诱导干扰素-β（TRIF）介导。TLR 7通过MyD 88的激活携带其信号，并且其激活被证实参与许多细胞因子如IL-29的产生（涉及针对病原体的免疫应答），2-抗肿瘤蛋白如金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP 1）和磷脂酰肌醇3，4的上调，5-三磷酸3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶（PTEN），以及3-* 通讯作者。** 通讯作者。电子邮件地址：ard. ymail.com（A. Abiri），masoudrezaei082@gmail.com（M. Rezaei）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100787接收日期：2021年8月30日;接收日期：2021年10月16日;接受日期：2021年11月11日2021年11月15日网上发售2352-9148/© 2021作者。出版社：Elsevier Ltd这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuA. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）1007872癌基因如血管内皮生长因子（VEGF）的边缘抑制[3]。TLR7的作用机制激发了抗病毒和抗菌化合物、疫苗中佐剂以及用于癌症治疗、过敏和哮喘的新药的开发[4]。在TLR 7途径激活后，募集多种转录因子和干扰素调节因子，并释放多种细胞因子，包括I型干扰素（即IFN-α和IFN-β），其以旁分泌和自分泌方式作用于感染和未感染细胞以产生抗病毒免疫。IFN-I激活的途径最终导致干扰素刺激基因（ISG）的激活，ISG是一组广泛的蛋白质，参与对病毒病原体的多方面应答。例如，由此类ISG激活的蛋白激酶R抑制病毒蛋白质合成，或2′，5 ′-寡腺苷酸合成酶家族降解病毒RNA [5]。咪喹莫特及其衍生物瑞喹莫特和加德喹莫特是研究最多的TLR7激动剂之一（图1B）。 ①的人）。咪喹莫特（化合物9）是一种三环氮分子，属于咪唑并[4，5-c]喹啉系列，通过诱导IFN-α间接抑制某些病毒的病毒复制，如单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、仙台病毒、人乳 头 瘤 病 毒 （ HPV ） 、 裂 谷 热 病 毒 （ RVFV ） 、 丙 型 肝 炎 病 毒（HCV）、班齐病毒、痘病毒（传染性软疣病）[6]。通常，咪唑喹啉类如瑞喹莫特可以同时激活TLR7和TLR8 [7]，但其中一些，如咪喹莫特，可以作为TLR7特异性激动剂[8]。Aldara®（5%乳膏）和Zyclara®（3.75%乳膏）是两种市售的FDA批准的含咪喹莫特的产品，用于治疗12岁或以上人群的光化性角化病、浅表基底细胞癌、外生殖器和肛周疣[9]。咪唑并喹啉的抗病毒活性可能是其最显著的研究活性，但其治疗意义并不限于此。Gardiquimod已用于癌症治疗。抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和抑制转移被认为是该药物发挥其抗肿瘤活性的可能机制[14]。咪喹莫特被证明可以阻止皮肤乳腺癌通过CD8+ T细胞依赖性机制[15]。瑞喹莫特已被证明通过阻碍由肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和骨髓源性抑制细胞（MDSC）介导的抑制而具有肿瘤消退活性[16]。调节性T细胞（Treg）的抑制作用的逆转和自然杀伤细胞的刺激是TLR7活化发挥抗癌作用的另外两种途径[17]。尽管对TLR7如何识别和产生针对细菌RNA的免疫应答知之甚少，但确定了其在常规树突细胞中针对细菌识别的活性和随后的1型辅助性T细胞（Th1）应答的激活[18]。由于TLR7和TLR8在功能和结构上的高度相似性，大多数时候都是一起研究的。嘧啶和嘌呤衍生物、（杂）双环化合物、（杂）三环化合物、大分子RNA或DNA已证明具有TLR 7/8激动活性。最后一组（DNA和RNA寡聚体）似乎比其他的更不有希望，因为TLR7激动剂将是无效的，除非充分递送到TLR7驻留的内体区室。作为8-羟基腺嘌呤衍生物的化合物4（图1）表现出比咪喹莫特高10倍的IFN-诱导活性，并且具有更好的口服耐受性。鸟苷类似物如LOXoribine仅通过TLR7激活免疫细胞。在小鼠中进行的lox oribine功效的体外研究显示出对B16黑色素瘤肺肿瘤转移的实质性抑制[4]。计算机辅助药物设计（CADD）方法促进了发现新的化合物，而不依赖昂贵的合成工具和各种药理学测试。本文由计算方法的不同阶段组成，旨在以逐步的方式相互验证。Fig. 1. 概述了7种先前表征的N9-吡啶基甲基类似物及其EC50值和一些其他众所周知的TLR 7激动剂[10]。还有，咪喹莫特[11]、瑞喹莫特[12]和加德喹莫特[11]的EC50值已从BindingDB数据库[13]中的参考文献中推导出A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）10078732. 方法和材料2.1. 概述在第一阶段，从大量文章中收集了256个TLR7激动剂。在下一阶段，这些化合物的分子描述符计算与MoE软件。所准备的数据必须以提高定量构效关系（QSAR）模型质量的方式进行管理。并不是所有的描述符都可以实现可靠的预测最终模型。因此，必须排除多余的描述符。我们的特征选择方法，这个过程是向前和向后消除。我们测试了不同的方法，但最好的方法是R平方。使用统计学习程序来创建分子描述符与每种化合物的效力之间的关系，以生成稳健的QSAR模型。基于对接的虚拟筛选作为另一种计算方法被实施，以从DrugBank数据库中推荐能够激动TLR7受体的新的再用途药物。在下一步骤中，基于几何的模型用于在虚拟筛选步骤中过滤出最佳预测的化合物，以产生顶级化合物。应用统计算法来确认虚拟筛选作为双重验证程序所准备的数据是至关重要的。在最后阶段，利用分子动力学作为最终的计算验证工具，以揭示配体分子与TLR7受体的真实结合驻留和相互作用，并确定计算的正确性和准确性虚拟筛选 和 机器学习过程。 这个工作流程是在图2中描绘了每个过程，并且每个过程将在接下来的部分中进一步详细阐述。2.2. 数据集收集和描述符计算从文献[ 10，19-27 ]中生成了256个TLR 7配体及其EC 50和结构的数据集。该数据集使用Scopus数据库中的一组检索标准生成，使用这三个关键词“TLR7“和“激动剂“和“EC 50“。在Scopus中总共获得了13个结果，这些结果被手动过滤用于使用新化合物的设计/发现目的的研究。在这些选定的研究中，一些化合物对TLR7没有表现出或表现出非常轻微的激动活性，其也作为诱饵被包括在数据集中。使用计算器的随机数生成来为这些值的EC 50分配数字。然后在分子操作环境（MoE）软件中手动导入结构，并通过QuickPrep模块制备。在结构制备中，Pro-tonate 3D被用于所需原子的质子化。进行3D结构制备以达到小于100 μ m的梯度。0.001千卡/摩尔/升。制备后，将与其EC50值一起构建。某些EC50在低于特定范围的浓度下没有活化作用。我们使用随机数生成器（在该范围内）来创建随机EC50值，因为通过数据增强在EC50值范围内具有多样性已经获得了很多关注，因为其不可否认地提高了模型精度。在MoE软件（2015.10版）中，可以计算物理化学描述符，包括2D、i3D和x3D描述符。手动删除了所有分子的常数为0或1的许多描述符（专家意见），保留了135个或删除了不能用于QSAR模型的不相关值。在特征选择中进一步筛选了用于构建模型的描述符。图二. 本研究工作的一般程序。注意QSAR和MD是如何用于双重验证基于分子对接的筛选的活性的。A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）1007874∑ne 为n）yQ2 =1 -i=1ii/i=1 -PRESSi2.3. 特征选择对于描述符的最佳组合，使用前向和后向选择方法。将EC50转换为负对数标度，并将所有特征（描述符）归一化。P-均方根PRESS=PRE SS2.5.2. 交叉验证决定系数（Q2）Q2的计算方法如下：值阈值（0.25）被用作停止规则。∑n（年-y′）2模型：RMSE（均方根误差）、AICc（赤池信息准则，校正）、BIC（贝叶斯信息准则）和R2（系数）。ni=1（yi-y-）2SSYi的决心）。AIC和BIC都通过考虑模型简约性来结合绝对拟合。换句话说，它们通过向模型中添加参数来惩罚，但它们通过不同的方式实现这一点。在这两者中，BIC通过向模型添加比AIC更强的参数来进行惩罚。对于这两个参数，负值越大表示拟合越好，将被选为最终模型[28]。2.4. 偏最小二乘回归（PLSR）模型在这项研究中，统计启发的偏最小二乘法（SIMPLS）的修改被用来预测EC50的描述符的基础上。偏最小二乘（PLS）是一种多变量机器学习或统计学习算法，它在普通最小二乘的应用不能产生令人满意的结果的情况下取得了成功，例如高度相关的X变量，几个Y（因）变量和大量X变量[29]。 SIMPLS方法适用于具有共线性的大规模数据集，如QSAR数据。PLSR是一种快速的方法，因为它将复杂的矩阵计算转化为简单的回归。PLSR通过将预测变量和响应变量投影到新的低维空间中来发现线性回归模型，类似于调节变量之间的共线性的主成分分析（PCA）。PLSR利用Xs和Ys之间的相关性来揭示潜在的潜在结构，并识别解释预测因子和响应之间最高协方差的主成分（PC）。对数据集进行数据集居中和缩放，这意味着数据矩阵X具有零均值和单位方差。在此步骤中，计算以下统计值：PRESS（均方根预测残差平方和）、R2和Q2(the交叉验证决定系数）和VIP（可变重要性投影）。2.5. 模型评估留一交叉验证（LOOCV）用于确定提取的最佳因子数。上述所有过程均使用JMP Statistical Discovery Software 13完成。一些Python库用于其他分析（Seaborn和Matplotlib用于图形绘制，NumPy和Pandas用于数值计算和分析）。2.5.1. 预测残差平方和的根均值（PRESS）PRESS的根均值取决于交叉验证过程。PRESS残差定义为e（i）=yi值得注意的是，声明在这些方程中，y通常是指生物值（EC50），x是指QSAR模型中的理化特征对所有n个观测重复该过程，PRESS统计量计算如下：其中，y-i是观测值的计算平均值，SSY是基于验证集观测的所有响应的Y平均平方和。2.6. 基于分子对接的虚拟筛选虚拟筛选是一种计算密集型方法，用于从数据库中提取的化合物训练集中识别有效配体。因此，DrugBank的完整数据库被提取并用于此目的。进行EXtra precision（XP）分子对接技术以确定由于其对接能和与TLR7的分子相互作用而导致的最佳结构。将准备好的训练集导入Glideof Schrodinger，并使用Optimized Potentials for Liquid Simulations 2005（OPLS_2005）力场计算能量值（XP GlideScore（XP GScore））。基于考虑配体的环构象和氮转化，Glide能够对柔性配体结构进行采样。在pH 7.2（细胞内pH）下计算稳定配体的Epik状态罚分，并添加到GlideScores中[30，31]。最后，将具有最负对接分数的结构传递到QSAR模型评估。在基于统计学习的QSAR模型上显示出最低EC50值的前十个化合物通过分子动力学研究进一步评估其与TLR7的相互作用。TLR7的最新结构（来自PDB数据库的5NF，来自Macaca mulatta）用于本研究。基于Zhang等人的研究，已知TLR7具有两个空间上不同的结合位点[32]。第一个结合位点在TLR7和TLR8结构中是保守的，识别小分子并对其激活至关重要，第二个结合位点识别单链RNA分子（ssRNA）。在该研究中，作者还指出，第一个位点优先结合鸟苷，而第二个位点通常结合ssRNA结构中的尿苷部分。在本研究中，使用了第一个结合位点，因为它已被进化设计为容纳小分子（鸟苷类似物）。这个结合位点位于 TLR7的两个亚基的交叉点。Lys432被用在网格生成的中心，具有25*25*25 mm尺寸的框X2.7. 分子动力学（MD）分子动力学（MD）是一种广泛使用的计算方法，用于理解在所需情况下各种分子之间的相互作用[33，34]。在本研究中使用MD研究来验证配体是否能够以令人满意的结合特性驻留在TLR 7的结合口袋中可接受的时间段。换句话说，MD充当使用QSAR和分子对接部分实现的虚拟筛选的验证部分MD研究使用Desmond软件包（D.E. Shaw Research [35]），对于每个（前八个）配体，持续20 ns的时间。OPLS_2005力场应用于模拟，SPC水模型和浓度为0.15 M的NaCl。最速下降最小化和有限记忆Broyden算法按=∑i=12（一）∑i=1（yi-′2I/I弗莱彻-戈德法布-尚诺（LBFGS）方法的能量最小化用于以2000的最大迭代设置MD模拟其中符号i/i表示模型预测当从训练集中排除第i个样本在NPT（恒定原子数、压力（1.01325巴）和恒定温度（310 K））系综中，并且在运行MD模拟之前，以下统计信息已应用于要素选择A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）1007875=-+--进行模拟退火。在模拟退火中，系统的温度升高到400 K，以消除非选择性相互作用0.5 ns，然后恢复到正常的310 K。此外，利用SHAKE算法对水分子的几何形状和重原子与氢的键长施加约束，以加速计算并具有可接受的精度。采用Nose-Hoover链和Martyna-Tobias-Klein方法作为恒温器和稳压器调节方法，1.0 ps和2.0 ps的间隔，分别使用各向同性耦合样式。长程静电力的求和是通过著名的粒子网格埃瓦尔德（PME）方法完成的。采用2 fs和6 fs可逆 参 考 系 积 分 器 算 法 （ Reversible Reference System DiscriminatorAlgorithm，简称CRIA）的积分时间步长计算近、远程力。 在计算库仑力时，保持9.0 μ m的截止半径。参照模拟的第一帧监测蛋白质和配体的均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）以及配体在最终结果中记录了持续时间超过模拟时间15%的相互作用3. 结果和讨论3.1. 特征选择在135个描述符中，选择了45个特征。计算了该步骤的几个参数，这些参数描述于下表1中。3.2. SIMPLS QSAR模型使用上一步中选择的描述符，构建SIMPLS模型。在图3中，我们显示了SIMPLS模型中基本描述符的系数。我们模型如图4A所示。该模型能够提供令人满意的结果（图4B和C），如良好的回归系数（R2 0.8054）和交叉验证回归系数（Q20.5856）所示。值（表2）。最小均方根PRESS为0.6534，因子的最小数量为14（图1）。 4 D）。因子的最大32个描述子的VIP值均大于0.8，表明它们在预测EC50中发挥了重要作用。该模型提供了一个回归方程的描述符是计算效率与理想的精度。GCUT_SLOGP、无功、SMR_VSA0、PEOE_VSA 1和PEOE_VSA-3是最重要的描述。GCUT描述符利用原子对logP的贡献（使用Wildman和Crippen SlogP方法）而不是部分电荷。反应性是反应性基团存在的指标。VSA是范德华表面积的缩写，SMR表示vi的和，使得Ri在[0，0.11]中，其中Ri表示原子i对摩尔折射率的贡献，并且Vi表示原子i的范德华表面积（V2）。轨道电负性部分均衡（PEOE）是一种计算轨道电负性的方法。原子部分电荷，电荷在键合原子之间转移，直到平衡[36]。我们可以大致得出结论，与溶解度和能量值相关的特征是我们模型中最相关的特征。变量投影重要性（VIP）评分估计模型中使用的投影中每个变量的重要性（图5）。SIMPLS模型的Python代码附在补充材料中。表1特征选择步骤的统计结果。AICc（基于样本大小的AIC校正版本）和BIC是特征选择性能的度量RMSE R平方R平方BIC0.0102 0.7909 0.7461-1555.61-1410.68Seaborn 和 Matplotlib （ 图 6 ） 说 明 了 特 征 与 目 标 值 （ 1/ Log（EC50））之间的相关矩阵。在该图中，较浅的颜色表示较低的线性（Pearson）相关性，而较强的颜色表示更稳健的线性相关性。我们使用该图来减少多重共线性的数量，并评估每个描述符的贡献是否足以保证最终模型的准确性。3.3. 基于分子对接的虚拟筛选通过分 子对接的虚拟 筛选的结果 鉴定了能够在 鸟苷结合位 点（Lys432是最重要的残基之一）处结合TLR7的顶级化合物。在该步骤中，将8665种化合物对接在受体位点（因此，在结合位点中太不稳定的配体不计入该数量），并选择前100种化合物用于下一步基于QSAR的验证。通过分子对接鉴定的最有效的化合物是2′脱氧胸苷-5′-二磷酸-α-D-葡萄糖，XP GScore为16.24。核苷酸连接的糖具有最好的对接得分并不奇怪，因为该结合口袋主要被设计为与鸟苷结合。其他几种核苷酸/核苷或其类似物也显示出惊人的负能量值对接。例如，1-磷酸甲基膦酸-鸟苷酸酯、2-磷酸氨基膦酸鸟苷酸酯、3-胸苷-5′-二磷酸-磷酸-β-D-木糖在它们的结合能方面是第二至第四高的化合物。Denufosol是一种用于囊性纤维化的药物，由两个连接的核苷酸组成[38]，在这一类别中排名第五（表3）。补充材料中提供了虚拟筛选结果的完整列表。由于核苷酸已经在各种研究中进行了研究，并且它们的类似物可以干扰病毒发病机制中的许多途径，因此本研究集中于激动TLR7活性的其他可能的配体。本研究最有趣和最突出的结果之一是头孢噻呋、头孢替安、头孢曲松、头孢地尼、头孢托仑和头孢泊肟等头孢菌素类药物显示出比先前公认的抑制剂（如咪喹莫特和瑞喹莫特）更强的抑制活性。通常，头孢菌素是用于对抗从革兰氏阳性菌到革兰氏阴性菌的一系列感染的β-内酰胺抗菌剂。历史上，它们来源于真菌头孢霉属，并且通过共价抑制细胞壁合成所需的青霉素结合蛋白如肽聚糖转肽酶，它们发挥其药理活性[39，40]。令人惊讶的是，在文献中有一些报告提到了头孢菌素类的抗病毒活性。在瑞士研究人员1988年的一项研究中，证明了一些头孢菌素衍生物能够抑制两种含DNA的病毒，即牛痘病毒和单纯疱疹I型（HSV-I），但不能抑制含RNA的病毒（对正常细胞也没有活性）[41]。 现在很可能观察到的这些衍生物的一些作用与TLR途径（主要是TLR7和TLR8）有关。头孢菌素也被证明是针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白C-末端结构域（N-CTD）的潜在抑制化合物，头孢曲松显示出最强的抑制潜力[42]。已测试了头孢曲松对新型人冠状病毒（SARS-CoV-2）的抑制活性，其对该病毒的抑制作用为16.14μM，头孢哌酮的抑制作用也更强（12.36μM）[43]。在这些抑制值和它们相应的TLR 7抑制值之间似乎存在松散的联系（头孢曲松为-12.614XPGScore和7.825XPGScore 为 头孢哌酮）。 以活体 计算机模拟研究， 发现头孢替安在抑制SARS-CoV-2 M蛋白的最有潜力的化合物[44]. Hobi等人指出，头孢他啶的一些衍生物或降解产物可能具有与CD4/gp 120相互作用无关的抗HIV-1作用[45]。 在Pomorska-Mo'l等人的另一项研究中，研究人员发现，头孢噻呋扭曲体液和细胞免疫反应，A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）1007876图3.第三章。TLR7激 动 剂 基于PLSR的QSAR模型生成 的主要 步骤。见图4。 A）SIMPLS模型中重要变量的系数。B）左图是训练数据的预测图上的实际值（1/Log（EC50））。C.剩余 值超过训练集的预测值1/Log（EC50）。D）最小根均值PRESS= 0.6534，最小因子数为14。如TLR激动剂所预期的那样，用于疫苗[46]。与我们的发现一致的先前文献数据的数量并没有到此为止。越来越多的证据指出头孢菌素可能与某些形式的自身免疫有关.例如，头孢菌素诱导的自身免疫性溶血性贫血的急性和致死性发病率已有报道，但潜在的没有建立机制[47特别是头孢曲松，据报道可引起其他类型的自身免疫反应，如急性自身免疫性肝炎，这可能导致暴发性肝衰竭[52]。头孢曲松和头孢吡肟与药物诱导的自身免疫性系统性红斑狼疮（SLE）有关[53，54]。头孢菌素和青霉素通常被认为是A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）1007877-表2SIMPLS模型在训练阶段交叉验证的统计结果详情Q2累积Q2R2 X累积R2 X R2 Y累积R2 Y0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.00002019年12月31日星期一上午10时30分2017年12月31日星期一上午10时30分2019年12月31日星期五上午10时30分2009年12月31日2019年12月31日星期五上午10时30分2019年12月31日星期一上午10时30分（c）在2004年12月31日之前，2019年12月31日星期四上午10时30分2019年12月31日星期一2019年12月31日2019年12月31日星期一上午10时30分2009年12月31日至2009年12月31日2019 - 05 - 25 00：00：000.0129 0.8709 0.0054 0.70800.5591 1.0000 0.0161 0.8870 0.0048 0.7127图五. 变量投影重要性（VIP）值超过SIMPLS模型中相应的系数。[55 ]第55话：与这些发现平行的是，我们知道一些TLR激动剂可以在动物模型中用作自身免疫反应的人工生产者事实上，TLR4和TLR9配体经常用于在动物模型中诱导自身免疫性疾病或特异质药物不良反应，因为它们刺激炎症并激活先天免疫系统[56]。甚至局部使用TLR7激动剂也被用于诱导小鼠狼疮样疾病[57]。TLR7拮抗剂也被认为是自身免疫性疾病的可能治疗策略[2]。这些信息强烈强调了头孢菌素类在TLR前体和自身免疫性疾病中的作用，我们的研究通过计算证实了这一点，并且在前面讨论的许多体外和体内条件下也有报道几种不同TLR的激活可能有助于观察到的头孢菌素类的这种作用。头孢菌素类的这种有用的TLR激动作用可谨慎地用于治疗病毒性疾病，特别是当另外怀疑细菌原因时。更重要的是TLR7能在体内抗病毒特性，应该看看巴姆和同事的论文。他们证明GS-9620（一种TLR7激动剂）可有效抑制血液单核细胞中的HIV-1感染[5]。此外，GS-9620已被证明可降低慢性感染黑猩猩的肝脏和血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA、HBeAg和HBsAg浓度[58]。有趣的是，已发现瑞喹莫特显示出抗单核细胞中HIV复制的抗病毒活性[59]。在候选系列潜在TLR 7激动剂的化合物中，戊托西他滨显示出对血清HBV DNA的显著抑制作用，并且在慢性HBV患者中耐受良好[60]。吉西他滨是一种用作抗癌药物的核苷类似物，已证明具有广谱抗病毒活性，并可通过先天免疫抑制肠道病毒感染[61]。3.4. 基于QSAR的虚拟筛选对具有最低负结合能（XP GScore大于10）的虚拟筛选的入围化合物进行基于QSAR的验证（注意，如前所述，有意忽略核苷酸类似物）。在该步骤中，鉴定了对TLR7具有激动活性由于分子对接只能告诉我们结合而不一定是激动或拮抗作用，因此这种验证可以提高发现具有可证明的激动活性（而不仅仅是强结合亲和力）的正确化合物的本节的最佳化合物为头孢噻呋、头孢替安、头孢曲松、头孢地尼、西多福韦、吉西他滨、头孢托仑、戊托西他滨、胞氯、头孢泊肟、阿巴卡韦、阿德福韦和D-腺嘌呤、5-[4-叔丁基苯基硫烷基]-2，4-喹唑啉二胺（DB 01958）。前八种化合物在额外的步骤中使用MD模拟进行测试，以确保它们是否在TLR 7的结合口袋中显示出相当大的结合驻留。表4列出了前十种化合物验证部件的QSAR结果。3.5. 分子动力学（MD）对最强的TLR 7激动剂（图1，化合物1）、咪喹莫特和本研究中鉴定的6种其它化合物（其中3种是头孢菌素，包括头孢曲松、头孢地托伦和头孢泊肟加上3种其它化合物，即西多福韦、阿德福韦和D-腺嘌呤）进行MD.在所有情况下，配体在与TLR7连接的结合口袋中保持稳定，但每个配体分子之间存在一些细微差别（它们的结合方向和亲和力），这将被广泛详细地讨论阿德福韦酯和头孢妥仑的结果最有影响力，我们在此仅对这两种化合物与咪喹莫特和化合物1进行讨论（对每种化合物的结果进行完整描述许多因素根均值PRESS01.003910.777420.721530.689040.688950.695660.707870.685080.673590.6619100.6624110.6632120.6619130.6594140.6535150.6640A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）1007878见图6。45个特征与目标值之间的相关矩阵。颜色越分散，模型越缺乏多重共线性，模型将变得越稳健。第一行的颜色（值）可以是描述符在预测EC50中的贡献 的 指 示 符 （ 在 VIP 旁 边 ） （ 该 图 使 用 Seaborn 绘制）。有关此图的完整缩写列表，请访问Bernal等人的补充材料。[37]。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版。）表3对TLR 7具有强结合亲和力的一些化合物的列表（小于-10XPGScore）。核苷酸类似物有意限于前五种化合物（第1至5行）。头孢菌素类显示XP GScore的大（绝对）值，表明其作为TLR7激动剂的应用的高潜力。化合物XP GScore的名称12′脱氧胸苷-5′-二磷酸-α-D-葡萄糖-16.2422磷甲基膦酸-鸟苷酸酯-15.8773磷酸氨基膦酸鸟苷酸酯-15.6544胸苷-5′-二磷酸-β-D-木糖-15.5145脱硝磷-15.2616淫羊藿苷-14.36310卢布-13.733表4将虚拟筛选的顶级化合物的预测1/Log（EC50）值与咪喹莫特的实际值进行比较。根据我们的模型，预期所有鉴定的化合物在TLR7中产生比咪喹莫特更大的响应，尤其是头孢菌素。请注意，本表中的化合物是根据其分子对接评分而不是预测的QSAR值进行分类的。化合物名称预测值1/Log（EC50）1阿德福韦酯-0.01312头孢曲松-0.02683西多福韦-0.03584白消安-0.02435D-腺嘌呤-0.02908卡波-13.1016头孢波多X肟-0.03089阿扎胞苷-13.05710头孢噻呋-12.72811头孢替安-12.65312头孢曲松-12.61413鸟苷酸-12.52514头孢地尼-12.44815西多福韦16吉西他滨-12.32817橙皮苷-12.17218阿卡波糖-12.10919头孢地托伦-11.86320戊托西他滨-11.8621潮霉素B-11.8257头孢妥仑-0.03068头孢地尼-0.03029头孢噻呋-0.032910咪喹莫特-0.0616（实际值）开发了来自PDB的5H2F晶体结构，其是TLR7与咪喹莫特共结晶。因此，咪喹莫特的RMSD图被认为比其他配体低（图7A）。这不应该给人一个错误的印象，即其他化合物是TLR7的弱抑制剂。事实上，化合物1的MD结果强烈支持这一点。概念（我们预计在RMSD图中会看到较低的波动，22头孢波多X肟-11.73该化合物与咪喹莫特相比）。 根据这一观察，23阿德福韦酯-11.52924D-腺嘌呤-11.47525咪喹莫特-11.37226阿巴卡韦-10.94827瑞喹莫特-10.114化合物，请访问补充材料;头孢泊肟、D-腺嘌呤、头孢曲松和西多福韦是其他四种最常用的化合物）。分析结果时的第一个事实应该是，因此，将化合物1设定为真实参考以评估不同药物配体在TLR7的鸟苷结合口袋中的结合波动（图7B）。分子动力学模拟结果表明，阿德福韦酯和头孢托仑在本研究中所研究的所有化合物中表现出最有希望的结果。在结合位点稳定后（7.5 ns后），阿德福韦表现出小于0.1 μ g，这是相当显著的，甚至优于化合物1（图7C）。头孢妥仑似乎稳定得更快，但显示出约0.15 μ g的波动，再次优于A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）1007879见图7。 咪喹莫特（FDA批准的药物，通过激动TLR7起作用），化合物1（最有效的TLR7激动剂，EC 50为0.2 nM），以及本研究中发现的两种最有效的抑制剂，即阿德福韦酯和头孢妥仑。计算了TLR7和配体的Cα与其第一帧相比的RMSD值。化合物1（图1） 7 D）。一般而言，对于本研究的化合物，各种配体的蛋白质的RMSF研究似乎相似，但存在一些细微差异。有趣的是，头孢妥仑显示较低的RMSF值（甚至低于咪喹莫特作为TLR7的共结晶配体），这表明该配体在TLR7口袋中具有非常强的结合取向（参见补充材料，蛋白质RMSF）。基于蛋白质的RMSF图，还可以推断参与蛋白质的残基是见图8。利用Desmond软件对所研究的化合物进行了相互作用图的模拟。Thr586、Asp55和Phe408是TLR7的鸟苷结合位点中最重要的残基A. Abiri等人医学信息学解锁27（2021）10078710阿德福韦、头孢妥仑和化合物1与配体的相互作用是相同的，但与咪喹莫特略有不同。咪喹莫特在260至390左右的残基中没有显示出与配体的任何相互作用，而其他三个残基表明了这种相互作用。Thr586是所有化合物相互作用的最突出的残基之一，突出了其在TLR7的鸟苷结合位点中的重要性。 Asp555是鸟苷结合位点中另一个非常重要的残基，与所有四种化合物都有相互作用。Phe 408与所有化合物的配体中的各种环显示π-π堆积键。Lys432被用作我们的网格中心用于分子对接，代表与阿德福韦和化合物1的氢键（图1B）。 8）。在模拟过程中蛋白质二级结构的分析揭示，头孢托仑倾向于比其他三种结构更多地折叠蛋白质的结构，与咪喹莫特和阿德福韦相比多约0.5%，比化合物1多0.3%。不难设想这种折叠稳定性和配体的结合驻留之间可能存在联系总之，我们想强调头孢菌素类在通过TLR激活增加免疫应答中的重要但可能被忽视的作用。头孢妥仑是我们最有效的头孢菌素，能够与TLR7相互作用，据报道很少引起药物反应伴嗜酸性粒细胞增多和全身症状（DRESS）[62]。这些报道与我们的结果一致，即头孢菌素是细胞中TLR途径的4. 结论TLR7激动剂越来越多地被认为是免疫刺激分子，它们的用途可以包括疫苗制剂中的抗病毒剂和佐剂。我们以逐步可验证的方式进行了三种独立的计算方法，以通过药物再利用或重新定位方法获得顶级化合物首先，我们建立了一个基于先前表征的TLR7激动剂的数据集。计算了它们的物理化学描述符，并在特征选择后，采用统计学习方法（SIMPLS）生成QSAR模型。因此，使用QSAR构建然后，我们使用分子对接完成了在该步骤中，发现核苷酸类似物对TLR7具有最有效的结合亲和力。一些头孢菌素在我们的虚拟筛选中排名非常高，我们决定进一步研究这些化合物是否是合适的TLR7结合剂。其次，我们使用我们以前训练的QSAR模型作为基于配体的筛选，通过分子对接的基于结构的虚拟筛选的结果。一些以前确定的抗病毒药，即西多福韦和阿德福韦，除了头孢菌素，表现出显着的预测EC50值，更负比咪喹莫特。最后，我们进行了MD模拟以了解配体-TLR 7复合物是否保持稳定直到适当的时间。头孢菌素中的头孢妥仑和抗病毒药物中的阿德福韦代表了最好的结合特性，被认为是非常有效的TLR7结合剂。精明的读者应该记住，由于QSAR模型是基于激动剂（而不仅仅是结合TLR 7）进行训练的，因此我们的模型在功能方面具有很高的可靠性（作为激动剂/拮抗剂，而不仅仅是结合TLR 7的结合位点我们的文献调查进一步证实了我们的发现，头孢菌素调节免疫系统。有大量研究（在讨论中列举）表明头孢菌素类药物在药物诱导的自身免疫中可能存在我们的研究结果可以阐明头孢菌素的更明智的使用及其在病毒性疾病中可能的再利用途径，特别是当免疫系统受损或减弱时，获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）。简而言之，头孢妥仑和阿德福韦在计算机模拟中显示出与TLR7的显著结合亲和力，甚至强于咪喹莫特和化合物1（迄今为止最有效的体外TLR7激动剂）。头孢泊肟、D-厄立他腺嘌呤、头孢曲松和西多福韦是具有强TLR 7激动活性的下一候选物.未来的体外和体内研究将揭示我们的三种组合（QSAR-对接-MD）平台的精确度。作者AA设计了这项研究。MHZ执行了QSAR的数据集管理。QSAR模型生成和统计学习分析由MR完成。虚拟筛选，分子动力学和一些Python计算由AA执行。MR，MHZ，YV，LD，MK和AA都为撰写手稿做出了贡献竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认我 们 要 感 谢 David Winkler 教 授 （ 拉 筹 伯 大 学 ） ，MariaNat'aliaDiasSoirsCordeiro 教 授 （ 波 尔 图 大 学 ） ，