工程7（2021）1434研究肿瘤诊断和治疗新技术-文章飞秒激光捕获肿瘤细胞的聚合物芯片实验室的制作Annalisa Volpea，b，Sunday，Udith Krishnana，Maria Serena Chiriaciónc，Sunday，Elisabetta Primiceric，Antonio Anconab，Francesco Ferrarac，da物理系，巴里阿尔多莫罗大学b光子学和纳米技术研究所，巴里70126，意大利c纳米技术研究所，莱切73100，意大利d意法半导体，莱切73100，意大利阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年10月13日修订2020年10月29日接受2020年12月1日网上发售保留字：芯片实验室飞秒激光器循环肿瘤细胞Point of care热粘合聚合物A B S T R A C T用于设计和制造聚合物芯片实验室的快速原型制作方法正在兴起，因为它们具有高度的精度和灵活性。例如，微流体平台可能需要优化阶段，其中可能需要连续修改架构和几何形状;然而，这仅在容易、可控的制造方法和低成本材料可用的情况下才是可能的。在本文中，我们描述了一个微流控工具的实现过程，从计算机辅助设计（CAD）到概念验证应用程序作为循环肿瘤细胞（CTC）的捕获设备。整个平台是在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）中实现的，结合了飞秒（fs）激光和微铣削制造技术。该多层器件是通过一种简便、低成本的溶剂辅助方法组装的。然后通过固定捕获探针直接生物功能化蛇形微通道，该捕获探针能够在没有标记的情况下区分癌症和非癌细胞。的所实现的平台的低材料成本、可定制的方法和生物学应用使其成为工业开发和护理点应用的合适模型©2020 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍芯片实验室（LoC）被定义为在几平方厘米的芯片内集成多种实验室技术的设备，在化学[1-3]和生命科学的各个领域（如稀有细胞捕获[4，5]）中具有巨大的应用潜力在这些应用中，循环肿瘤细胞（CTC）的捕获是医学生物学领域中最具挑战性的任务之一[6，7]。肿瘤源性上皮细胞的检测被认为是确定肿瘤转移潜力的最经济实惠的方法之一，血液标本中此类细胞的存在和数量是诊断和预后标志物[8]。将LoC技术转移到用于CTC检测的床旁（POC）设备中的可能性是床边癌症诊断和精准医学的一个感兴趣的话题[9]。这项技术最近成为一种有价值的工具，*通讯作者。电子邮件地址：annalisa. uniba.it（A. Volpe），mariaserena. nanotec.cnr.it（M.S. Chiriaclidae）。大规模筛查的患者数量不断增加在这个方向上，许多测试已经通过智能手机等用户友好的工具融入日常生活[10]。这些测试的范围从心血管疾病的血液测试[11，12]到片上核磁共振（NMR）和表面增强拉曼光谱（SERS）分析[13，14]，以及通过可以提供计数、检测和形态测量参数的特定专用软件进行的片上细胞鉴定[15][16]。考虑到POC器件可能具有的广泛用途，近年来聚合物LoC由于其在生产成本、生产时间和将想法转变为物理芯片的实用性方面的竞争力而产生了巨大的兴趣[17，18]。不同的技术可用于聚合物LoC快速原型[19]。其中，由于其高分辨率（50 nm），软光刻是用于微流体应用的聚合物微/纳米粒子原型制作的最常用方法之一[20]。该技术需要制造模具，通常通过光刻法，其几何形状取决于目标应用、复制和整个组件的组装。https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.10.0122095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engA. 沃尔普大学Krishnan，M.S.Chiriachteet al.工程7（2021）14341435设备.该技术的一个显著限制是所使用的材料 ;聚二甲基硅氧烷（PDMS）在微通道中受到高液体压力时会变形[21]。此外，像所有基于光刻的技术一样，软光刻是一个耗时的过程，这通常限制了原型设计或迭代设计中的优化。在新器件的设计过程中，基于衬底直接微结构化的技术（即不需要模具的技术）要方便得多。这些技术中有直接激光写入（DLW）方法和三维（3D）打印，仅举几例。后者具有明显的吸引力，因为其在LoC领域中被开发的潜力以及从计算机模型在单个步骤中制造真正的3D微流体装置的可能性尽管有这些好处，但3D打印结构目前无法与其他直接结构化技术产生的结构的分辨率实际上，其适用性受到在合理尺寸的装置中可靠地打印尺寸小于几百微米的微流体通道的技术能力的限制还有关于尺寸真实性、形状一致性、表面质量、光学透明度和材料可用性的问题[22]。相反，超快激光技术的灵活性使具有复杂微流体通道网络的LoC器件的快速原型和高精度微加工成为可能[23，24]，而不需要光刻工艺所需的昂贵掩模和设施此外，飞秒（fs）激光脉冲产生照射体积的“冷”烧蚀的能力与DLW相比，机械微铣削对于大特征更方便[29]，并且是用于聚合物器件的灵活、成本效益高且快速的原型技术;然而，其导致表面质量差，并且不适合微通道中的光学检测[30]。无论如何制造微流体图案，进一步的步骤包括将结构化基底或层与盖板结合，以获得有效密封的微通道。在文献中，已经提出了用于溶剂受控蒸发的复杂设备，以获得有助于聚合物热辅助密封的表面改性[31]。其他研究小组已经利用热退火、粘合剂涂层或表面的等离子体活化以及随后的压力粘合[32例如，已经公开了一种用于粘结聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）- PMMA器件的溶剂辅助方法，该方法基于将基底暴露于丙酮蒸气。然而，作者报告说，由于这种溶剂而引起的粗糙度的改变影响了该装置作为微流体工具的应用[33]。Volpe等人[35]证明了通过fs激光焊接结合聚合物LoC的可行性。在他们的研究中，聚焦在两个透明基底界面上的激光束产生了非线性吸收，从而使材料局部熔化和重新凝固。 尽管这些方法是有效的，但它们不适合于需要昂贵设备和/或复杂对准过程的低成本和快速制造。另一方面，尽管热结合方法代表了非常低成本的替代方案，但是它们基于聚合物熔融，并且不适合于结合具有非常小的通道尺寸的图案化衬底，因为变形或阻塞在加热过程中，通道的破裂是非常可能的。 因此，低温（低于90 °C）工艺是优选的[36]。在这项工作中，我们开发并测试了一种新的智能程序，用于PMMA LoC的快速原型制作，用于细胞捕获，FS激光技术用于微通道机械微铣削，用于入口和出口连接，以及热结合以完成装置。在用于微流体的许多不同聚合物中，PMMA是最常用的，这是由于其有利的光学、机械和化学特性，包括透明性、良好的热稳定性、化学惰性和高疏水性，以及其在激光烧蚀和微铣削过程中的机械稳定性[37]。从计算机辅助设计（CAD）文件开始，飞秒激光烧蚀和微铣削制造技术的结合提供了充分的适应性，以快速创建和测试不同的流体设计，并优化细胞捕获策略，利用超短脉冲微加工的微米精度和高灵活性，同时保持可持续的开发成本。该方案中还包括一种简单且具有成本效益的用于组装聚合物芯片的热和溶剂辅助粘合方法[38]，该方法证明了这种低成本和简单程序的一些创新该程序是为作为应用证明，该装置已被证明可用于从血细胞中无标记捕获和识别肿瘤细胞。为此目的，在蛇形微通道的制造之后，我们使用抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体对通道的内壁进行了“流入”生物功能化，所述抗体能够通过识别口腔癌细胞的上皮膜的抗原并将其阻断在通道壁上来区分癌症与非癌细胞。原则上，整个装置的完全透明性允许识别已经固定在通道内的细胞，而不需要用荧光抗体进一步标记。实际上，捕获细胞的特征化取决于通道壁上的固定化抗体。在我们的案例中，我们证明了只有肿瘤细胞被针对典型癌症的膜抗原的抗体识别，并且肿瘤细胞可以在通道中清楚地瞥见。通道的蛇形形状允许样品沿着延长的路径通过，这有助于最大化细胞和抗体之间的相互作用。在给定时刻包含在通道中的样品的总体积非常低（几微升），但是考虑到流入操作，这种配置对于稀有细胞的芯片上收集和从较高体积开始的样品富集（即，毫升）。2. 材料和方法2.1. 材料该 装 置 在 PMMA 基 底 （ Vistacryl CQ; Vista Optics ， Ltd. ，UK），具有光学表面质量（测量的表面粗糙度（Ra）5nm）。板为正方形，长度和宽度为25 mm，上层厚度为5 mm，下层厚度为1 mm。对于微通道功能化，我们使用乙醇中的3-氨基丙基-三乙氧基硅烷（APTES; 5%）、水中的戊二醛（0.05%）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的牛血清白蛋白（BSA）（1%）和Tween® 20（0.05%）以及抗EpCAM小鼠单克隆抗体（所有试剂均来自Sigma-Aldrich，USA）。抗EpCAM抗体特异性识别在上皮细胞表面上表达的人EpCAM，并且不与正常或肿瘤性非上皮细胞反应。A. 沃尔普大学Krishnan，M.S.Chiriachteet al.工程7（2021）14341436··OECM-1人口腔鳞状细胞癌细胞系（购自SCC/Sigma-Aldrich，USA）适用于研究癌细胞信号传导、上皮-间质转化（EMT）、转移、侵袭和癌细胞干细胞性。Jurkat细胞系（购自ATCC，USA）是人血液（白血病T细胞淋巴母细胞）衍生的细胞。2.2. LoC的制造、功能化和测试蛇 形 通 道 使 用 Rhinoceros 5 CAD 软 件 （ Robert McNeelAssociates，USA）设计，并使用1030 nm激光超快固态激光系统（mod. TruMicro Femto Ed. TRUMPF GmbH+Co.KG，德国）的线性 调 频 脉 冲 放 大 技 术 。 激 光 源 提 供 了 一 个 几 乎 衍 射 限 制 光 束（M21.3）线性偏振的脉冲持续时间为900 fs。四分之一波片使光束圆偏振，然后将光束聚焦并通过配备有焦距为100 nm的远心透镜的振镜扫描头（IntelliSCANNse 14; SCAN-LAB，德国）移动到聚合物表面上。100 mm，在聚焦点处提供约25μm的光斑直径。虽然PMMA在激光波长下几乎是透明的，但由于聚焦的fs激光的高峰值通量，脉冲，非线性多光子吸收介导的激光与透明聚合物的耦合，允许沿照射路径的薄表面层的温和烧蚀。逐层铣削过程通过叠加两个垂直的扫描图案进行之间的横向距离两条平行的扫描线为5μm。重复频率（RR）为50kHz，脉冲能量为12lJ，扫描速度为40mms-1被选中。微加工过程后，松散附着的碎片被去除，通过在蒸馏水中超声清洗10分钟。FS-激光铣削的微观特征的尺寸和铣削表面的平均粗糙度，Ra，分别由光学显微镜（Eclipse ME 600;尼康，日本）和光学ContourGT InMotion（布鲁克，美国）轮廓仪测量。采用Rhinoceros 5 CAD软件设计了进风口和出风口，并采用CAD-CAM软件将CAD信息以机器代码文件的形式传递给客户用于微铣削控制。使用微处理器的机载相机将入口和出口与蛇形通道对准。研 磨 机 （ Mini-Mill/GX; Minitech Machinery ， USA ） 。 使 用400μ m的工具在空气冷却下以20000转/分钟（RPM ）研 磨PMMA层。为了粘合PMMA层，在受保护的环境中使用设定为2000 RPM的旋涂机将热的纯异丙醇（70 °C）沉积在平底基底上10秒;用吸墨纸消除过量。然后组装两个PMMA切片。用活页夹保持该位置，然后立即将装置转移到60 °C的烘箱中，在那里保持20分钟而不施加额外的压力。将组装的装置连接到具有微研磨成形的入口和出口的完美配合的毛细管，并连接到微流体装置。所使用的Elveflow 微泵送系统（Elvesys，法国）配备有OB1基础模块、用于压力控制器的两个MkIII+通道和两个微流体流量传感器。将一系列溶液注入蛇形通道中，从APTES （5% ）的乙醇溶液开始该步骤导致胺官能团的PMMA通过表面与APTES的硅烷醇基团的缩合反应接枝，这产生胺官能化的PMMA（这使得PMMA通道具有亲水性，这允许随后的水基溶液更容易流动。在用水洗涤通道后，注入戊二醛（0.05%），其与微球相互作用。胺活化基团产生PMMA-戊二醛。在随后的阶段中，后者经历与抗体的胺基的亚胺偶联反应，从而实现抗EpCAM抗体的固定化[39，40]。用封闭缓冲液（PBS中的BSA-Tween ® 20）进行钝化步骤对于捕获测试期间的实时采集，使用Olympus IX 81倒置显微镜（日本）该装置包括一个配备温控箱和摄像头的Okolab系统。细胞培养物在37 ℃、5%CO2的培养箱中生长，并在RPMI 1640完全生长培养基（Sigma-Aldrich）中悬浮培养（Jurkat细胞）;或在完全Dul-becco 改 良 Eagle 培 养 基 （ DMEM; Sigma-Aldrich ） 中 粘 附（OECM-1细胞）;每两天更新培养基。在捕获实验前几分钟，将癌细胞悬浮并使用0.05%胰蛋白酶捕获。分离后，洗涤细胞并以正确的稀释度重悬于DMEM培养基从烧瓶中收集Jurkat细胞，离心，计数，并以正确的稀释度重悬。然后使用微流体设置将溶液加载到毛细管中，设置为流速值为7 lL·min-1。3. 结果3.1. LoC器件实现该设备的第一步是对其元件进行CAD，然后将其以机器代码的形式传输到所使用的制造设备中。图图1（a）和（b）示意性地示出了所提出的几何形状。为了优化制造、键合和最终应用的参数，设计并测试了各种不同的器件架构。 在这里，我们讨论的设备，这是基于一个服务的最终布局具有每平方米100升的正方形横截面的微通道侧面和180 mm的总长度，以增加活动路径从而增加捕获细胞的可能性。使用两个PMMA基板以使组装的装置的尺寸最小化并获得透明度。上基板（图1（a））在两个面上分别加工。在下表面，通过飞秒激光烧蚀制造蛇形通道，以微米精度逐层轻轻去除材料，直到达到设计深度在上表面上，使用微铣床制造入口和出口钻孔。底层是平坦且光滑的PMMA基底，其仅用于密封通道（图1）。 1（a））。入口和出口使用安装有400 μ m工具的机械微研磨机制成，在相对面上的蛇形端部仔细研磨之后。风冷铣削根 据 Reichenbach 等 人， 在 100 mm min-1 的 进给 速 率和 20 000RPM[41]第41段。入口和出口是与毛细管的外部和内部尺寸完美配合的同心圆柱孔从中心在这些圆柱体中，直径为600lm的通道和实现了5 mm的长度，这使得注入的流体以到达蛇形通道。图图2（a）示出了微机械加工的伺服通道的立体图像。在图2（b）中，突出显示了设备的特定部分。通道边缘未出现裂缝、裂缝或裂缝。重铸可能阻碍密封过程的层通道的底部部分具有约2 l m的粗糙度s，Ra。与通道高度相比，该值不影响细胞的流体运输。用紫外线（UV）等离子体工艺处理基板，以去除研磨工艺残留物并产生亲水性。A. 沃尔普大学Krishnan，M.S.Chiriachteet al.工程7（2021）14341437·×·×·图1.一、（a）PMMA装置的模块：上层在两侧上被研磨以在底部上获得fs激光形状的蛇形通道，并且在顶部上获得微磨机入口和出口孔PMMA的平片密封蛇形通道。（b）组装装置的结构图二. (a)激光微加工样品的立体图像;（b）蛇形通道的微观3D细节。3.2. 器件的键合和功能化开发了一种热辅助和溶剂辅助键合方法来组装微流控器件。在受保护的环境中将热异丙醇沉积在平坦基底上。然后将两个PMMA切片放在一起;用夹子固定其位置，然后立即将器械转移到烘箱中。一旦装置组装好，它就通过毛细管连接到微泵送系统;如从图1中可以看出的。 3（a），不需要额外的胶水、鲁尔接头或垫圈来实现水密密封。以这种方式，实现了通过蛇形通道进行流入官能化，然后进行光学显微镜监测（参见图3（b）中的顺序）。该设备的完全透明性允许测定的再现性和流量的在线监测注射优化PMMA通道功能化的具体方案，包括填充APTES（5%）的乙醇溶液，然后注射戊二醛（0.05%）的水溶液，然后注射抗EpCAM抗体的PBS溶液。蜿蜒的河道，溶液的缓慢流速（7Lmin-1）和实时通过对灌装过程的监控，我们获得了一种工具，就抗体的活性结合位点而言，利用了非常高的表面/体积比，因此具有优异的细胞捕获能力。3.3. CTC捕获实验测试了微流体装置区分癌细胞和正常细胞的能力出于这个原因，在 最 后 一 步 中 ， 我 们 固 定 了 抗 EpCAM 抗 体 ， 其 能 够 识 别 人EpCAM，一种通常存在于上皮型癌细胞表面的膜生物标志物[42，43]。然后进行避免非特异性细胞吸收的最终钝化步骤，其涉及用含有BSA（1%）和Tween® 20（0.05%）的PBS缓冲液冲洗为了证明我们的装置的有效性并提出组装装置的应用证明，我们用两种不同的细胞群（血液和肿瘤细胞）掺入培养基特别地，我们使用Jurkat细胞（血液来源的细胞）和OECM-1人口腔鳞状癌细胞系（来自人口腔癌的上皮样细胞）。我们分别制备了5 mL含Jurkat细胞株1 × 106细胞mL-1和OECM-1细胞株1 × 104细胞mL-1的使细胞悬浮液缓慢流过蛇形微通道图三. (a)最终设备的图像，该设备具有与微型泵和流量传感器的微流体连接。(b)在光学显微镜下监测进入微通道的流量。在注射期间产生的气泡的顺序（由红色箭头指示）使得可以遵循蛇形通道功能化。A. 沃尔普大学Krishnan，M.S.Chiriachteet al.工程7（2021）14341438·流速为7Lmin-1。对流体的低速、通道的大小及其蛇形形状进行了优化，以最大化细胞与内壁的相互作用，固定在表面上可以识别表达跨膜上皮抗原的细胞。在Jurkat细胞的情况下，在用PBS溶液洗涤后，在通道中识别出非常少的细胞或没有细胞（图4）。实际上，Jurkat细胞在细胞膜表面上不表达EpCAM抗原;因此，它们不能被固定在通道壁上的抗体识别和固定。为了证明蛇形通道中Jurkat细胞的存在，我们在蛇形通道的中间打开了另外的微磨孔，Jurkat细胞在其中快速积累，被流体力拖曳（图1B）。 5）。相反，在OECM-1细胞悬浮液的情况下，大量细胞被捕获在内壁上;它们也被发现在用PBS洗涤后粘附在表面上。如图6所示，细胞通过透明PMMA装置清晰可见，证实了使用这种工具作为诊断仪器的可能性，以无标记的方式将癌细胞与正常血细胞区分开，而不需要荧光检测器或复杂的仪器。如高放大率图像所示，通道外部的这是一个典型的问题，见图4。在Jurkat细胞流动和随后在PBS中洗涤之后，PMMA微通道。沿着微通道的路径几乎看不到或看不到细胞：（a，c）不同放大率下的蛇形环;和（b，d）不同放大率下的通道的直部分。图五、该图像显示了聚集在蛇形通道中间的孔中的Jurkat细胞，该蛇形通道是故意制造的，以验证这种细胞不会粘附到生物功能化通道与热塑性材料的溶剂辅助粘合;褶皱可能是由于溶剂和温度处理的组合引起的应力，如参考文献103中所报道的[33]第33段。在许多报告的情况下，裂纹的存在是如此明显，以至于通道的结构受到影响，这限制了装置的可应用性然而，在我们的情况下，褶皱仅存在于蛇形微通道外部的装置表面上，这是由于我们仅用异丙醇旋涂平坦PMMA基底而不旋涂上层的事实（图1A）。 1（a））。因此，异丙醇在粘合期间没有填充通道，而是仅作用于研磨板的未改性部分，其是支持粘合的那些4. 讨论在这项工作中，我们实现了一个微流控PMMA设备，并测试了其在直接捕获肿瘤细胞的流动功能该装置利用基于三个步骤的智能和灵活的过程：①使用结合了fs激光和机械微铣削技术的混合微制造平台制造微流体网络;②使用简单且低成本的热和溶剂辅助键合方法组装和密封装置;以及③获得的微通道的流入和芯片上功能化采用这种方法可以很容易地为许多不同的应用原型设备。这项工作中提出的设备可以在许多有趣的环境中使用，因为它不仅是一个有价值的工具，用于简单的细胞研究，而且如果嵌入到更复杂的设置中，也可以用于现场诊断事实上，整个平台有可能在不久的将来被转移到便携式系统中，通过与光学系统的适当集成来提供高像素密度、更快的聚焦和图像稳定[44]。这种混合微制造平台受益于com-结合了两种先进的制造技术--超快激光和机械微铣削--这两种技术都非常灵活，特别适合于定制LoC的快速原型制作。由于它是一种非接触技术，fs激光烧蚀允许制造复杂的几何特征，对周围材料的附带损伤可以忽略不计;此外，由于可以将激光辐射聚焦在衍射限制点中，因此它提供了微米精度。此外，机械微铣削的使用使得可以显著减少处理时间，特别是当制造大的和/或简单的特征（例如，孔），不需要高精度。微流体芯片中的入口和出口的主要缺点之一是，在不依赖于添加鲁尔接头、胶水或用于避免泄漏连接的其他策略的情况下完美地密封管通常是具有挑战性的，这可能影响显微镜观察。在我们的案例中，我们通过定制微铣孔，内部穿孔，使得圆柱形孔驱动毛细管连接，而不需要任何额外的密封。这两种技术的结合使得有可能克服其他技术的限制，更常用的快速原型的LoC。事实上，与软光刻不同，所提出的方法适用于任何类型的材料，并且不需要模具;因此，它在原型阶段提供了更大的灵活性此外，使用这种方法可以获得比3D打印更精确的结构，同时保持短的制造时间。我们还描述了一种简单且值得注意的低成本粘合方法，该方法不需要胶水或额外的垫圈，并且不是具有侵蚀性溶剂或温度的破坏性过程。选择PMMA作为构建整个装置的材料由于其低成本而受到强烈关注，这使得其特别适合于工业开发。相对于其他A. 沃尔普大学Krishnan，M.S.Chiriachteet al.工程7（2021）14341439图六、用PBS洗涤后具有封闭的OECM-1细胞的PMMA微通道的显微图像大量细胞被捕获在通道的内表面上，如（a）和（b）中沿着通道的直线部分的红色箭头所示在（c）中，报道了（b）的更高放大倍数（d）蛇形环中的细胞;（c、e和f）（b）中报告的通道放大区域。已经用于制造微流体装置的聚合物（例如，PMMA更硬，这确保了微流体网络的更好的一个不可忽视的方面是PMMA的生物相容性，这允许实现从LoC[45]到假体制造[46]的生物应用工具。此外，在整个制造过程中保持了该器件的完全透明性，允许在多步骤过程中完美对准和实时监控实验。这一特性对于检查通道的正确填充和在显微镜镜头下进行实验的所有步骤至关重要。作为概念验证，我们使用组装的装置作为CTC检测的工具血液中的CTC数量是高度可变的，取决于肿瘤的阶段和侵袭性;然而，在早期阶段检测它们被认为是临床医生决策的关键因素这种分析属于液体活检，其目的是开发越来越少的侵入性分析方法，并提高患者为了创建用于CTC检测的工具，我们通过快速成型方法实现了微流体通道，并用抗EpCAM抗体对其进行功能化，所述抗体可以结合在大多数上皮恶性组织表面上高度表达的膜蛋白[47]。公认的EpCAM抗原在细胞-细胞粘附强度和组织可塑性中具有调节功能它被认为是研究上皮细胞、癌症诊断和预测疾病进展的有用工具[43]。能够以无标记的方式鉴定CTC将是液体活检领域的巨大成就，因为细胞的分离/计数目前需要源自细胞组学的复杂分析，基于庞大且昂贵的仪器以及用于样品富集和标记的各种步骤[48]。在本研究中，我们使用微流体方法从OECM-1细胞培养基的加标悬浮液中官能化和捕获人口腔鳞状癌细胞，并由于固定化抗体的存在而实现阳性选择方法如所预期的，血液来源的Jurkat细胞流过蛇形通道而不被捕获抗体识别，所述捕获抗体只能结合癌细胞。的起始体积我们的样品为5mL，这表明我们的装置（其容纳总体积为2μL）可用于稀释溶液的富集和浓缩。这一发现具有很高的影响力在液体活组织检查领域中，预期CTC存在于因为能够在小体积或空间内收集这些细胞使得可以获得用于进一步分析的一致的生物材料。此外，原则上，可以定制微流体装置的架构，以允许例如针对更多数量的通道进行差异化功能化，以便鉴定几种膜生物标志物的表达;然后可以组织结果，以便匹配来自不同通道的更大量的信息。5. 结论本文描述了一种用于捕获CTC的智能和可定制的塑料LoC该设备创新性地结合了高精度fs激光烧蚀、易于使用的机械微铣削和用于PMMA基底的节省成本的溶剂辅助密封方法，从而确保了微流控分析的可靠性此外，由于入口孔和出口孔的特定设计，该工具便于外部微流体连接，该优化的方法产生了完全透明的工具，其适合于直接光学研究和蛇形通道的专用生物功能化，目的是以完全无标记的方式从生物样品中选择性地捕获和富集肿瘤移动电话、平板电脑或低成本互补致谢这项工作得到了SMILE（一种用于口腔癌早期检测的SAW-MIP集成设备）项目的支持，该项目是ATTRACT计划的一部分作者工作计划和设计：AV、MSC、EP、AA和FF;实验活动：AV、UK、MSC和FF;负责实验设置：AA和FF;研究实施、主要概念和证明大纲：MSC和FF;结果分析：A. 沃尔普大学Krishnan，M.S.Chiriachteet al.工程7（2021）14341440MSC、EP和FF;手稿撰写：AV、MSC和FF;手稿修订：AV、UK、MSC、EP、AA和FF;项目主管和资助职责：MSC和FF。遵守道德操守准则Annalisa Volpe、Udith Krishnan、Maria Serena Chiriachte、Elisabetta Primiceri、Antonio Ancona和Francesco Ferrara声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] Cao L ， Cui X ， Hu J ， Li Z ， Choi JR ， Yang Q ， et al. 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