文章人类胰腺癌类器官中的药物筛选和基因组编辑确定了药物-基因相互作用和标签外治疗图形摘要亮点d从31个遗传上不同的人PDAC类器官系dARID 1A中的错义突变增加PDAC对达司替尼和VE-821d自动药物筛选识别有效杀死PDAC类器官d依米丁和哇巴因干扰PDAC细胞对缺氧作者克里斯蒂安·K希尔特Booij，Linda Grob，.我是安娜·克鲁伊夫·胡里奥，朱莉娅·舒赫尔，杰拉尔德·施万克对应schwank@pharma.uzh.ch简言之Hirt等人建立了人类PDAC类器官生物库，以研究药物-基因相互作用并进行高通量药物筛选。使用全自动类器官筛选管道，他们进行了包括1，172种药物的药物再利用筛选。在体内验证的命中包括emeldine和哇巴因，小分子批准用于非癌症适应症。功能研究表明，这两种化合物通过干扰PDAC细胞对缺氧的反应能力来杀死PDAC细胞。Hirt等人，2022，细胞基因组学2，1000952022年2月9日-作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100095会会开放获取文章人类胰腺癌类器官中的药物筛选和基因组编辑确定了药物-基因相互作用和标签外治疗的候选者克里斯蒂安·K希尔特，1，2蒂门H。布伊，3琳达格罗布，3，4帕特里克西姆勒，1，2诺拉C。图森特，3，4大卫凯勒，3多琳陶贝，1瓦妮莎路德维希，1亚历山大戈里亚奇金，1尚塔尔保利，5丹妮拉朗根哈格，5丹尼尔J。Stekhoven，3，4克里斯蒂安大学Stirnimann，3KatharinaEndhardt，5FemkeRingnalda，1LukasVilliger，1，2AlexanderSiebenhu€ner，6SofiaKarkampouna，7，8MartaDeMenna，7，8JanetteBeshay，9HagenKlett，9MariannaKruithof-deJulio，7，8JuliaSchu€ler，9and Gerald Schwank1，2，10，*1瑞士苏黎世联邦理工学院分子健康科学研究所2瑞士苏黎世大学药理学和毒理学研究所3瑞士苏黎世联邦理工学院NEXUS个性化健康技术4SIB瑞士生物信息学研究所，瑞士5瑞士苏黎世大学医院病理学和分子病理学系6瑞士苏黎世大学医院综合癌症中心7瑞士伯尔尼大学泌尿学研究实验室生物医学研究部8瑞士伯尔尼大学医院Inselspital泌尿科9Discovery Services，Oncotest，Charles River，Freiburg，德国10引线触点* 通讯地址：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100095schwank@pharma.uzh.ch总结胰腺癌（PDAC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，迫切需要确定新的治疗方法在这里，我们建立了一个人类PDAC类器官生物库，从31个遗传上不同的线，涵盖了肿瘤亚型的代表性范围，并证明这些反映了原发性PDAC组织的分子和表型异质性我们使用CRISPR-Cas9基因组编辑和药物筛选来表征与ARID 1A和BRCA 2的药物-基因相互作用。我们发现PDAC驱动基因ARID 1A中的错义突变（而非移码突变）与激酶抑制剂达沙替尼（p <0.0001）和VE-821（p <0.0001）的敏感性增加相关我们进一步对1，172种FDA批准的化合物进行了自动化药物再利用筛选，确定了26种有效杀死PDAC类器官的化合物，包括目前批准用于其他癌症类型的19种化疗药物我们验证了这些化合物在体外和体内的活性。体内验证的命中包括emphetrin和哇巴因，这些化合物被批准用于非癌症适应症，并干扰PDAC类器官对缺氧反应的能力。我们的研究为推进精确肿瘤学和通过肿瘤类器官生物库中的基因组编辑和药物筛选确定药物再利用的候选者提供了概念验证。介绍胰腺导管腺癌（PDAC）是胰腺中最常见的肿瘤，5年生存率为10%，是所有癌症中最致命的一虽然最近在胰腺癌的临床前和临床研究中取得的成功因此，手术切除仍然是PDAC的唯一治愈性疗法。2然而，大多数患者被诊断为晚期疾病状态，因此不适合手术。此外，在接受手术的患者中，超过80%的切除肿瘤在五年内复发。3PDAC的药物治疗主要基于联合化疗方案FOLFIRINOX（亚叶酸钙）。酸、5-FU、伊立替康和奥沙利铂）4或Gem-Abraxane（吉西他滨、白蛋白结合型紫杉醇）。5-7然而，对这两种化疗方案的反应相对较差，大多数患者迅速产生耐药性。8最近，一些临床试验研究了分子靶向药物对胰腺癌的益处，但迄今为止，只有EGFR抑制剂厄洛替尼显示出对总生存率的中度益处综合考虑，迫切需要更有效的药物来治疗PDAC。过去，大多数PDAC药物研究都是基于2D癌细胞系或患者来源的异种移植物（PDX）。然而，这两种模式都有相当大的缺点。虽然癌细胞系反映了适于在2D中生长的侵袭性肿瘤细胞的子集，并且仅很差地代表原发性癌症的天然异质性和表型，但是10，11体内PDX模型是劳动密集型的，并且药物的数量Cell Genomics2，100095，February 9，2022<$2022作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics2，100095，2022（图例见下页）Cell Genomics2，100095，2022年2月9日3文章会开放获取并且可以在这些系统中测试的药物组合是有限的。最近，已经建立了将PDAC组织生长为3D类器官的方案，这有可能弥合2D癌细胞系和PDX模型之间的差距。13，14胰腺类器官可以从恶性肿瘤中建立，并且它们密切反映了原发性肿瘤的表型异质性13，15最近的几项研究，更多，证明了癌症类器官和患者的药物反应之间的强相关性。16-20在这项研究中，我们建立了一个PDAC类器官生物库的31个遗传上不同的线，反映了PDAC的异质性，并涵盖了一系列的肿瘤亚型。为了能够筛选更多数量的化合物，我们开发了一种自动筛选管道，该管道采用集成的机器人筛选平台进行培养、药物递送和活力分析。我们测试了ARID 1A和BRCA 2的药物-基因相互作用，并进行了药物再利用筛选，以从1，172种FDA批准的药物库中发现有效化合物。我们鉴定了26个对PDAC类器官细胞株的生长具有有效抑制活性的化合物，并在体外和体内验证了这些化合物的生长抑制活性。我们的研究证明了使用遗传多样性类器官生物库系统地筛选大型化合物集并识别药物开发和再利用候选物的有效性。结果建立一个人类PDAC类器官生物库，重现患者为了生成胰腺癌的类器官生物库，我们从手术切除的标本和从最初在PDX模型中扩增的患者肿瘤组织建立了PDAC类器官系（分别为11和20系）。此外，我们还建立了健康的，即，来自切除的PDAC样本的周围组织和来自胰岛分离期间获得的胰腺组织的非癌性胰腺导管类器官系（分别为5和4条线）。类器官建立的过程改编自严格公布的方案。14，15从手术再灌注中产生KRAS突变PDAC类器官的效率为65%切除的原发性肿瘤组织和95%来自PDX-扩增的肿瘤组织（表S1）。与先前的研究一致，我们观察到PDAC类器官表型的高度多样性这些范围从由具有均匀核的单层上皮组成的囊性中空结构（类似于健康胰腺类器官）到具有多态核的致密多层小叶肿瘤结节（类似于间变性PDAC）（图1A）。重要的是，类金刚石表型与患者和异种移植物中原发性PDAC肿瘤的体内形态学强烈相关（图1A、S1A和S1B）。具有管状和大导管的分化更高的肿瘤产生具有薄上皮层的类器官，并且具有固体生长模式的低分化肿瘤产生具有多形性细胞的小叶类器官。在多次传代和重复皮下移植到小鼠中后，非特异性类器官表型保持稳定（图S1B和S1 C）。与表型异质性一致，我们还观察到PDAC预后标志物TP 53和SMAD 430 的表达差异（图1A）和生长因子依赖性测定的差异（图1B）;与需要信号传导分子Wnt、R-spondin、Noggin、EGF和TGF-β抑制剂A83-01生长的健康胰腺类器官不同，PDAC类器官的生长在很大程度上不依赖于这些因子。在14个测试的PDAC系中，12个可以在没有Wnt或EGF的情况下扩增，11个系可以在没有头蛋白的情况下扩增，5个系可以在没有R-Spondin的情况下扩增，并且没有一个系需要TGF-β抑制剂A83-01来生长（测试>6次传代）。最近的几项研究已经使用了使用批量RNA-seq的基因表达分析当我们对五个PDAC类肿瘤细胞系进行RNA-seq并应用高肿瘤细胞性分类系统时，我们发现两个细胞系与经典亚型相关，一个细胞系与基底样亚型相关，以及两个细胞总之，这些结果证实了原发性PDAC样本的异质性保留在PDAC类器官中，并表明我们的生物库涵盖了一系列不同的肿瘤亚型。为了接下来评估我们的生物库是否反映了在PDAC患者中观察到的预期突变谱，29，31鉴于我们没有收到所有PDAC样品的匹配正常组织，我们通过排除已知的人类多态性并过滤具有高或中等蛋白质影响的SNV和InDel来选择种系变体。正如预期的那样，在我们的类器官生物库中常见的PDAC肿瘤驱动基因的突变频率与以前的研究中发现的相似。图1.PDAC类器官生物库的表型和分子景观(A) 一个WT胰腺类器官系和几个PDAC类器官系的双视野图像和相应的HE、p53和SMAD 4染色对应显示来自患者或PDX组织体内表型。比例尺：100mm。(B) 在生长因子耗尽培养基中体外培养6代后不同PDAC和WT类器官系的生长因子依赖性。黑框=生长因子依赖性，灰框=生长因子非依赖性。(C) 基于RNA-seq谱（Spearman相关性）使用Puleo等人的分类系统将PDAC类器官分类为基底样或经典亚型2018. 29(D) 在我们的生物库的PDAC类器官系中观察到的PDAC驱动基因突变的概述（PDAC驱动基因的完整列表参见表S2）。来源于手术标本的PDAC类器官以棕色显示，来源于PDX细胞悬浮液的那些以紫色显示。指示以下突变：SNV（绿色）、InDel（紫色）、扩增（红色）和缺失（蓝色）。顶部的条形图描绘了每个样品中的改变数量，右侧的条形图描绘了生物库中每个基因的改变频率。另见图S1和表S1、S2、S3、S4和S5。4Cell Genomics2，100095，2022会开放获取文章一C D E图2.PDAC类器官和PDX模型中的药物反应相关(A) 用DMSO对照（上图）和标准PDAC药物吉西他滨（1mM）（下图）处理的PC02 PDAC类器官系的双视野图像(B) 配对的等基因PDAC类器官系和相应的单层细胞系（PC 02和PC 09）的药物应答特征经过测试的药物要么被FDA批准将活力归一化为溶剂对照（0.1%DMSO）和参考剂量1mM（红色=高灵敏度，蓝色=低灵敏度）。显示的数据是技术和生物学重复的平均值。(C) 用IOmM厄洛替尼处理的WT胰腺类器官系和PDAC类器官系的相对活力（与DMSO对照相比）两个独立实验的技术重复(D) 如（C）中所示的相同PDAC系的平均相对肿瘤体积，其作为PDX模型生长并用厄洛替尼处理（d =天，n = 5只小鼠/组）。(E) 使用Spearman等级相关性检验，在体外（在10mM剂量下的存活率%）和体内（达到200%肿瘤体积的天数）对厄洛替尼的药物反应的相关性参见图S2。基于PDAC患者测序的研究。我们在>60%的样本中检测到所有三种最常见的PDAC驱动基因（KRAS、CDKN 2A和TP 53）的突变，在80%的样本中检测到TGF-β/BMP的核心组分（ACVR1B、ACVR 2A、SMAD4和TGFBR 2）的突变，在40%的样本中检测到SWI/SNF染色质重塑复合物亚基（ARID 1A、ARID2、PBRM 1和SMARCA 4）的突变。与以前的PDAC研究类似，我们还观察到KRAS和BRAF突变、SWI/SNF亚基突变和TGF-β/BMP途径基因突变的互斥趋势。PDAC类器官中的药物敏感性不同于单层培养物，并且与异种移植模型相关。为了在我们的PDAC类器官系中实现高通量化合物筛选，我们建立了全自动化药物筛选平台。 重复先前的研究，我们发现类器官生长和药物反应在液体覆盖培养系统和标准基质胶圆顶中是相似的（图S2A和S6）。的然而，液体覆盖培养系统更适于筛选大量化合物，因此我们在研究中继续使用该筛选系统。在我们的优化方案中，我们将解离的类器官接种在具有补充基质胶的培养基的孔上，在药物存在下将它们扩增六天，并使用CellTiterGlo®3D测定进行生长和活力分析（图2A、S2B和S2 C）。为了首先测试类器官和常规2D癌细胞系之间的药物反应是否不同，我们从我们的生物库的两个PDAC类器官系产生单层细胞培养物，并用一组40种药物处理培养物，所述药物被FDA批准或在PDAC的临床试验中（图S2D和表S6）。证实培养环境对药物反应具有强烈影响，并支持我们的假设，即与先前的2D药物筛选相比，类器官中的药物筛选可能导致鉴定出一组不同的化合物，我们发现反应谱通过培养条件（2D与3D）而不是遗传背景聚类（图2B）。BCell Genomics2，100095，2022年2月9日5文章会开放获取APC01PC11PC04PC02 PC03 PC29 PC28PC01ARID1A-/-PC11ARID1A-/-PC04ARID1A-/-PC28ARID1A-/-PC30PC30ARID1A-/-PC29ARID1A-/-BARID1A Wildtype ARID1A SNV ARID1A del ARID1A Engineered DelARID1A- 肌动蛋白PC04PC01PC11PC28PC29PC30PC02PC03PC11ARID1A-/-PC01ARID1A-/-PC04ARID1A-/-PC28ARID1A-/-PC29ARID1A-/-PC30ARID1A-/-250kDa42kDaC100500D0 1 10100浓度[μM]PC01PC01PC04PC11PC02PC03PC28PC29100500VE-8210 10 1001000浓度[μM]PC01PC04PC11PC02PC03PC28PC29PC0110050001 10100PC04PC11PC01ARID1A-/-PC04ARID1A-/-PC11ARID1A-/-1005000101001000PC04PC11PC01ARID1A-/-PC04ARID1A-/-PC11ARID1A-/-E100500浓度[μM]0 1 10100浓度[μM]PC28PC29PC30PC28ARID1A-/-PC29ARID1A-/-PC30ARID1A-/-100500浓度[μM]0 10 1001000浓度[uM]PC28PC29PC30PC28ARID1A-/-PC29ARID1A-/-PC30ARID1A-/-DasatinibDasatinibVE-821VE-821Dasatinib活力[%]活力[%]ARID1A_eng活力[%]野生型ARID1A_mutN.S.p 0.0001p 0.0001P=0.02错义Indel重活力[%]活力[%]活力[%]p 0.0001N.S.p 0.0001错义IndelP=0.02重6Cell Genomics2，100095，2022会开放获取文章我们接下来评估了3D类器官中的药物反应是否预测体内药物反应，并比较了EGF抑制剂厄洛替尼在作为类器官和PDX模型生长的七个PDAC样品如PDAC患者的临床研究所预期的，9我们观察到不同PDAC样品之间厄洛替尼应答的高变异性（图2C和2D）。然而，在体外和体内处理的等基因PDAC系内观察到强相关性（p 0.05，Spear-man这些结果与先前的研究一致，这些研究表明类器官中的药物反应可预测异种移植模型和患者中的体内16，17，18-然而，在该小数据集中，与3D类器官相比，2D细胞系在预测体内厄洛替尼反应方面不太准确（图S2E）。在PDAC-类器官中绘制药物-基因相互作用与批准药物的相互作用已被报告为在PDAC中报告为反复突变的一些基因。ARID 1A编码SWI/SNF染色质重塑复合物的亚基，并且在卵巢透明细胞癌中经常突变，其中其显示与酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼和ATR-抑制剂VE-821的合成致死相互作用。35，36为了评估ARID1A中的突变是否也导致PDAC中对达沙替尼和VE-821的更高敏感性，我们比较了两种药物在PDAC类器官系野生型（WT）或ARID 1A突变体中的功效（图3A）。我们测试了三个WT系的ARID1A，两个系具有移码突变，其中蛋白质表达不存在，三个系具有错义突变，其中蛋白质表达保留（图3B）。有趣的是，我们在具有错义突变的PDAC类器官系中观察到两种药物的更高敏感性，但在具有移码突变的PDAC类器官系中没有观察到，这表明药物-基因相互作用需要功能异常的ARID 1A蛋白的表达（图3C）。为了进一步研究该假设，我们使用CRIPSR-Cas9来工程化ARID 1A的外显子1中的移码突变（图3C和3D）。与我们的假设一致，我们没有观察到在最初对于ARID1A为WT的细胞系中药物敏感性的增加，但是在最初在ARID1A中具有错义突变的三个类器官细胞系中敏感性的显著降低（图1A和1B）3D和3E）。综上所述，这些结果表明，在PDAC中，ARID 1A与达沙替尼和VE-821的药物-基因相互作用仅限于错义突变，ARID1A的故障被保留。BRCA2编码参与DNA双链断裂修复的蛋白质，其失活导致同源重组缺陷（HRD）肿瘤。37BRCA2在PDAC以及卵巢癌和乳腺癌中经常突变，其中它显示与PARP抑制剂（PARPi）的合成致死相互作用。最近的临床研究表明，BRCA突变的PDAC患者也可能从PARPi治疗中获益，40促使我们评估有和没有BRCA突变的PDAC类器官对PARP抑制剂的反应性。我们选择了三个用于BRCA的WT系，三个在BRCA 2中具有种系或体细胞突变的系，并且另外使用CRISPR-Cas9来工程化两个BRCA 2基因表达缺失的敲除系（图S3A和S3 B）。当我们首次用奥沙利铂（一种在具有生殖系BRCA突变的患者中显示出更高活性的铂基化合物）处理类器官时，41我们观察到BRCA 2突变系中敏感性增加的轻微趋 势 （ 图 S3C ） 。 然 而 ， 当 我 们 接 下 来 用 PARP 抑 制 剂veliparib、olaparib和talazoparib处理类器官系时，未发现基于BRCA 2突变状态的药物应答的显著差异（图S3C）。这些结果可 以 用 BRCA WT PDAC 类 器 官 中 的 HR 缺 陷 来 解 释 ， 因 为COSMIC突变特征的分析也显示这些肿瘤中高水平的HRD相关特征3（图S3D）。此外，它们与最近的临床研究一致，这些研究表明相当大比例的BRCAWT患者可以从PARPi治疗中获益。38类器官中的全自动高通量药物筛选可识别新的标签外化合物先前发表的类器官中的药物筛选已经用小至中等大小的化合物锂进行。16、17、20、21、23-使用这种方法，我们对FDA批准的1，172种药物进行了药物再用途筛选，这些药物用于各种不同的医学适应症，包括癌症，感染，炎症，心血管疾病或神经疾病图3.PDAC类器官中ARID 1A药物-基因相互作用的评估(A) ARID 1A的PDAC类器官WT（上图）、ARID 1A的突变体（中图）以及通过CRISPR-Cas9工程化以成为ARID 1A的突变体（下图）的表型。虽然PC28和PC30中的ARID1A突变是复发性肿瘤驱动突变（cBioPortal数据库），但PC29中的突变尚未在泛癌症或PDAC研究中报道（cBioPortal数据库），或作为健康人群中的SNP（dbSNP，NCBI数据库）。比例尺：100mm。(B) 蛋白质印迹显示ARID 1A和b-肌动蛋白表达。(C) 真正的ARID 1A突变体类器官（黄色、红色）和ARID 1A-WT类器官（黑色）对达沙替尼（左图）和VE-821（右图）的响应曲线。将活力归一化至溶剂对照（0.1%DMSO）。数据表示为基于技术和生物学重复的平均值±(D) ARID1A-WT类器官（实线）和CRISPR-Cas9工程化的ARID 1A突变体类器官（虚线）对达沙替尼（左图）和VE-1的响应曲线821（右侧面板）。将活力归一化至溶剂对照（0.1%DMSO）。针对ARID 1A-WT类器官绘制的数据来源于如C中所示的相同实验。数据表示为基于技术和生物学重复的平均值± SD。(E) 在最初含有错义突变的三个类器官系中引入ARID 1A移码突变对达沙替尼（左图）和VE-821（右图）治疗。通过将每个剂量相对于DMSO处理的对照归一化来计算活力 针对ARID 1A-错义类器官绘制的数据来源于如（C）中所示的相同实验。数据表示为基于技术和生物学重复的平均值± SD。参见图S3。使用双因素ANOVA计算指定的p值，比较指定样品的药物反应会开放获取文章Cell Genomics2，100095，2022年2月9日7一BCD图4.PDAC类器官中的高通量药物筛选(A) 全自动筛选管道的图示，该管道能够实现水凝胶包被、类器官细胞接种、药物递送和384孔格式的测定读数(B) 关于适应症的1，172种 FDA批准的化合物的库组成(C) 阳性和阴性对照品的归一化信号（上图）以及每个试验平板的Z 0因子的可视化（中图）和汇总统计量（下图）。(D) 突出显示已识别命中的火山图水平线对应于FDR = 0.01，两条垂直线表示0.5的活力变化选择命中以具有FDR 0.01和效应量> 0.5。另见图S4和表S6。疾病（图4B）。我们用1 mM的单剂量筛选了一个PDAC样品的两个不同的类器官选择该浓度是因为在商业PDAC细胞系中，FDA批准的药物的IC50值通常在1-10 mM之间证实了我们筛选测定的高质量，我们获得了8个筛选板中7个的高于0.5的Z-prime（Z0）因子，剩余板的Z0因子为0.47（图4C、S4C和S4 D）。使用0.5的效应量（ES）阈值和0.01的FDR阈值，我们鉴定了26种命中化合物（图4D和表S7）。在有效药物的列表中是标准PDAC化疗化合物紫杉醇和吉西他滨，但不是5-FU，其在PDAC类器官中仅在较高剂量下有活性（图S5A）。其中19个是目前批准用于其他癌症类型的化疗药物，包括嘧啶类似物以及微管、端粒酶、拓扑异构酶和蛋白酶体抑制剂。其中五种是目前尚未被批准为抗癌药物的化合物：强心苷哇巴因，抗原生动物药物Emulsion、防腐剂药物氯化十六烷基吡啶和驱虫药氟苯达唑和奥苯达唑。Ex体内和在体内验证的筛选命中为了验证我们的筛选命中，我们在一组10个人PDAC类器官系、4个健康胰腺类器官系、3个衍生自PDAC类器官的PDAC单层细胞系和2个市售PDAC单层细胞系（ASPC-1、PANC-1）上测试了26个鉴定的命中。虽然26种化合物中的22种在大多数PDAC类器官系中是有效的，但大多数化合物在2D癌细胞系中没有活性（效应量0.5;图 5A、S5B和S5 C）。进一步验证我们的命中，当PDAC类器官在经典的3D液滴培养系统中生长时，我们观察到类似的药物反应（ρ值为0.65- 0.89;图S6此外，一个子集的命中也有效地杀死来自转移性肝脏的会开放获取文章8Cell Genomics2，100095，2022A BC D图5.筛选命中的体外和体内验证(A) 指示市售2D PDAC细胞系、PDAC类器官衍生单层系、WT胰腺类器官和PDAC类器官的药物反应的热图从红色到蓝色的颜色表示与溶剂（0.1%DMSO）对照相比的标准化[%]以1 mM的剂量筛选活力（红色=高灵敏度，蓝色=低灵敏度）。数据表示为基于技术和生物学重复的平均值。(B) 不同细胞系根据其药物反应谱的无监督聚类（绿色：WT胰腺类器官系;红色：PDAC类器官系;橙色：2D PDAC细胞系）。(C) 生长曲线表示使用PC 02-PDX模型（n = 4-5只小鼠/组）在21天的过程中相对肿瘤的增加。使用双因素ANOVA和Dunnett事后检验计算所示的统计学显著性。(D) 不同组治疗期结束时的相对肿瘤体积数据点代表实验中使用的个体小鼠使用单因素ANOVA和Dunnett事后检验计算所示的另见图S5、S6和表S7。这些化合物在治疗PDAC转移瘤方面也具有潜力（图S6D和S6E），表明这些化合物也具有治疗PDAC转移瘤的潜力。由于类器官也可以从健康的胰腺导管建立，我们接下来评估了我们的命中是否显示出不同的功效，PDAC类器官比较WT类器官。然而，分层聚类和相关性分析并未导致两组的明确分离（图5B），并且仅对于拓扑异构酶抑制剂拓扑替康、表吡鲁胺、米托蒽醌和会开放获取文章Cell Genomics2，100095，2022年2月9日9图6.哇巴因和恩替卡韦通过靶向HIF反应抑制PDAC类器官生长(A) WT胰腺和PDAC患者组织中HIF-1a靶基因表达的 44* 0.001; 使 用 Benjamini-Hochberg 校 正 的 配 对Wilcoxon秩和检验和多重检验。(B) PDAC 患 者 存 活 与 基 于 5 种 缺 氧 应 答 基 因（CAIX、SLC2A1、HK2、PKM、VEGFA）的log2平均表达的缺氧基因表达特征排除了TCGA-PAAD队列的错误分类样本，分析中仅包括150个正确分类的PDAC45(C) 通过qPCR测量的相对于管家基因TBP的CAIX和VEGFA表达。将等基因PDAC系作为单层培养物（n = 4）、类器官培养物（n = 3）或PDX模型（n= 1）生长。(D) 通过qPCR在3种不同的人类患者类器官系中相对于溶剂对照组（DMSO 0.1%）在依美替尼、哇巴因或卡非佐米处理后24小时的HIF-1α每个个体患者类器官系显示3个生物学重复* 0.001; Wilcoxon符号秩检验，使用Benjamini-Hoch- berg校正多重检验。参见图S7。在PDAC系中观察到替尼泊苷的效力更高（图5A）。这些结果是预期的，因为WT类器官持续增殖并且不类似于健康胰腺组织;因此，药物反应的差异仅预期用于靶向不依赖于细胞增殖的癌症特异性弱点的化合物。接下来，我们根据其作用机制将22个命中物分组，并每组选择一种化合物（8种药物）用于体内分析。通过生成体外剂量-反应曲线并考虑LD 50剂量（图S5C和表S7），我们设计了用于治疗以下疾病的个体药物给药计划：异种移植模型。皮下移植PC02 PDAC系，并且一旦肿瘤达到100mm3的尺寸，用化合物或对照媒介物处理小鼠21天（图5C和5D）。虽然测试的最有效的化合物是标准PDAC药物吉西他滨，与对照载体相比，导致肿瘤体积减少95%（p 0.001），但其他五种药物也显示肿瘤体积显著减少（卡非 唑 - mib-67.7% ， p = 0.02; 哇 巴 因 -58.5%，p= 0.001;多柔比星-57.9%，p =0.011;恩替卡韦-54.3%，p = 0.01;硫酸长春碱-54%，p = 0.028）。这些数据表明，从药物再利用筛选中验证的命中可能是有希望的候选人用于对标准化疗药物产生耐药性的PDAC患者的二线治疗依美汀和哇巴因减弱PDAC类器官中的HIF-1α反应虽然emlazone和哇巴因目前未被批准用于癌症治疗，但最近这两种化合物都显示出通过靶向低氧诱导因子（HIF）-1α活性而有效对抗慢性淋巴细胞白血病。42缺氧也是晚期PDAC的特征性特征43（图6A），并与总生存率降低相关（图6B），提示会开放获取文章10Cell Genomics2，100095，2022本研究旨在探讨恩替卡韦和哇巴因是否通过减弱HIF-1α活性而靶向PDAC细胞。我们首先评估了体内PDAC组织的缺氧状态是否在类器官培养物中保守，并比较了作为PDX、类器官或2D单层生长的两个等基因PDAC系中的HIF-1α靶基因表达。在常氧条件下（21%O2气氛），与经典单层细胞相比，CAIX和VEGFA确实在PDAC类器官中显著更高地表达（图6C）。与这些结果一致，用BAY-87（缺氧诱导的基因活化的已知抑制剂）处理特异性阻断3D PDAC类器官培养物中的生长，但不阻断相应的2D细胞系中的生长（图S7A）。重要的是，当我们在PDAC类器官和2D单层细胞系之间比较embrane和哇巴因的功效时，我们发现两种化合物的行为与BAY-87相似，并且与单层细胞系相比，更有效地阻断PDAC类器官中的细胞生长（图5A）。此外，它们导致药物治疗后24小时HIF-1α靶基因表达的显著下调（图6 D）。总之，这些结果支持了这样的假设，即emphaline和哇巴因通过干扰其适应缺氧的能力来抑制PDAC类器官的生长讨论2D癌细胞系已被过度用作PDAC的体外模型然而，虽然这些经典单层细胞系适合于高通量筛选，但从患者建立2D癌细胞系的成功率极低，46，47它们不能很好地反映原发性PDAC组织的异质性13，并且在预测药物疗效方面的潜力有限。虽然癌细胞系的一种有价值的替代品是PDX模型，但它们的成本非常高，因此不适合高通量药物筛选。在我们的研究中，我们建立了>30个遗传上不同的人PDAC类器官系的生物库。我们发现PDAC类器官与原发性PDAC组织中观察到的分子和表型异质性以及体内药物反应相关。这些数据与最近的几项研究一致，这些研究发现类器官，异种移植模型和患者之间的药物反应具有良好的相关性17由于类器官可进行体外操作，我们还将药物筛选与CRISPR-Cas9基因组编辑相结合，以研究频繁突变的PDAC驱动基因的药物-基因相互作用。分析ARID 1A，我们发现ARID 1A突变与达沙替尼和VE-821敏感性之间的正相关性-最初在卵巢癌中描述然而，我们的研究结果也表明，这种药物-基因相互作用严重依赖于突变类型;只有在ARID 1A中具有错义突变但不具有无义或移码突变的PDAC类器官系基于这些结果，我们推测，如果考虑到突变的类型，而不仅仅是肿瘤抑制基因突变的存在或不存在，那么对靶向药物有反应的患者的鉴定可能会后者目前是伞式试验的标准。49与之前专注于中小规模药物组的类器官筛选研究不同，16，17，20-研究涵盖了1,172种FDA批准的药物。在体内验证的命中中，有几种药物目前仅被批准用于非癌症适应症。这些包括emphetrin和哇巴因，我们可以证明它们通过干扰PDAC类器官对缺氧的反应能力来特异性杀死它们。有趣的是，当我们用恩替卡韦、哇巴因或BAY-87处理在缺氧条件下生长的2D PDAC细胞系时，我们观察到HIF-1 α报告基因活性的抑制，但细胞死亡没有增加（图S7因此，在3D类器官中进行药物筛选对于将这些化合物鉴定为命中物至关重要。依美汀已经在不同实体瘤的I期和II期临床试验中进行了测试5053，54在我们的研究中，我们在PDX小鼠模型中观察到剂量为2 mg/kg/d的PDAC的有效性根据异速生长比例，这相当于人体中的0.16 mg/kg，55相当于患者标准剂量的约16%。哇巴因是一种Na+/K+-ATP酶抑制剂，最近已显示其改变乳腺癌细胞系的侵袭此外，哇巴因使循环的乳腺癌细胞簇解离，导致减少转移形成。57我们发现，0.56 mg/kg/d的剂量显著降低了小鼠PDAC异种移植物的生长值得注意的是，由于哇巴因在人类细胞中的毒性低于在啮齿动物细胞中的毒性，因此难以将用哇巴因进行的小鼠异种移植研究的结果转化为人类。58然而，小鼠中使用的剂量相当于0.046 mg/kg的人体剂量，相当于临床研究中健康志愿者给药剂量的约54%。五十五，五十九该研究我们的研究有一定的局限性。首先，PDAC类肿瘤仅由癌细胞组成，不包括复杂的肿瘤微环境。这可能导致体外和体内药物反应之间的显著差异。建立更先进的类器官模型，其中肿瘤细胞与基质组分和免疫细胞群共培养，可能会改善对患者药物反应的预测。其次，我们的PDAC类器官生物库仅限于31个患者样本，因此不太常见的PDAC驱动基因仅在少数类器官系中突变。 这阻止了我们系统地将药物反应与更大的PDAC驱动突变集相关联。在未来，建立更广泛的癌症类器官生物库可以绕过这种限制。第三，资源的限制使我们无法用不同的药物浓度进行大规模的药物筛选，我们的筛选仅用1mM的单一化合物浓度进行。因此，具有较高IC50的一些化合物可能被遗漏，而具有较低IC50的其他化合物可能是由于筛选浓度下的毒性而导致的假阳性命中由于药物筛选的大部分费用是由使用Matrigel进行类器官生长引起的，因此可以容易地大规模生产的合成水凝胶的开发将显著降低成本，并促进在高通量药物筛选中使用多种化合物浓度。会开放获取文章Cell Genomics2，100095，2022年2月9日11总之，我们建立了一个涵盖不同肿瘤亚型的异质性人类PDAC类器官生物库。通过利用类器官系的遗传多样性和基因组编辑，我们能够分析药物-基因相互作用，这揭示了ARID 1A中的错义突变与对达沙替尼和VE-821的敏感性增加之间的关联。此外，用一组1，172种FDA批准的药物进行的高通量药物筛选鉴定了在类器官培养物中体外和在PDX模型中体内有效杀死PDAC细胞的几种化合物。在未来，测试这些化合物是否可以作为二线治疗应用于对标准疗法产生耐药性的PDAC患者将是有趣的。此外，我们用于高通量化合物筛选和测试药物-基因相互作用的方法也可以应用于其他肿瘤类型的类器官生物库，促进在多种癌症实体中开发靶向和个性化治疗。STAR+方法本文件的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：d关键资源表d资源可用性B电极导线触点B材料供应情况B数据和代码可用性d方法样本B人胰腺类器官系培养BsgRNA设计和慢病毒产生B类器官系B组织学染色B生长因子依赖性试验B下一代测序和分析（每个样品的分析：表S1）B实时定量PCRB蛋白质印迹分析B化合物B手动类器官药物筛选BFDA批准的化合物自动库筛选B自动筛选结果分析B单层培养物中的药物筛选B体内化合物测试BHIF-报告基因测定BTCGA生存分析B统计分析补充信息补 充 信 息 可 以 在 www.example.com 上 找 到 https://doi.org/10.1016/j 。xgen.2022.100095。致谢我们要感谢参与这项研究的患者和收集组织的医院团队。我们还要感谢Martina Hruzova、Till Ringel、Nina Frey和Sharan Janjuha提供的实验支持;Roger Meier（SCOPEM）在自动成像采集方面提供的帮助;Sus-anne Kreutzer（FGCZ）负责PDAC RNA和DNA样本处理; Michael Prummer（NEXUS）负责数据分析; Wilhelm Krek负责提供细胞系; Jatta Huotari负责对手稿进行评论; Eelco J. P. de Koning负责提供胰岛耗竭组织。这项工作由SNSF（160230）资助。C.H.拥有ETH（2018-423）个性化健康和相关技术（PHRT）倡议的过渡博士后奖学金。作者贡献C.K.H.和枪伤。设计了研究并撰写了论文，并听取了所有其他作者的意见。C.K.H.进行了实验和数据分析，G.S.监督研究的整体执行。D.T. V.L.，和A.G.在建立、培养、扩大和测试PDAC类器官系方面提供技术援助。P.S.执行和分析实验并准备图形。T.H.B. D.K.，和C.U.S.设计并执行了自动药物筛选，并为分析做出了贡献。C.P.，D. L.，K. E.，和A.S.之间提供病理学/肿瘤学专业知识。L.V. 和F.R.，建立了野生型胰腺类器官系。LG，DJ 北卡罗来纳州，及香港提供了生物信息学专门知识，并为分析作出了贡献。S.K.，M.D.M和M.K.J.提供了来自转移性PDAC类器官系的数据。J.B.和J.S.有助于体内研究的设计、实验和分析。申报利益Janette Beshay 、 Hagen Klett 和 Ju
