没有合适的资源?快使用搜索试试~ 我知道了~
工程16(2022)176研究微生物药理学-文章多组学指导下发现链霉菌1647产生的Omicsynins:对甲型流感病毒和冠状病毒HCoV-229 EHongmin Suna,b,#,Xingxing Lia,b,#,Minghua Chena,#,Ming Zhonga,c,Yihua Lia,b,Kun Wanga,c,YuDua,b,Xin Zhena,Rongmei Gaoa,c,Yexiang Wua,Yuanyang Shia,b,Liyan Yua,Yongsheng Chea,Yuhuan Lia,c,Xin Zhen a,姜建东a,c,刘文,洪斌a,b,刘文,司树义a,刘文a中国医学科学院北京协和医学院药物生物技术研究所抗生素生物技术国家重点实验室,北京100050b中国医学科学院北京协和医学院药物生物技术研究所中国医学科学院药物创新合成生物学重点实验室邮编:100050c中国医学科学院北京协和医学院药物生物技术研究所中国医学科学院抗病毒药物研究重点实验室,北京100050阿提奇莱因福奥文章历史记录:接收日期:2020年2021年5月6日修订2021年5月16日接受2021年6月26日在线提供保留字:多组学抗甲型流感病毒抗冠状病毒链霉菌1647假四肽A B S T R A C T许多微生物具有保护细胞免受病毒攻击的机制。对链霉菌的发酵成分进行了研究。1647显示有效抗甲型流感病毒(IAV)活性。该菌株于20世纪70年代从中国南方的土壤中分离出来,但其抗病毒物质的化学性质至今仍不清楚我们使用了一个综合的多组学策略,以确定抗病毒药从这个链霉菌。抗生素和次级代谢物分析外壳(antiSMASH)对其基因组序列的分析揭示了38个次级代谢物的生物合成基因簇(BGC),并且通过生物活性指导的比较转录组学分析将可能负责产生抗病毒组分的目标BGC缩小到3个BGC。通过生物信息学分析和对调控因子和生物合成基因的遗传操作,将簇36鉴定为负责抗病毒化合物生物合成的BGC基于生物活性的分子网络分析不同重组菌株的质谱数据表明,抗病毒化合物是一类结构类似物。最后,从发酵液中鉴定和/或分离了18种具有内部脲基连接的假四肽,即omicsynin A1其中,其中11个化合物为新化合物,分别为omicsyninA1、A2、A6、B1-B3、B5、B6、C1、C2和C6。奥米奇宁B1-B4 对IAV具有较强的抗病毒活性,其半数抑制浓度(IC 50)约为11 mol·L-1 ,选择性指数(SI)为100 ~ 300。OmicsyninsB1-通过整合多组学数据,我们发现了一些新的抗病毒假四肽链霉菌产生的。1647,表明微生物的次级代谢产物是新的抗病毒药物的有价值的来源©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。1. 介绍人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒*通讯作者。电 子 邮 件 地 址 : yuhuanlibj@126.com ( Y. Li ) , jiang. 163.com ( J.- D.Jiang),binhong69@hotmail.com(B. Hong),sisyimb@hotmail.com(S. Si)。#这些作者对这项工作做出了同样的(HBV)。然而,甲型流感病毒(IAV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及最近的SARS-CoV-2的爆发表明迫切需要有效对抗呼吸道RNA病毒的药物。这些病毒的感染通常以流感样症状为特征。它们通过气溶胶传播具有高度传染性,在无症状阶段传播,在症状出现之前有很长的潜伏期。这些病毒引起的流行病死亡率很高,特别是在老年人和https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.05.0102095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页:www.elsevier.com/locate/engH. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176177××已有的医疗条件。截至2021年4月30日,2019冠状病毒病(COVID-19)已在全球造成约1. 51亿例感染及超过318万例死亡[1]。针对呼吸道RNA病毒的新型抗病毒剂的发现是一个优先事项,但这是一项艰巨的任务。虽然一些抗病毒药物是通过合理设计和化学合成而开发的,但最初的发现往往是受到天然产物的启发。在进化过程中,许多微生物已经发展出不同的机制来对抗病毒和细菌。微生物的次级代谢产物是潜在抗病毒候选物的来源[2已知的16500种生物活性次级微生物代谢产物中约有10%表现出抗病毒活性[5]。例如,用于多种抗病毒治疗方案如IAV、HCV、登革热病毒和诺如病毒的核苷类似物rib- avirin(RBV)衍生自吡唑霉素,其分离自白色链霉菌NRRL 3601 [3,4,6]。阿糖腺苷是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的第一种抗病毒药物,用于抗系统性单纯疱疹病毒的抗病毒治疗,是从海绵Tethya crypta中分离出来的[4,7]。1967年从柠檬色链霉菌中分离出一种广谱抗病毒化合物Aristeromycin[8,9]。其他具有抗病毒活性的化合物,如福霉素、多球菌素和环孢菌素A,也来自微生物来源[3,4]。了解能够抑制病毒复制的抗病毒抗生素的生物合成机制可能有助于发现新的抗病毒药物。链霉菌 sp.1647分离自土壤样品,华南自20世纪70年代以来,其发酵液或提取物显示出优异的抗IAV活性然而,它的抗病毒化学成分直到最近仍然是一个谜。在这项研究中,我们描述了一个基于多组学的工作流程,包括基因组学,转录组学和代谢组学分析,用于确定抗病毒化合物,通过识别生物合成基因簇(BGC)负责其生产的菌株1647的基因组与传统的活性天然产物发现过程相比,这是发现由微生物产生的新型抗病毒候选物的有效方法本研究鉴定了一系列具有良好抗IAV和抗冠状病毒活性的新型拟四肽这些药物为开发新的抗病毒药物提供了潜在的先导化合物。2. 材料和方法2.1. 链霉菌1647的菌株、质粒和发酵培养物本研究中使用的所有菌株和质粒列于附录A的表S1中。将链霉菌属1647(中国药用菌种保藏中心编号CPCC 200451)及其衍生物在28 °C下在固体酵母麦芽葡萄糖(YMG)培养基(酵母提取物1.0%,麦芽提取物1.0%,葡萄糖1.0%,琼脂1.5%; pH 7.2)上生长以用于生长和种子培养。使用胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基(BD,USA)分离总DNA。A1、A2和A3培养基主要用作发酵培养基。这些发酵培养基的详细组分在附录A中的方法部分。大肠杆菌(E. 大肠杆菌DH5a是使用作为的一般克隆主持人,和E. 杆菌 ET12567/根据已建立的方案[10],将pUZ8002用于接合转移。2.2. 构建用于过表达或敲除相应基因pL 646[11],一种含有UC31噬菌体附着位点和整合酶基因(attP-int)的pSET 152[12]衍生质粒,组成型启动子ermE *p,通过双酶切和连接进行基因过表达。载体pOJ260[12]是链霉菌属中的非复制型载体,用于链霉菌属1647中的基因敲除。为了扩增生物合成基因,将约2.0 kb的两个上游和下游同源片段插入载体中以产生重组质粒。将重组质粒通过接合法导入链霉菌1647中。然后,在含有安普霉素的甘露醇大豆粉琼脂培养基[10]上筛选单交换突变体,并通过聚合酶链反应(PCR)分析进行确认。在不含安普霉素的甘露醇大豆粉培养基平板上继代培养5代后通过PCR、测序和定量逆转录PCR(qRT-PCR)确认正确的敲除突变体。2.3. 基于生物活性的分子网络链霉菌(Streptomycessp.)1647及其衍生物使用Sep-Pak C18固相萃取柱(Waters,USA)浓缩五次。使用Agilent 6510四极杆飞行时间(Q-TOF)LC-MS仪器以负全扫描模式收集上述样品的液相色谱-质谱umn,Capcell-Pak MG II C18柱(150 mm4.6 mm,5lm);流速:1.0 mL/min;溶剂A:乙腈;溶剂B:0.1%-咪咕酸(v/v)水溶液;线性梯度为5%30分钟,随后30%-95%A/B(v/v)30分钟;柱温,40 °C。使用全球天然产物社会(GNPS)分子网络数据库分析液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据,并使用Cytoscape软件对结果进行可视化和分析[13]。2.4. 活性成分的分离与鉴定链霉菌1647收集链霉菌1647菌株发酵液的上清液,并通过大孔吸附树脂(Diaion HP 20; Mitsubishi,Japan)吸附。然后用两倍柱体积的去离子水冲洗柱分别用20%、50%和100%乙醇-水(v/v)进行梯度洗脱。洗脱各梯度,直至流出液无色,并分别指定为粗提取物20E、50 E和100 E。分别收集每个梯度的洗脱液,通过蒸发浓缩,并冻干。十八烷基甲硅烷基硅胶(ODS-A-HG; YMC,日本)用于开放柱色谱法以进行冻干生物活性收集物的进一步分离。在AgilentG6500 Q-TOF 系 列 ( Agilent Technologies , USA ) 或 WatersXevo系列(Waters,USA)上进行高分辨率电喷雾电离质谱(HR-ESI-MS)反相高效液相色谱(RP-HPLC)半制备使 用 五 氟 苯 基 柱 ( Capcell-Pak PFP;250 mm 10 mm , 5 μm;Shiseido,日本)进行。详细描述了通过一系列方法鉴定化合物的方法,一维(1D)和二维(2D)核磁共振(NMR)分析见附录A。所用引物列于附录A的表S2中。获得将目的基因插入到载体中,yhttp://gnps.ucsd.eduH. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176178×2.5. 用于测量抗病毒活性2.5.1. 病毒、细胞和感染流感病毒株A/Fort Monmouth/1/1947(H1N1)获自美国典型培养 物 保 藏 中 心 ( ATCC , USA ) 。 临 床 分 离 的 IAV 毒 株A/tianjinjinnan/15/2009 ( H1N1 , 奥 司 他 韦 抗 性 ) 和A/wuhan/359/1995(H3 N2)由中国疾病预防控制中心国家病毒病预防控制所的Yuelong Shu教授冠状病毒HCoV-229 E(VR-740)由ATCC提供,HCoV-OC 43(VR-1558)由Dr. 中国首都医科大学附属北京地坛医院赵学森人副流感病毒3型(HPIV-3,C- 243株)和呼吸道合胞病毒(RSV,Long株)从ATCC获得。Madin–Darby canine人肝癌Huh7.5、人宫颈Hela和Hep2细胞保存在我们的实验室中。在MDCK细胞中进行抗IAV的抗病毒测定用补充有2μg/mlL-1甲苯磺酰的维持培养基苯丙氨氯甲基酮(TPCK)处理胰蛋白(Worthington,USA)和0.08%牛血清白蛋白(BSA; Yuan HengSheng Ma Biotech,China)。IAV H3N2,如果没有特别提及,则在整个抗IAV研究中使用。在Huh7.5(HCoV-229 E)、C3 A(HCoV-0C43)、Hela(HPIV-3)和Hep 2(RSV)细胞中进行针对其他病毒的抗病毒测定,并在维持培养基中补充2%胎牛血清。2.5.2. 细胞病变抑制法如前所述,通过细胞病变效应(CPE)抑制测定法检查化合物对IAV、HCoV-229 E、HPIV-3和RSV的抑制活性[14]。简而言之,在37 °C下过夜接种在板中的细胞被病毒感染以100倍50%组织培养感染剂量( TCID50)作用2h(for HCoV-229 E,同时加入测试化合物),然后用测试化合物处理48或72小时。 通过Reed和Muench方法测定50%抑制浓度(IC50)[15]。用CPE法测定了供试品和阳性化合物的半数毒性浓度(TC50)。选择性指数(SI)计算为TC50/IC50的比率。2.5.3. qRT-PCR试验使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Germany)根据制造商的说明提取感染细胞的总RNA。使用ABI 7500快速实时PCR系统(AppliedBiosystems,USA),使用TransScript II Green One-Step qRT-PCRSuperMix(TransGen Biotech,China)进行qRT-PCR[16]。所用引物列于表S2中。2.5.4. 蛋白质印迹测定为了分析病毒蛋白,使用哺乳动物蛋白提取试剂(M-PER; ThermoFisher Scientific,USA)和HaltTM蛋白酶抑制剂一次性混合物提取细胞蛋白。b-肌动蛋白的免疫印迹(抗体目录号3700 S; 1:5000; Cell Signaling Technology,USA)和IAV聚-如前所述[16]进行酸性(PA)蛋白(抗体目录号GTX 118991; 1:1000; GeneTex,USA)。2.5.5. 添加时间测定如前所述[17]进行添加时间实验,但进行了一些修改。简言之,MDCK细胞在指定的时间点加入培养基中。在病毒感染后12小时收获细胞免疫印迹法检测IAV PA蛋白,CPE法检测IAV滴度2.6. 统计分析来自抗病毒活性测定和qRT-PCR的数据表示为平均值±标准差(SD)。通过双尾Student t检验或单因素方差分析(ANOVA),随后进行Dunnett校正(如适用)(GraphPad Prism软件; GraphPadSoftware,USA)进行组间的统计分析3. 结果3.1. 基因组序列的生物信息学分析和活性导向的比较转录组学分析链霉菌属1647的发酵液和粗提物对不同的IAV株具有活性,包括H3N2、H1N1和H2N2。抗奥司他韦H1n1(附录A表S3)。为了揭开抗病毒化合物结构的神秘面纱,设计了一种多组学指导的策略,该策略不同于传统的发现活性化合物的方法。首先分析生产菌株的基因组序列(附录A中的方法部分)。链霉菌1647的基因组是一条长约8.9 × 103kb的线性染色体,GC含 量 为 73.6% 。 使 用 抗 生 素 和 次 级 代 谢 物 分 析 外 壳 版 本 5.0.0(antiSMASH 5.0.0)在线工具分析基因组序列,这表明其含有38个推定的用于产生次级代谢物的BGC进行了比较转录组分析(附录A中的方法部分),以初步定位链霉菌1647中负责抗病毒活性化合物生物合成的BGC。通过对14种发酵培养基的筛选,确定A3为高活性发酵培养基,B7为非活性发酵培养基。在发酵的早期阶段(24、48和72小时)收集来自这两种培养基的菌丝体和发酵上清液以进行转录组测序(RNA-seq)(图1(a))。结合通过antiSMASH预测的38种次级代谢物BGC的信息,三种BGC-即簇27、28和36-在A3发酵条件下显示出显著更高的转录水平(图1A和1B)。1(b)-(d))。通过qRT-PCR进一步验证转录组学结果(图1A和1B)。附录A中的S1(a)-(c))。基于生物信息学分析,发现簇27和28都是用于产生铁载体的BGC,因为簇中铁盒序列的存在(其受到链霉菌中一类阻遏物的密切调节)感知到Fe3+的存在[18,19]。转录组分析表明,在向A3发酵培养基中加入足够量的Fe 3+(0.05%终浓度)后,簇27和28被关闭,而簇36仍然高度表达(图1A和1B)。1(e)-(g))。 这通过qRT-PCR验证(图1A和1B)。附录A中S1(d)-(f))。活性测定结果表明,链霉菌Streptomyces sp.1647发酵液在Fe3+存在下仍显示出相似水平的抗IAV活性(表S3)。因此,我们推测簇36是链霉菌中负责抗病毒活性化合物生物合成的BGC。1647年接种IAV 2 h。 将培养基IAV感染后2 h更换添加测试化合物http://antismash.secondarymetabolites.orgH. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176179Fig. 1. 链霉菌1647在不同发酵条件下的转录组比对。在发酵的早期阶段(分别为24、48和72小时)收集来自两种培养基(A3和B7)的野生型(WT)菌株的菌丝体用于提取总RNA;(a)-(d)然后对这六个样品进行RNA-seq。(e)–(g) 在A3和A3 + Fe3+(FeCl3添加至终浓度为0.05%)培养的1647中,在48 h收集培养基用于总RNA的提取和RNA-seq分析。(a)全基因组转录组比对;(b)第27簇转录组比对;(c)第28簇转录组比对(d)在第36簇的转录组比对中,(e)在Fe3+存在下的第27簇的基因转录水平,(f)在Fe3+存在下的第28簇的基因转录水平;(g)在Fe3+存在下,第36簇基因的转录水平。来自A3介质的排列显示为蓝色峰,来自B7和A3 +Fe3+介质的排列显示为黑色峰。3.2. BGC用于抗病毒活性化合物生物合成的确认如 antiSMASH 5.0.0 所 预 测 的 , 簇 36 包 含 50 个开 放 阅 读 框(ORF )和一些非核糖体肽合酶(NRPS )基因(图11 )。 2(a))。为了初步评估簇36在链霉菌1647中抗病毒代谢物生物合成中的作用,我们进行了位于该簇中的多个调控基因的过表达。选择了该簇中NRPS基因附近的5个调节基因,即7081(TetR家族)、7082(抗生素调节蛋白(SARP)家族)、7083(ArsR家族)、7089(LysR家族)和7102(TetR家族),结果显示,只有基因7102的过表达引起抗IAV活性的增加(图1B)。 2(b)和图附录A中S2(a)-(d))。由RNA-seq数据显示的野生型(WT)菌株和基因7102过表达菌株之间的簇36的基因表达变化表明基因7102的过表达确实引起簇36的NRPS核心区中基因7092通过qRT-PCR证实了这一发现(附录A中的图S2(e))。基因7092在此结果之后,敲除核心中的NRPS基因7098,通过框内缺失对簇36的区域进行修饰。将7098基因导入突变株7098-KO中,以避免极性效应,获得遗传互补菌株的删除。通过qRT-PCR检测簇36的核心区的基因表达水平(图1B)。抗病毒活性试验(图2(e))表明,基因7098的失活导致抗流感病毒活性的丧失,而该基因的互补可以恢复抗病毒活性。LC-MS分析(图1B)。 2(f))表明,一系列保留时间为14-23 min和31- 25min的化合物在这些菌株的发酵提取物中的保留时间分别为14-23min和31- 25 min。42 min在敲除突变株7098-KO中消失,然后在互补株7098-KOC中重新出现。这些结果表明,簇36的核心NRPS区域负责链霉菌产生的抗IAV1647年在这项研究中,Maxson等人报告了负责脱亚氨基抗疼痛的簇。[20]使用基于化学反应性的筛选。这与簇36的核心区域高度同源。这些数据表明,抗IAV的活性剂可能是与脱亚氨基抗痛剂相比具有不同后修饰的寡肽。3.3. 活性比较代谢组学分析为了有效地鉴定链霉菌1647中具有抗病毒活性的次级代谢产物,应用分子网络方法。这是基于WT菌株、7098基因阻断突变体(7098-KO)和遗传互补菌株(7098-KOC)中代谢物HPLC分离后通过电喷雾HR-ESI-MS/MS获得H. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176180图二. 链霉菌1647的过表达和敲除突变体的分析。(a)簇36中的五个调控基因(由绿色箭头标记)和NRPS基因7098(由红色箭头标记)的示意图。(b)在A1、A2和A3 + Fe3+培养基中培养的WT菌株和基因7102过表达菌株(7102)的在A3培养基中加入FeCl3至终浓度为0.05%,得到A3 + Fe3+培养基。将发酵液的1/10稀释液进一步三倍稀释七倍,然后记录病毒诱导的CPE以得到IC50。(c)在A1培养基中培养的WT株(黑色)和基因7102过表达株(蓝色,1647/pL-7102)之间的簇36的转录组比对结果(d)WT菌株、7098基因敲除突变体(7098-KO)和遗传互补菌株(7098-KOC)中簇36核心NRPS区域中基因表达水平的qRT-PCR分析。(e)用A3 + Fe3+培养基对WT、7098-KO和7098-KOC菌株发酵液进行抑菌活性测定(f)紫色阴影区域代表第36组的产品缺点:用等量溶剂处理。实验一式三份进行,每个值代表平均值± SD。Student将这些菌株的发酵粗提物分为三组:G1、G2和G3。将G1、G2和G3的MS/MS数据提交至GNPS分子网络数据库,即基于MS系统的在线平台[21,22](图3(a))。将22850个质谱图聚类成1076个节点,每个节点代表结构相似化合物的MS/MS数据。一个特殊的分子簇是由来自G1和G3组的化合物一起形成的,而不是来自非活性组G2的化合物(图3(b))。这表明,这些节点中的分子最有可能属于抗病毒活性化合物。 该分子簇中化合物的特征,包括分布信息、分子量、紫外(UV)吸收和MS/MS碎片离子数据,以促进目标抗病毒化合物的分离和结构鉴定。3.4. 抗病毒代谢产物的分离和结构测定为了获得足够量的活性化合物用于完全结构解析,进行了链霉菌属1647的WT菌株的大规模发酵,基因7098敲除突变体作为阴性对照。在分子网络和抗病毒活性分析数据的指导下,鉴定了18个具有内部脲基连接的伪四肽,并将其命名为omicsynins。 它们是omicsynins A1H. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176181······图三.基于发酵粗提物MS/MS裂解数据的GNPS分子网络。(a)通过GNPS在线工作流程构建WT菌株(G1组)、基因7098敲除突变体(G2组)和遗传互补菌株(G3组)发酵粗提物MS/MS裂解数据仅在WT菌株和遗传互补菌株(G1和G3组)中出现的具有抗病毒活性的一组组分(b)在负模式下,由母离子的分子量表示的抗病毒化合物的特殊簇的节点视图。B1-B6和omicsynin C1-C6,它们的C-末端结构分别是苯丙氨酸醇(Pheol)、argal(Argal)和苯丙氨酸(Pheal)。其中A1、A2、A6、B1Omicsynin A1为白色无定形粉末,其分子式通过HR-ESI-MS([M + H]+m/z 628.2903,Calcd.628.2912)。的NMR数据分析显示其结构为苯丙氨酸(Phe)-Omicsynin A2的HR-ESI-MS数据表明其分子式为C30H43N7O6 S,比A1多两个氢原子。根据NMR数据,确定Omicsynin A2为Phe-CO-arginine(Arg)-Met-Pheol(图1B)。4(b)和附录A中的图S4和表S5)。采用酸水解和先进的Marveland方法测定了Omicsynin A1和A2的绝对结晶度通过NMR数据分析(图4(b))并与文献[25,26]进行比较,将Omicsynin A3和A4鉴定为已知化合物。对omicsynin A3-A6的HR-ESI-MS/MS数据(附录A中的图S5基于1H-NMR数据和HR-ESI-MS/MS分析,以及基于HPLC的omicsynin B4和antipain(EFEBIO,Shanghai,China)(一种已知的肽-醛蛋白酶抑制剂)的共注射分析,omicsynin B1-B6的C-末端形式被鉴定为Arg残基的醛(Argal)(图S5)。在水溶液中,抗痛剂以两种水合物形式、四种环状甲醇胺形式和两种未水合醛形式的动态平衡混合物形式存在[27]。Argal的不稳定性导致之前遇到的色谱困难,以及无法获得高质量的2D NMR光谱。Omicsynin C1-基于HR-ESI-MS/MS数据(图S5)和与商业化合物凝乳酶抑制剂的比较分析,推测Omicsynin Cs的末端是醛。3.5. omicsynins的抗病毒活性通过CPE测定测试Omicsynin A1-Omicsynins B1(0.89-3. 其IC 50分别为4.24lmolL-1 和 13.16lmolL-1。类似地,omicsyninB1拥有抗HCoV-22 9E的IC50约为11mol·L-1,是阳性对照RBV的20倍(IC 50为25.14mol· L-1)。OmicsyninsA1-23.74lmolL-1),比IAV的IC 50(329.33lmolL-1)高10倍以上。 这些结果表明,C-末端还原形式(即,醛或醇氢xyl)和C-末端氨基酸(即,Arg或Phe)对抗病毒活性具有重要意义,并为今后的化学优化提供了早期信息。为了进一步研究omicsynins的抗病毒谱,测定了对其他呼吸道RNA病毒(包括HCoV-0 C43、RSV和HPIV)的抗病毒活性。CPE抑制分析显示,omicsynins对RSV和HPIV没有抗病毒活性(数据未显示)。通过qRT-PCR检测Omicsynin对HCoV-OC 43的抑制活性HCoV-OC43 N蛋白信使RNA(mRNA)在C3 A细胞中的表达,因为HCoV-OC43感染C3 A细胞而不诱导CPE。的H. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176182·见图4。omicsynins的结构信息。(a)Omicsynin A1-A6、B1-B6和C1-C6的结构。(b)研究了omicsynins A1-A4的结构、关键氢Cap:卷曲霉素; Met:甲硫氨酸; THPI:4-取代的四氢嘧啶-2(1H)-亚胺; MTE:甲硫基乙基; Bn:苄基; Arg:精氨酸; GP:胍基丙基; Val:缬氨酸; i-Pr:异丙基; i-Bu:异丁基; s-Bu:仲丁基; Leu:亮氨酸; Ile:异亮氨酸; novel:新化合物; Novel:微生物碱性蛋白酶抑制剂。结果显示,omicsynin B4对冠状病毒HCoV-OC 43具有抑制活性,IC50为28.67lmolL-1(图11)。 5(a))。进一步检测了来自链霉菌属1647 WT菌株的发酵提取物(WT-50E)和基因7098的敲除突变体(KO-50 E)的omicsynin B4的抗病毒活性,H. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176183表1链霉菌活性化合物的抗IAV和HCoV-229 E活性1647年样本信息IAV(H3N2a)HCoV-229ETC50(1mol·LIC50(1mol·LSITC50(1mol·LIC50(1mol·LSIOmicsynin A1> 318.83318.83 ± 0> 1.00> 159.4145.04 ± 7.03> 3.54Omicsynin A2> 794.53207.77 ± 56.00> 3.82> 397.27171.85 ± 2.10> 0.92Omicsynin A3> 335.9787.85 ± 23.68> 3.82> 167.9857.41 ± 15.62> 2.93Omicsynin A4> 83.71> 83.71-> 41.86> 41.86-Omicsynin B1> 315.310.89 0.20 ±> 352.94> 157.651.35 0.28 ±> 117.19Omicsynin B2> 314.321.00 0.22 ±> 312.78> 157.161.53± 0.32> 102.90Omicsynin B3> 332.063.34± 0.13> 99.34> 166.031.19± 0.51> 139.53Omicsynin B4> 330.962.43± 0.71> 136.05> 165.480.89 0.22 ±> 186.34Antipain> 330.963.16± 0.94>104.90>165.481.57± 0.46> 105.63糜蛋白> 329.33329.33 ± 0> 1.00> 164.6623.74 ± 5.66> 6.93OP> 487.334.24± 1.66> 114.94NTNTNTRBV> 819.0013.16 ± 3.11> 62.24> 409.5025.14 ± 6.10> 16.29镇痛药与化合物omicsynin B4相当。糜蛋白酶抑制剂含有三种化合物,糜蛋白酶抑制剂A、B和C,其相当于化合物omicsynin C3和C5。磷酸奥司他韦(OP; Roche,中国)和利巴韦林(RBV; Sigma-Aldrich,美国)用作阳性对照化合物。NT:未测试。n= 3,数据表示平均值± SD。aH3 N2病毒的基因库登录号为CY112821.1以RBV为阳性对照,测定IAVM2 mRNA和PA蛋白的表达 如图如图5(b)和(c)所示,Omicsynin B4和WT-50 E处理剂量依赖性地降低MDCK细胞中IAV M2 mRNA和PA蛋白的水平。KO-50 E对IAV的复制无为了研究IAV复制的哪个步骤被组- synins靶向,进行了添加时间实 验 [17] , 如 图 1A 和 1B 所 示 。 5 ( d ) 和 ( e ) 。 结 果 发 现 ,omicsynin B4和WT-50 E处理可抑制病毒感染后(2-12h)的IAV滴度,而不是感染前(~ 2 - 0 h)和感染期间(0-2 h)的IAV滴度。 5(d))。在感染后0、1、2、4、6 h加入Omicsynin B4和WT-50E,可抑制IAV的复制,而在感染后8、10 h加入Omicsynin B4和WT-50 E则无此作用(图 5(e))。同时,KO-50 E对病毒复制的各个阶段均无明显的抗病毒作用总之,结果表明,omicsynin B4和WT-50 E通过进入后事件抑制病毒复制的早期阶段。4. 讨论在自然界中,微生物经常暴露于病毒(对于原噬菌体而言)。因此,微生物可以产生代谢物,其提供抵抗病毒感染的微环境。在我所近几十年来筛选的2万多个发酵样品中,发现链霉菌1647具有较高的活性和重复性。它产生的次级代谢产物对IAV具有良好的抗病毒活性,包括奥司他韦耐药株。有趣的是,据报道发酵液中的活性成分对SARS-CoV具有活性[28]。然而,链霉菌1647产生的抗病毒化合物的鉴定长期困扰着研究人员。在此,我们使用了一个整合在传统的微生物天然产物发现过程中,活性天然化合物的分离和鉴定是费时费力的。尽管微生物发酵提取物具有良好的生物活性,但在经过一系列生物活性检测引导的分离纯化后,活性由于缺乏氢和碳信号的清晰NMR数据,整个分子结构可能无法阐明或可能被错误地确定。因此,通过整合基因组学、生物活性指导的转录组学和代谢组学分析的前沿技术开发了一种新的策略。该方法有助于鉴定一系列新的抗病毒假四肽天然产物,命名为omicsynins,由链霉菌sp.1647产生。具有C-末端Argal的高活性omicsynin Bs化合物可能主要以其半缩醛胺形式存在,在弱酸性水溶液中具有少量游离醛和水合物[20]。这可能导致在活性导向分离程序和HPLC分析中遇到的困难在后基因组学时代,多组学分析可以有效地用于从微生物天然产物中发现和鉴定基于基因组序列的有效生物信息学分析可以产生关于由靶菌株编码的次级代谢物的一级结构信息。此外,基于生物活性的比较转录组学的应用可以确定负责活性化合物生物合成的潜在BGC。靶BGC可以通过对簇中的调节或生物合成基因进行遗传操作来进一步确定。利用从目标BGC预测的结构信息,代谢组学数据的生物活性导向的分子网络可以突出菌株产生的推定的生物活性候选物。因此,可以根据靶分子的未开发特性采用合理的分离程序,这可以加速生物活性化合物的鉴定过程[29,30],特别是对于使用传统分离程序的难处理化合物。这种新的策略具有另一个来自组学数据的固有优势,即同时发现BGC及其活性次级代谢产物。负责omicsynin生产的BGC位于编码5个NRPS基因的cluster36的核心NRPS区域。它与脱亚氨基抗痛剂的BGC高度同源(图6(a))。脱亚氨基-抗痛剂属于肽-醛蛋白酶抑制剂家族,其特征在于存在C-末端醛[31凝乳酶抑制剂、b-微生物碱性蛋白酶抑制剂(b-bP)、弹性蛋白酶A和亮抑酶肽(图6(b))。在链霉菌1647中,通过代谢组学数据鉴定了超过18种omicsynins包括至少11种新的化合物以及几种已知的类似物,如抗疼痛药、凝乳酶抑制剂和β-内酰胺酶,已报道它们具有多种抗病毒活性。例如,抗疼痛剂已被证明具有抑制活性抗HCoV-229 E[34] 和脊 髓灰质 炎病毒2A[35] ,抗 流感病 毒[36] 和HCoV-229 E[34]的亮抑酶肽,以及抗H. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176184图五、omicsynins对HCoV-0 C43和IAV H3 N2的抑制测定(a)通过qRT-PCR测定法测定的C3 A细胞中HCoV-0 C43的N蛋白的mRNA表达水平(b,c)omicsynin B4、WT-50E和KO-50 E对MDCK细胞中IAV M2 mRNA和PA蛋白水平的影响用IAV H3N2(感染复数(MOI)= 0.01)感染MDCK细胞,并在感染后2小时加入测试样品感染后24小时后,收获细胞,并且(b)通过qRT-PCR测定法测定IAV M2 mRNA,并且(c)通过Western印迹测定法测定病毒PA蛋白(d,e)针对IAV的 omicsynin B4、WT-50 E和KO-50 E的添加时间测定如示意性实验设计所示,用IAV H3N2感染MDCK细胞感染后12小时,收获细胞,并通过病毒PA蛋白的(d)CPE测定和(e)Western印迹测定来确定病毒滴度。WT-50 E和KO-50 E为发酵提取物链霉菌1647 WT菌株和基因7098的敲除突变体。缺点:用等量溶剂处理。每个值代表平均值± SD。单因素方差分析:*p < 0.05,**p < 0.01,*p < 0.001 vs对照组HIV-1蛋白酶[26,36]。新的肽-醛化合物omicsynin B1、B2和B3对IAV和HCoV-229 E表现出显著的抑制活性,以广谱方式起作用Omicsynin B4和多种Omicsynin组分存在于WT株的50E部分,并且当在感染后0至6 h添加时可以抑制IAV复制,这表明它们通过干扰进入后事件的早期阶段而发挥抗IAV作用omicsynins对奥司他韦敏感和耐药IAV株的相似活性表明它们的抗病毒机制不涉及靶向神经氨酸酶,这有助于子代病毒从感染细胞中释放。的在抗IAV机制中涉及的omicsynins的确切作用需要进一步的详细研究。这是首次在微生物中发现抗病毒基因簇然而,这些化合物的生物合成机制尚未阐明。在omicsynins的生物合成过程中有许多未解之谜,例如不寻常地缺乏第四个NRPS A结构域(只有三个A结构域存在于四肽生产簇中)以及两个独特的氧化还原酶的功能。该假肽家族的同源物的存在表明存在H. 太阳,X.Li,M.Chen等人工程16(2022)176185图六、omicsynins和代表性肽醛蛋白酶抑制剂的遗传组织和化学结构(a)omicsynin基因簇和脱亚氨基-抗疼痛基因簇及其氨基酸序列同一性的示意图(b)omicsynins和代表性肽-醛蛋白酶抑制剂的化学结构,包括脱亚氨基-抗痛剂、抗痛剂、凝乳酶抑制剂、β-淀粉酶抑制剂、弹性蛋白A和亮抑酶肽。用于新型抗病毒化学物质生
下载后可阅读完整内容,剩余1页未读,立即下载
cpongm
- 粉丝: 5
- 资源: 2万+
上传资源 快速赚钱
- 我的内容管理 展开
- 我的资源 快来上传第一个资源
- 我的收益 登录查看自己的收益
- 我的积分 登录查看自己的积分
- 我的C币 登录后查看C币余额
- 我的收藏
- 我的下载
- 下载帮助
最新资源
- 十种常见电感线圈电感量计算公式详解
- 军用车辆:CAN总线的集成与优势
- CAN总线在汽车智能换档系统中的作用与实现
- CAN总线数据超载问题及解决策略
- 汽车车身系统CAN总线设计与应用
- SAP企业需求深度剖析:财务会计与供应链的关键流程与改进策略
- CAN总线在发动机电控系统中的通信设计实践
- Spring与iBATIS整合:快速开发与比较分析
- CAN总线驱动的整车管理系统硬件设计详解
- CAN总线通讯智能节点设计与实现
- DSP实现电动汽车CAN总线通讯技术
- CAN协议网关设计:自动位速率检测与互连
- Xcode免证书调试iPad程序开发指南
- 分布式数据库查询优化算法探讨
- Win7安装VC++6.0完全指南:解决兼容性与Office冲突
- MFC实现学生信息管理系统:登录与数据库操作
资源上传下载、课程学习等过程中有任何疑问或建议,欢迎提出宝贵意见哦~我们会及时处理!
点击此处反馈
安全验证
文档复制为VIP权益,开通VIP直接复制
信息提交成功