DNA元条形码的自动化高通量生物监测工作流程

环境科学与生态技术8（2021）100122原创研究使用DNA元条形码的标准化高通量生物监测：采用自动化液体处理器的策略Dominik Buchnera，1，Till-Hendrik Machera，1，Arne J. Beermanna，b，Marie-The're'seWernera，FlorianLeesea，b，*a杜伊斯堡-埃森大学，水生生态系统研究，大学。5，45141，埃森，德国b杜伊斯堡-埃森大学，水和环境研究中心（ZWU），大学。3，45141，Essen，德国我的天啊N F O文章历史：接收日期：2021年6月18日接收日期：2021年2021年8月26日接受保留字：自动化标准化高通量测序A B S T R A C T需要可靠和全面的监测数据来追踪和应对生物多样性的丧失。使用从群落样品（批量）或从水或沉积物（环境DNA）提取的DNA的高通量元条形码已经彻底改变了生物监测，因为能够以可行的努力和适度的价格快速评估整个生命树的生物多样性。DNA元条形码可以升级到并行处理数百个样本。然而，尽管自动化高通量分析工作流程在医学领域中已得到很好的建立，但手动样品处理仍然在生物监测实验室工作流程中占主导地位，限制了常规监测应用的升级和标准化。在这里，我们提出了一个自动化的，可扩展的，可重复的metabarcoding工作流程，从批量样品中提取DNA，进行PCR和液体处理器上的文库制备。主要特点是在整个工作流程中独立的样品复制以及使用许多阴性对照进行质量保证和质量控制。我们生成了两个数据集：i）由42个不同物种的个体节肢动物标本组成的验证数据集，和ii）由60个溪流大型无脊椎动物批量样品组成的常规监测数据集。 作为标记，我们使用线粒体COI基因。我们的研究结果表明，开发的单层工作流程是免费的实验室来源的污染，并产生高度一致的结果。重复之间的微小偏差主要是由于低丰度OTU的随机差异。因此，我们成功地证明了机器人液体处理可以在单平台上从DNA提取到最终文库制备可靠地使用，从而大幅提高了通量，降低了成本，并提高了生物多样性评估和监测的数据稳健性。©2021作者（S）。出版社：Elsevier B.V.我代表中国环境科学学会哈 尔 滨 工 业 大 学 、 中 国 环 境 科 学 研 究 院 这 是 一 篇 基 于 CC BY-NC-ND 许 可 证 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍全球生物多样性正在快速丧失[1e 3]。在2020年后全球生物多样性框架下，《联合国生物多样性公约》（CBD）目前专注于并协调国际努力，以实现可持续发展目标中概述的2050年“与自然和谐相处”的愿景。一个战略里程碑是*通讯作者。杜伊斯堡-埃森大学，水生生态系统研究，Uni v ersit atsst r. 5，4 5141Essen，Germa ny.电子邮件地址：Coronorian. uni-due.de（法文）。Leese）。[1]这些作者对这项工作作出了同样的贡献。2021年至2030年为“联合国生态系统恢复十年”。虽然生物多样性丧失的主要驱动因素已经确定，但一个共同的问题是缺乏高分辨率的生物多样性数据，这些数据可以监测变化并评估人类行为对整个生命之树生物多样性的具体好处，即，从原核生物到真菌和单细胞真核生物再到复杂的多细胞生物。传统的监测方法基于表型特征评估生物多样性，例如，显微镜和识别钥匙。可靠的物种识别，特别是大型真核生物是可能的，但时间和空间分辨率非常有限。虽然公民科学方法[5]有时会提供高分辨率的数据，但这主要适用于少数选定的分类群体，如鸟类。然而，对于绝大多数https://doi.org/10.1016/j.ese.2021.1001222666-4984/©2021作者。由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。目录可在ScienceDirect环境科学与生态技术期刊主页：www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.comD. Buchner，T. H. Macher，A.J. Beermann等人环境科学与生态技术8（2021）1001222--生物多样性，例如，昆虫，可用的数据是稀缺的，因此趋势仍然不确定[6，7]。鉴于对可靠和可扩展的生物多样性评估解决方案的需求，新的分子工具可以成为游戏规则的改变者[8，9]。特别是从水、沉积物、土壤、植物或空气中收集的环境DNA（eDNA）样品的分析对于高通量多样性评估具有令人难以置信的潜力[10]。这样的样品可以在高通量测序仪上以大规模并行方式进行分析，从而按比例增加要同时分析的样品数量[11]。测序技术在过去十年中迅速发展，导致数据输出的急剧增加和每个碱基对成本的降低对于基于DNA的生物多样性评估，DNA元条形码[12]是目前应用最广泛的评估海洋[13，14]，湖泊[15，16]和陆地生态系统[17，18]生物多样性的方法虽然存在许多不同的DNA元条形码实验室协议[19e21]，但所有DNA元条形码方法可以大致分为有限数量的不同工作流程步骤：i）预扩增样品处理，ii）DNA扩增和文库制备，iii）测序，iv）生物信息学分析。在湿实验室工作流程中，首先从样品中分离DNA（例如， 生物组织或过滤器上的eDNA）。根据样品类型或分类单元，提取的DNA用针对特定DNA片段的引物进行PCR扩增，例如线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因[22，23]，核糖体RNA的大小亚基的不同片段，如12 S [24，25]或16 S标记或内部转录间隔区（ITS; [26，27]）。然后使用连接或基于PCR的策略添加特定标签或索引[28]，以允许在生物信息处理期间区分样品。PCR后步骤可以在不同的方案之间变化，但主要包括标准化步骤，大小选择和DNA定量。然后在各 种 可 用 的 测 序 平 台 之 一 上 对 最 终 文 库 进 行 测 序 ， 例 如 ，Illumina 、 IonTorrent 、 DNBSEQ 、 PacBio 或 OxfordNanopore。尽管实验室器皿和化学品种类繁多，实验室设置的差异和个人偏好，以及目标生物的选择和研究人员的问题，所有这些协议都共享这个基本工作流程[20]。在这里，实施可靠和标准化的质量控制措施是至关重要的，以产生值得信赖的数据，在大规模的常规实验室实践。所有这些都已经在医学实验室中使用机器人液体处理技术实现。SARS-CoV-2的高通量PCR筛查每周数百万样本的成功证明了这一点[29，30]。一般来说，机器人液体处理用于蛋白质折叠分析[31]、细胞培养[32]、基因分型[33，34]、选择反应监测质谱[35]、法医分析[36，37]（概述见[38]），特别是许多临床诊断[39e 42]，包括微生物组筛选[43，44]。验证液体处理准确性的国际标准已经存在，并且正在进一步完善（例如，ISO/IWA15; ISO/CD23783）。鉴于这些现有的自动化实验室工作流程，值得注意的是，绝大多数DNA元编码-生物多样性评估研究仍然基于手动样品处理。据我们所知，尚未发布由验证数据集支持的生物多样性评估分析的既定、标准化和全自动化方案。然而，鉴于阻止生物多样性丧失和恢复生态系统的任务方面的全球挑战，迫切需要类似于医学实验室工作流程的强大、可扩展和标准化的处理工作流程。因此，我们在这里提出了这样一种标准化和高度可扩展的生物多样性数据生成和验证工作流程，该流程使用自动化液体处理站（补充图1）。制定实验室方案，以产生可靠和可重复的数据，最大限度地减少手动液体处理操作，防止液体处理过程中的交叉污染，通过过渡到基于96孔板的研究设计，处理和大幅扩大通量为了验证自动化工作流程的鲁棒性，我们产生了两个不同的针对线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因的数据集数据集1由单独处理和分析的经形态学鉴定的单个标本样本该数据集旨在识别潜在的交叉污染，因为预期每个样本仅代表一个相应物种的读数（验证数据集）。数据集2由淡水无脊椎动物的群落元条形码分析组成，作为德国巴伐利亚州常规生物监测计划的一部分（生物监测数据集）。此外，我们提出了196个样本分析，支持高吞吐量元条码的工作流程的普遍适用性的汇总统计。我们讨论了我们的发现，并在迈向下一个十年的高通量遗传评估[45]（也称为生物监测2.0 [46]）时提出了考虑因素。2. 方法用于验证样本处理稳健性的第一个数据集由来自42种不同节肢动物物种的42个单一样本组成。2013年在Breitenbach河和2014年在KleineSchmalenau 河 （ 德 国 ， N 50.66206 E 9.62389; N 51.43928 ，E8.13869;从有关国家当局获得了取样许可）。所有标本经形态学鉴定为种（34）、属（2）、科（5）或目（1）级。如果形态学鉴定进行到比物种更高的分类学水平（例如，目）各自的分类群仅由一个标本代表。第二个数据集由60个分类的大型无脊椎动物散装样品组成，每个样品包含数百个标本，由巴伐利亚环境署（LfU）收集和提供。2.1. 样品制备将数据集1的单个样本在无菌培养皿中单独干燥过夜。然后将样本转移到预先填充有5个氧化锆珠粒（2 mm直径; BioSpec Products，Bartlesville，USA）的2 mL扭盖管中，并使用FastPrep-24（MPBiomedicals，Mrswege，Germany）研 磨 成 组 织 粉 末 ， 用 于 组 织培养。在6 m/s时为3×45 s。将研磨的组织粉末溶解在300mL TNES缓冲液中，并储存在100 mL。20℃，直至进一步加工。散装使用无菌滤纸将来自监管生物监测程序（数据集2）的样本与储存乙醇分离对于与样本中其他样本的平均尺寸相比尺寸差异很大的样本，身体的一部分腿或腹部）被切下并用于进一步加工，而剩余物被丢弃 。 将 样 品 干 燥 过 夜 并 转 移 到 无 菌 Turrax 研 磨 管 （ IKA ，Stauffen ， Germany ） 中 。 将 样 品 在 Ultra Turrax （ IKA ，Stauffen，Germany）上以4000 rpm研磨30 min至组织粉末。研磨后，将组织粉末溶解在10 mL TNES缓冲液中，随后将300 mL匀浆转移到2 mL扭顶管，并储存在20℃，直至进一步加工。所有然后按照图1中概述的工作流程处理样品。所有以下步骤已在BiomekFXP自动化工作站（Beckman Coulter，Indianapolis USA）上尽可能最大程度地自动化。2.2.DNA提取复制对于验证D. Buchner，T. H. Macher，A.J. Beermann等人环境科学与生态技术8（2021）1001223.fastqNCNCNC NCNCNCNCNC NCNCNCNCNCNCNC NCNCNCNCNC NCNCNCNC.fastqx84样本x2次重复平板A平板B靶特异性正向引物x2靶特异性反向引物通用标签正向引物X225 ng/样品通用标签反向引物PC2图1. 为 自动化液体处理器建立的标准化和自动化DNA元条形码工作流程的蓝图。价格和DNA输入取决于实际使用的测序时间可能会因第三方公司或测序仪的可用性而异。所示价格为工作流程中使用的产品的标价（2021年）。数据集。因此，在DNA提取前，将每份均质化样品分到单独平板上的两个孔中（图1，平板A和平板B）。在此，将60mL溶解的组织粉末用133mL另外的TNES缓冲液和7mL蛋白酶K（10 mg/mL）mL）在55 ℃和1000 rpm下在200mL最终体积中搅拌3 h从在第二次PCR中对样品进行单独标记之前的复制点，同一样品的复制品从不同时在机器人平台上以控制交叉污染。根据Elbrecht Steinke[ 11 ]，将12个仅含TNES缓冲液的阴性对照品置于平板上&。使用改良的NucleoMag Tissue试剂盒（MachereyNagel，Düren，Germany，补充材料1）提取DNA。使用1%琼脂糖凝胶检查提取的DNA的质量。2.3.PCR线粒体细胞色素c氧化酶亚基1的一个片段根据Zizka等人[28]，使用两步PCR方案扩增COI基因。在第一步中，使用Qiagen Multiplex PCR Plus Kit（Qiagen，Hilden，Germany）在25 mL 试 验 中 扩 增 DNA ， 该 试 验 含 有 1 x Multiplex PCR MasterMix、1 x CoralLoad Dye、100 nM的每种引物（fwhF 2、fwhR 2n;补充表5 [47];有四种不同长度的版本，并如Leese等人[ 48 ]所述连接通用尾）、2.5 mLDNA和无RNA酶水。使用降落PCR方案进行扩增，以下参数：95℃ 5 min作为初始变性，10个循环的95 ℃ 30 s变性，68-59 ℃ 90 s退火(with每循环降低1℃），72 ℃延伸30 s，随后在相同条件下进行20个循环，但退火温度为58 ℃，然后在68 ℃下进行10 min的最终延伸步骤为第二步，使用与连接的i5/i7索引和P5/P7 Illumina衔接子匹配的通用尾的引物（补充表5，也参见[49，50]）。该测定与第一步的测定类似，不同之处在于仅1mL第一步--采样天（排过夜（干30分钟同质化--复制5 hDNA提取2.5 HPCR1特异性引物2小PCR2标记引物1S.a5mplihng不，不，不，不，不30分钟池化30个单元SizSeasmelpelcitniogn2小定量2-6周Illumina测序4小生物信息处理一个CG TPC1D. Buchner，T. H. Macher，A.J. Beermann等人环境科学与生态技术8（2021）1001224×¼将步骤PCR产物加入到PCR反应中。第二步的PCR方案为95 ℃ 5 min初始变性，15个循环的95℃ 30 s和72℃120 s，最后以68 ℃延伸10 min结束。琼脂糖凝胶。对于在凝胶中显示弱条带的样品，重复第二步20个循环。2.4.标准化、合并和文库制备使用全部量的剩余PCR产物，用SequalPrep标准化板（AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA）将所有样品标准化至1.25ng/mL标准化后，合并一个数据集的所有样品，并使用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-up试剂盒（Macherey Nagel，Düren，Germany）浓缩。用NucleoMag试剂盒对两个文库进行左侧大小选择以去除剩余的引物 二 聚 体 ， 用 于 清 理 和 大 小 选 择 （ Macherey Nagel ， Düren ，Germany），其中比率为0.76.使用片段分析仪（High Sensitivity NGS Fragment AnalysisKit; Advanced Analytical，Ankeny，USA）测量文库浓度。手动进行文库浓缩和大小选择在商业服务提供商（CeGaT，Tübingen，Germany）使用MiSeq平台和配对末端v2试剂盒（读取长度2 250bp）对验证数据集进行测序对于生物监测数据集，使用相同的测序平台在单独运行中对每个重复平板进行2.5. 生物信息从CeGaT接收三个文库的原始读段作为解复用的快速文件。使用FastQC检查原始读数的质量[51]。随后，使用自定义Python脚本重命名样本。使用VEGF2.11.1版[52]合并双端读段，允许合并对之间有25%的差异，最小重叠为20 bp。之后，使用cutadapt版本2.8修剪引物[53]。然后使用VEGFR2通过长度（靶片段的195和215 bp阈值）和最大预期误差（maxee 1）过滤读数。过滤后的读数被去复制，用VEGFR2去除单例和嵌合体。 然后使用自定义Python脚本合并所有读段 并 全 局 去 复 制 。 序 列 相 似 度 为 97% 时 ， 聚 类 成 操 作 分 类 单 位（OTU），并提取共有序列作为代表性OTU序列。将OTU重新映射（uscloud_global函数，97%相似性）至单个样品文件，以创建读取表。读取表按列过滤（读取丰度阈值：>0.01%的读取/样品以保持OTU），然后按行（OTU必 须 存 在 于 至 少 一 个 示 例 中 ） ， 使 用 自 定 义 Python脚 本 。 使 用BOLDigger版本1.1.10 [54]和生命条形码数据系统（BOLD）数据库[55]进行OTU的分类学分配。应用“JAMP过滤器“选项提取最终分类表。使用TaxonTableTools（TTT）1.3.0版进行数据集和可视化的下游处理[56]。最初，读取表和分类表被转换为两个数据集的TTT输入格式（补充表1和2）。在进行下游分析之前，从表格中删除阴性对照（基于样品的过滤器工具）。计算生物监测数据集（数据集2）的基于读数的稀疏曲线，重复10次，增量5%（补充图2）。然后，计算重复样品之间的共享OTU数量，并使用TTT内的相应工具进行重复样品之间的相关性分析（OTU相关性、Spearman相关系数）。为了计算PCR随机性，两次提取中不存在的所有OTU复制是丢弃之前样品随后合并（补充表3和4）。在重复合并步骤之前，计算验证数据集的读数比例图此外，将验证数据集的分类结果与全球生物多样性信息设施（GBIF）数据库进行匹配，以检测同义词和拼写错误（GBIF分类检查工具）。对于这两个数据集，基本统计数据（即，计算OTU和读数的数量）、分类丰富度和分类分辨率此外，Krona图表[57]为生物监测数据集创建（补充图6）。2.6. 附加数据集这里提出的工作流程可以很容易地升级到hun-样本的数量。因此，我们使用与第二个数据集相同的工作流程，纳入了在BiomekFX P上生成的其他数据集（共196个样本）的结果。与生物监测数据集相反，在Illumina HiSeq测序运行上对附加数据集中包括的样品进行测序，与用于生物监测数据集的Illumina MiSeq平台相比，其产生实质上更多的读数。3. 结果3.1. 单个样本验证数据集COI验证数据集（数据集1）由11，105，659个原始读数组成，其中1664个被分配给阴性对照。质量过滤后，剩余10，392，660个读数（阴性对照中仅3个读数）。然后将读段合并、去复制，并去除单体和嵌合体。读数的97%相似性聚类产生152个OTU。在读段丰度过滤（0.01%阈值）后，剩余97个OTU，并且除了一个OTU之外的所有OTU都可以分类分配。阴性对照的读数低于0.01%的过滤阈值，因此丢弃。总共，96个OTU被分配到6个不同的高级分类群，即，节肢动物门（89个 OTU）、子 囊 菌 门（3个）、硅 藻 门（1个）、基础-diomycota（1）、刺胞门（1）和线虫门（1）。在移除唯一OTU（即，排除两个重复中不存在的OTU总体而言，46个OTU被分配到物种水平，覆盖2门的40个不同物种，即，节肢动物门和一个OTU分配给子囊菌门。由于研究重点是无脊椎动物，因此在下游分析中丢弃了子囊菌门命中 由于移液机器人上的42个反应孔中的每一个仅包含一个不同分类单元的一个个体（基于形态学鉴定，总共42个），因此在HTS测序数据中容易观察到孔之间可能的交叉污染。虽然在形态学和基于DNA的鉴定结果中存在一些差异（形态学错误鉴定或形态学鉴定中较低的分类学分辨率），但29例病例显示每个使用的个体（和孔）仅具有一个分类学分配（图1）。 2）。 在其余13例病例中的9例中，观察到每个标本和孔的多个分类学分配，但不一致（或仅暗示数据库中的参考序列被错误鉴定）。例如，将样品40（形态学鉴定为黑叶银合欢）的所有读数分配给（i）黑叶银合欢或（ii）银合欢（仅属）。形态学上鉴定的双翅昆虫Dicranota claripennis（样品38）的大多数读段聚集在两个OTU中，这些OTU与BOLD中属于几个 双 翅 目 科 （ Heleomyzidae ， Chironomidae ， Limoniidae ，Pediciidae等）标本的参考序列具有较低的相似性（~90%）。虽然最终被分配到两个不同的科（Heleomyzidae和Chironomidae），但这两个OTU最有可能来自同一物种，因为OTU之间的距离相当低（2.44%）。 作为D. Claripennis不是D. Buchner，T. H. Macher，A.J. Beermann等人环境科学与生态技术8（2021）1001225¼双额茨威木黄刺尾藓鞘翅目亮翅曲尾苔黑角长足虻托伦鳞尾鳕双额茨威木托伦鳞尾鳕长鳍鱼属虻科黑角长足虻黄刺尾藓鞘翅目金龟科褐绢毛纱Prosimuplantomosvaryi（0.16）双翅目摇蚊科花蝇科似海钩虾间刺海鲶透明水蚤戈氏等孔边缘细叶苔亚高山鳞尾鳕蚤状钩虾间刺海鲶萨克森水蚤伊索佩拉近缘副薄叶苔n.指状叶夜蛾n.黑翅夜蛾小蜂科鳞叶小鳍蕨康布氏细颈螺皮克特线螺n.指状叶夜蛾皮克特线螺白角齿角藻密花板孢菌褐头长颌象黄斑多角丽鱼近缘副薄叶苔近缘副薄叶苔长喙多角脂缘珠螺缘珠螺宽翅溪蟹山地喜溪蟹托莫氏原似扁蝇科寄蝇科近缘小卷蛾奥氏原丝尾密花板孢菌奥氏原丝尾间纹原丝鲶虻科拟绢口线虫黑翅长喙藓苍白筒仓嗜冷蚋音村PR间纹原丝鲶荣誉徽章（15.57）上海现代西木藓粗管蚤虻科蝇科罗斯氏粉虱大蚊枕叶虫管鲈属粗管蚤枕叶虫020406080100020406080100020406080100020406080100020406080100020406080100图2. 验证数据集样本的相对读段比例及其分配的分类。分类为共扩增的命中以粗体突出显示。一个潜在的数据集内部交叉污染以粗体和红色突出显示（样本：Dicranota claripennis，命中：Prosimuplantomosvaryi）。相对读取比例写在括号中。在BOLD数据库中，其形态ID既不能被确认也不能被拒绝。可以排除家族水平的错误形态学鉴定。在另外三种情况下，除了目标分类单元外，还发现了恙螨目（占各自读数的0.08%）、蜘蛛目（0.06%）或Sperchon insignis（恙螨目，15.57%）的读数。虽然所有三个提到的分类群不是42个使用的分类群的一部分，但仅在一种情况下，在不同的样品（样品38：亮翅白刺）中检测到分配给使用的分类群（样品30：原锯叶甲3.2.生物监测数据集淡水无脊椎动物COI生物监测数据集（数据集2）由18，478，511个原始读数组成，其中29，991个被分配给阴性对照。在生物信息学处理之后和OTU聚类之前，剩余16，160，528个读数（阴性对照中200个读数）。随后，将读段合并、去复制、去除单例和嵌合体，并且将剩余读段聚类成1720个OTU。读数丰度过滤（0.01%阈值）后，剩余972个OTU，除一个OTU外，所有OTU均与BOLD数据库进行比较。在此，阴性对照品共包含13个读数，分配给5种节肢动物（红腹拟步行虫、辐射拟步行虫、大花等节线虫、黄腹拟步行虫、斑腹拟步行虫），但在应用重复一致性过滤器后全部丢弃。所有样品在基于读数的稀疏分析中均显示出足够的测序深度（补充图2）。观察到每个重复的OTU数量呈强正相关（r0.983，p <0.05;图11）。3）。除两个样本外，所有样本在提取重复样本之间共享至少80%的OTU（平均值为89.63%;图4）。非共享OTU仅是那些占非常低的OTU，即，相应样品中<0.01%的读数（图5）。分配给OTU并在重复之间共享的读段的平均值为99.93%。去除独特OTU后，保留888个OTU（99.93%的读数），并分配给6门和413种，其中559个OTU（图三. 生物监测数据集样本重复之间OTU的Spearman相关性分析。分配给物种级别的OTU（即，在一些情况下，一个以上的OTU被分配给同一物种）。大多数读段占节肢动物门（所有读段的99%），而不到1%的读段分配给环节动物门、苔藓虫门、软体动物门、线虫门和轮虫门。在节肢动物中，最具代表性的目的是Tri- choptera（占所有读数的25% ），Plecoptera（24% ），Diptera（21% ）和Ephemeroptera（17%）。3.3.附加数据集在额外的数据集中，我们观察到随着测序深度的增加，提取重复之间不共享的低丰度OTU的量增加，导致平均58.16%的共享OTU。然而，重复之间的共享读段的平均数量仍然很高，为97.59%。恙螨目（0.08）白角齿角藻褐头长颌象大斑喜溪蟹鲈科翅目Perla马德里珍珠D. Buchner，T. H. Macher，A.J. Beermann等人环境科学与生态技术8（2021）1001226见图4。 生物监测数据集的PCR重复之间共享OTU（平均89.63%）和共享读数（99.93%）的相对比例。100806040200n=130 n=774 n=1322n=1632100%-10% 10%-1% 1%-0.1% 0.1%读数丰度共享非共享将两个完全独立的平板平行放置，分开后不会同时打开 通过这样做，并且通过仅接受在两个独立重复中出现的OTU（可能拒绝许多低丰度OTU），建立了稳健且可靠的QA/QC机制。通过物理重复分离，还可以控制足够的均质化。生物监测数据集证实了这一点，重复之间共享的OTU数量非常高。提取重复样品平均共享89.6%的OTU，支持机器人工作流程的再现性。在重复之间不共享的10.4%的OTU仅占读数的0.07%，这突出表明所使用的高通量设计提供了稳健的结果，除了非常罕见和小的物种，其是与数百个额外样本的结果一致，图5. 每个箱的共享和非共享OTU的相对比例（即，100%e 10%，10%e 1%，1%e 0.1%和0.1%）。每个箱的总OTU的数量在条上方给出4. 讨论在高通量遗传分析的工作流程中需要有效的质量控制机制，以控制实验室方案中的潜在污染源[58]。当使用不分离PCR前和后步骤的单层溶液时，这一点特别重要，这也是本研究的情况适当的阴性对照样品布局可有效控制质量。根据[11]的建议，我们建议每个平板12个阴性对照，96孔板的每行和每列各一个我们可以证明，只有很小一部分的读取（即，生物监测数据集总共13个读数，过滤读数的0.00009%）在生物信息处理后分配给阴性对照，特别是由于0.01%的检测阈值。这几个剩余读数仅在一次重复中发现，因此被排除。因此，我们可以排除在机器人上进行实验室处理期间的交叉污染。我们强烈建议使用与样本数量相关的足够数量的阴性对照，如上所述。此外，质量保证的另一个关键步骤是将到目前为止，我们的实验室已经完成了（补充图3、4和5）。然而，在复杂的环境样本中，可能存在许多小的样本，并且倾斜的等级多度曲线总是使稀有物种仅在有限的程度上被共享。在这种情况下，添加已知分类单元组成和不同模板浓度的阳性对照样品将进一步允许控制为了专门测试自动化工作流程中的潜在污染，我们设计了单一样本验证数据集，以检测在传统设置（如生物监测数据集）中无法检测到的样本之间的潜在交叉污染。尽管我们在所提出的甲板设置中使用了许多阴性对照（即，96个孔中的12个孔占阴性对照），系统误差和偶然误差都可能通过预防措施测量验证数据集的设计允许检测这些交叉污染，这些交叉污染例如可能在机器人的样品处理期间发生（即，通过滴入其他孔、来自实验室的气溶胶或通过平板振荡期间的溢出在这里，我们对验证数据集的结果表明，机器人协议和拟议的工作流程不容易发生交叉污染。我们能够宣布42个单一标本样本中有41个在三种情况下，我们发现OTU分配到蜘蛛目，恙螨和水螨Sperchon insignis。所有这些袭击很可能来自OTU/箱（%）D. Buchner，T. H. Macher，A.J. Beermann等人环境科学与生态技术8（2021）1001227存在于样品中的体外寄生虫，即，通过在采样时附着在宿主身上通过对整个单个标本应用DNA元条形码，很明显，体外寄生虫将与其宿主一起被检测到此外，验证数据集纳入的单个标本均不属于蜘蛛目，这排除了数据集衍生的交叉污染。因此，只有一例潜在交叉污染被排除。在此，在两个重复的两个独立样品中检测到Prosimuartomos-varyi种。预期第一份样本显示为Prosimuplastomosvaryi，因为这是相应的形态学鉴定。第二份样本可视为交叉污染。然而，这种偏差很可能不是来自机器人的工作流程。由于所有标本均来自一个散装样品，因此在样品采集过程中，极有可能是Prosimuelastomosvaryi标本的部分与Dicranota claripennis标本接触。特别是在乙醇中保存过程中，已知标本会与其末端纠缠在一起，这些末端不可避免地变得脆弱，并且在随后的样品分选过程中经常断裂。因此，在这个特殊的情况 下 ， Prosimuarptomosvaryi 的 爪 子 或 腿 可 能 已 经 与 Dicranotaclaripennis标本一起转移，因为它们都存在于原始的散装样品中。总体而言，这一单一且仍然唯一的潜在交叉污染情况仅占样本所有读数的0.16%。如此低丰度的命中甚至可能不会在像生物监测数据集这样的批量样本分析中被检测到，因此不会引起对工作流程鲁棒性的担忧。一般来说，当编程新协议用于液体操作工作站时，需要特别注意最小移液量。在本研究中，Span-8的最小体积为2mL，而96孔头能够处理低至1 mL的体积对于粘性液体的处理酶、溶解在缓冲液中的组织），应考虑使用宽孔尖端，因为它们几乎不会堵塞。虽然扩增子测序和元条形码即使在5 mL PCR反应体积中也能可靠地工作[44，50]，但由于样品抑制或自动化工作站可能的最小移液体积，个别应用可能会使用增加的体积。4.1. 生物监测标准化将遗传方法标准化纳入常规生物监测工作流程是未来十年的一项核心挑战。国际标准化组织（ISO/TC 331）成立了一个新的生物多样性专家委员会，从而为建立生物多样性领域的标准迈出了第一步。所呈列准则旨在制定全球使用的术语及定义、影响分析方法、界定策略的框架，以及行动计划、监察及报告工具及指引。许多国家ISO成员已经宣布加入ISO/TC 331委员会，如法国（秘书处）、巴西、中国、德国或俄罗斯。欧洲标准化委员会（CEN）通过建立DNA和eDNA分析技术机构（TC 230/WG 28），在水生生物多样性领域也做出了类似的标准化努力。这个正式的工作组的目标是新的环境DNA和其他水生生态系统的生态基因组分析的标准化。生物监测领域的这些国际标准化工作突出了对更复杂、更稳健和标准化方法的需求，如本研究所述，以及对实验室间环试验验证的需求[59]。与医学和商业毒理学实验室类似，我们认为自动化液体处理器的实施将是产生可靠和可比数据的关键一步，以满足全球即将到来的环境监测方案。其主要优点是任何生物群体都可以用元条形码作为目标，即，虽然我们提出了针对大型无脊椎动物的解决方案，但相同的方案也可以应用于其他目标群体（细菌、微藻、真菌等; 看到例如[23，60]）。此外，通过对实验室工作流程（定制和商业）的持续优化，基于DNA的生物监测的成本甚至可以在未来进一步降低，从而增加其在生物监测摄像机中的适用性。考虑到几种自动化机器人平台的高初始成本（通常> 20万美元）和有时大量的维护成本，显然这种设备应该安装在中央核心设施、生物监测中心和可以执行数千次分析的商业服务提供商处。因此，要释放标准化生物多样性评估和生物监测的潜力，下一步需要对已公布的自动化液体处理程序进行正式标准化。4.2.一个不同机器人的动物园-我们的概念是如何实现的？存在各种不同的自动化液体处理机器，并且我们的目的不是推广特定的模型。尽管对于自动化DNA元条形码编码应用的实施，需要大多数基本的液体处理操作，但是品牌和型号的选择似乎具有广泛的影响。然而，这里为Biomek FXP提供的解决方案和协议可以很容易地应用于许多其他当前可用的以及未来的自动化液体处理机器人。这里概述的主要方案步骤基于标准实验室器皿（即，96-孔板，2mL螺旋盖管），对于特殊情况，蓝图或商业替代品是可用的（即，50 mLFal- con试管架），或者可以很容易地采用替代解决方案。满足以下基本要求的每种自动化液体处理机器人型号：i）高达1m L的移液精度，ii）与96或384孔板格式的兼容性，和iii）定制的-Iizable工作流适用于这种标准化和稳健的DNA元条形码分析。特别是开放平台，如EvoBot [61]，一种开源的模块化液体处理机器人，突出了未来在常规生物监测中广泛应用的潜力。这些平台与这里介绍的工作流程直接兼容，只需要一些微调和调整。为了确保用于生物监测的准确和可靠的元条形码数据，验证数据集（类似于数据集1，或甚至仅使用合成设计的模板DNA）的应用、经由许多阴性对照检查交叉污染以及两个或更多个独立重复之间的一致性检查将确保对工作流程设计的高质量分析，而不管所使用的机器人模型。5. 结论我们在此证明，从DNA提取到最终文库制备，可以以简单和标准化的方式可靠地使用简单的自动化液体处理技术。这样，生物多样性评估和生物监测的成本和生产量就可以标准化，并大幅度提高。与医疗部门类似，获得协议以及正式的标准化是释放环境监测全部技术潜力所需的下一步。作者贡献D.B. T.M. 和A.B.构思并设计了这项研究。D.B. 和T.M.写了移液机器人协议A.B.和F. L。为移液机器人工作流程提供输入并监督项目。D.B. 和M.W.制备样品并处理文库。D. Buchner，T. H. Macher，A.J. Beermann等人环境科学与生态技术8（2021）1001228T.M.和db处理并分析了测序数据。汤姆D.B. A.B. M.W.和F. L。在报纸上写道。所有作者都阅读并批准了最终手稿。数据可访问性所有数据可通过ENA登录号PRJEB 45792访问竞争利益作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作。致谢这项研究是由德国环境署资助的GeNNA项目（FKZ 3719 242040）的一部分 所有成员都是成本行动DNAqua-Net（CA 15219）的一部分。D.. B由德国研究基金会（DFG; LE 2323/9-1）资助。我们感谢Kristin Stolberg（LfU）的讨论和使用元条码数据的许可。附录A. 补充数据本文的补充数据可以在https://doi.org/10.1016/j.ese.2021.100122上找到。引用[1] S.L. Pimm，C.N.詹金斯河T.M.阿贝尔Brooks，J.L.Gittleman，L.N.约帕P.H. Raven，C.M.罗伯茨，J.O.塞克斯顿，物种的生物多样性及其灭绝率，分布和保护，科学344（6187）（2014），doi.org/10.1126/science.1246752。[2] 科学政策平台。生物多样性和生态系统服务政府间科学政策平台生物多样性和生态系统服务全球评估报告，IPBES秘书处，德国波恩，2019年。[3] R.E.A. Almond，M. Grooten，T.彼得森《2020年地球生命力报告》，《弯曲生物多样性丧失的曲线》，世界自然基金会，瑞士格兰，2020年。[4] 联合国大会，《改变我们的世界：2030年可持续发展议程》，联合国，2015年。[5] R. Kelly，A. 弗莱明，G.T. Pecl，JuliavonGonner，AlettaBonn，公民科学和 海 洋 保 护 ： 全 球 审 查 ， 菲 尔 。 Trans. Biol. Sci. 375 （ 1814 ） （ 2020 ）20190461，https: