工程16（2022）187神经免疫学研究综述CyTOF技术在脑免疫成分研究中的应用王艳a，b，c，徐宝辉d，薛立祥b，c，e，刘伟a北京大学第三医院神经外科，北京100191b北京大学第三医院医学研究中心，中国c北京大学第三医院医学创新研究院基础医学研究中心，北京100191d美国斯坦福大学医学院血管外科，斯坦福，CA 94305e北京大学第三医院生物样本库，中国阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2021年3月16日修订2021年6月3日接受2021年8月28日网上发售保留字：CyTOF大脑免疫成分神经炎症A B S T R A C T脑是人体中最异质、最复杂的组织。先前的研究表明免疫细胞是健康和病态大脑的重要功能成分。飞行时间流式细胞术（Cytometry by the time of flight，CyTOF）是一种高维度的单细胞检测技术，可以用少量样品测量多达100种细胞标志物。 该技术使得能够在体外对各种细胞类型进行鉴定和表征。的单细胞在稳定状态和患病的大脑条件下的水平。 本文综述了与传统流式细胞术相比，CyTOF技术的三大优势。 我们还讨论了CyTOF在健康和病理大脑中的脑免疫细胞成分研究中的应用。©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 背景大脑是身体中最复杂的器官;它由各种类型的细胞组成，并作为身体的“总部”发挥作用除了神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经胶质细胞外，大脑还有自己的免疫细胞：小胶质细胞。几十年来，人们普遍认为免疫细胞-包括脑驻留和循环免疫细胞-是健康和患病条件下大脑的重要组成部分[1]。例如，在健康大脑的胎儿到成人过渡期间，小胶质细胞需要分化簇69+（CD69+）CD4 T细胞来完成小鼠和人类的这一过程[2]。在病理条件下，Hughes和Appel[3]已经表明，小胶质细胞功能障碍通过髓鞘形成减弱神经元和少突胶质细胞的活性，并且髓鞘异常是神经系统疾病的标志 在神经炎性和神经变性疾病中，包括帕金森病（PD）、多发性硬化症（MS）、阿尔茨海默病（AD）和亨廷顿病（HD），外周免疫细胞的迁移被认为是病理学的开始。因此，请确认-*通讯作者。电子邮件地址：lixiangxue@hsc.pku.edu.cn（L. Xue）。识别和应用表型标记是区分大脑中各种免疫细胞类型的关键。Ter119是一种区分脑残留小胶质细胞与浸润性单核细胞衍生巨噬细胞（MoDM）的独特标志物，这两种细胞类型在病理条件下具有相似的形态和行为[4]。功能分析也是脑免疫组分研究的重要组成部分，并且不限于鉴定脑免疫细胞群。研究表明，相同的免疫细胞在疾病的不同阶段可能发挥不同的作用。例如，在缺血性中风中，MoDM在急性期增强促炎反应，但在慢性期转变为抗炎作用[5]。因此，为了满足日益增长的脑免疫组分的表型和功能研究的需求，需要更详细、精确和高维的技术。然而，传统的免疫学技术，荧光激活细胞分选（FACS），在满足这种信息密集型需求方面具有局限性。飞行时间流式细胞术（CyTOF）是一种使用金属标记抗体的高维、高通量、单细胞分析技术，可同时检测多达100个参数本文综述了CyTOF在脑相关研究中的应用，讨论了CyTOF的基本原理、优点和缺点，https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.06.0222095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engY. 王湾，澳-地Xu和L.薛工程16（2022）187188评估其在脑相关疾病临床诊断中的潜在用途。2. CyTOF是一种系统分析细胞类型的强大技术2.1. 质谱仪CyTOF，也称为质谱细胞术，是一种用于检测细胞表面和细胞内部金属结合细胞标志物的先进技术。它最早由班杜拉等人在多伦多大学发现[6]班杜拉等人采用了电感耦合等离子体质谱法的原理，该原理用于检测流体中的元素材料元素组成材料（例如，镧系元素）在生物系统中丰度极低或几乎不存在班杜拉等人用金属代替荧光染料作为探测器。该技术通常用于一般病理学诊断。2011年，Bendall etal.[7]斯坦福大学的研究人员首先在免疫学领域采用了Bendall等人使用来自人骨髓的单细胞悬液分析了34个参数，以揭示人类造血系统疾病中的差异免疫细胞和药物此后，该技术被应用于免疫学研究，检测面板中的参数数量这种新方法克服了使用传统FACS时出现的荧光团重叠问题[6，8，9]。CyTOF和FACS的比较总结见表1[10]。2.2. CyTOF的原理CyTOF主要基于飞行时间（TOF）质谱仪原理。TOF在确定离子的质荷比方面非常精确在采集过程中，所有离子通过具有已知强度的电场加速离子越重，到达探测器所需的时间就越长。为了进行TOF，细胞被蒸发，只有同位素被保留。CyTOF技术是基于TOF原理开发的，使用与各种离子缀合的抗体。收集离子以确定缀合抗体的表达，从而允许鉴定由抗体限定的免疫细胞类型2.3. CyTOF的三大优势CyTOF有三大优势。首先，CyTOF显著提高了检测能力。当使用这种方法时，条形码技术应用于调查多达20个样品在一个混合器中。由于CyTOF程序需要在染色步骤之前对每个样品进行条形码化，因此所有20个样品都经历相同的染色、洗涤和透化步骤，作为组合。表1CyTOF和FACS的比较。特征CyTOF FACS可检测探针金属探针荧光探针补偿否是最大可检测探头数高达50（~100）20混合样本是（条形码）不常见避光否是染色前修复是否透化是仅当细胞内标记物数据分析相对困难相对容易主要数据分析软件Cytobank Flowjoa存在很少的条形码FACS方案（例如，T细胞四聚体染色[10]）。组合的单个多路复用样品。此程序可最大限度地减少样本之间的差异，以生成更一致和准确的结果。除了样品分离的协调性之外，条形码程序的这种去卷积可以在很大程度上防止不同条形码化样品之间形成细胞双联体，从而减少样品内双联体[11]。此外，一个反应中使用的探针数量从18个（对于FACS）显著增加到40一些研究表明，CyTOF面板可以包括多达100个通道[12]。由于各种免疫细胞类型基于其细胞表面标志物进行鉴定和区分，因此CyTOF允许使用相同样品同时检测更多标志物。在极少数情况下，可能需要多达10个细胞表面标志物来准确定义一种细胞类型。 使用CyTOF技术，检测能力扩展了4-例如，在人外周血单核细胞（PBMC）中，自然杀伤（NK）细胞亚群定义为（CD 45+CD 3- CD 19- CD 20- CD 14- HLA-DR- CD 38+ CD 16+）和髓系树突状细胞（直流电）子集是定义为(CD45+CD3- CD19- CD20- CD14- HLA-DR+ CD11c+ CD123-）[13]第10段。当使用传统的FACS方法时，这些细胞标记物以及活/死染色剂可能占据NK细胞由于其抗肿瘤活性而被用作恶性肿瘤的治疗，其在用各种细胞因子刺激后可显著增加。Vendrame等人[14]使用CyTOF方法研究了细胞因子刺激后的NK细胞库除了典型的细胞表面表型标志物和细胞内功能性细胞因子标志物之外，它们还包括NK细胞受体（NKG 2A、NKG 2C和NKG 2D）、天然细胞毒性受体（NKp30、NKp 44和NKp 46）和杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR 2DL1、KIR 2DL 2/L3/S2、KIR 2DL 3、KIR 2DL 5、KIR 3DL 1、KIR3DL 1/S1和KIR 3DL 2/S2）。KIR3DL2）。这些标志物用于基于其响应于各种细胞因子刺激的差异表达标志物模式对亚NK群体进行聚类[14]。同样，Hansmann等人[15]使用CyTOF发现了一种表达记忆（CD27+）和幼稚（CD24低 CD38+）表型的新型记忆B细胞群。所有这些新发现都利用了CyTOF增强的检测能力其次，CyTOF显著降低了光谱重叠和背景噪声。如Mazza等人[16]所示，当使用多通道荧光流式细胞术方法时，必须考虑背景荧光和扩散误差，因为它们是增加变异性和降低准确度的主要因素。这是因为，CyTOF技术中使用的抗体不是与荧光染料缀合，而是与元素组成材料（例如镧系元素）缀合。这些元素组合物在生物系统中几乎没有或没有表达;因此，CyTOF的背景通常接近于不可检测的水平。此外，重金属同位素之间的检测重叠通常限于小于2%[17]，而传统的FACS具有光谱重叠5%-100%。此外，传统的FACS使用荧光染料作为标签。这些分子具有广泛的分子量，从小的蛋白质异硫氰酸荧光素（FITC）到较大的分子别藻蓝蛋白（APC）。此外，每种荧光染料都有自己的激发和发射[18]。在CyTOF中，金属标签都具有相似的化学特性，因为它们属于镧系元素家族，因此增加了整体灵敏度[18]。Takahashi等人[19]表明，在设计CyTOF面板时，有必要考虑使用具有高强度标记的89 Y，113 In或115 In，因为这三种镧系元素相对较不敏感。尽管如此，一Y. 王湾，澳-地Xu和L.薛工程16（2022）187189××镧系元素使得CyTOF能够提供比传统的FACS方法精确得多的数据第三， CyTOF 可以提供可靠的定量与低数目的细胞输入。Gadalla等人[20]提供了一种方案，该方案能够通过CyTOF对低数量的输入人类细胞进行可靠的定量-当细胞数量有限时，他们的数据表明，CyTOF可以忠实地再现PBMC和肿瘤组织中的FACS数据，从而为癌症临床试验分析中的高维分析提供超过35个参数的可靠染色。来自耶鲁大学的科学家们表明，这种高维技术可以从极其有限的样本量中揭示细胞样本，例如1为了确定使用CyTOF可检测的最小细胞数，Yao等人[13]在连续稀释人外周血后分析了各种免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、髓样DC他们的结果表明，当细胞总数从1 × 106下降到1 × 104 mL-1时，CyTOF显示了相同百分比的来自PBMC的淋巴细胞，连续稀释[13]。3. 细胞飞行时间在健康和病理脑组织中的应用传统的流式细胞术由于荧光光谱的重叠而限制了对多种荧光参数的检测能力。凭借其高维特性，CyTOF能够检查大脑的免疫环境为了显示免疫细胞在幼稚脑（即，健康条件下）和病理条件下，包括神经炎症和神经退行性疾病（图2）。①的人。3.1. CyTOF在健康脑免疫微环境中的应用包括脑、脊髓、视神经和视网膜的中枢神经系统（CNS）不具有经典的淋巴引流系统。因此，大脑传统上被认为是免疫特权器官[21]。然而，越来越多的数据表明，免疫细胞不仅需要预防感染[22，23]，而且在维持健康的大脑方面也发挥着重要作用。3.1.1. 免疫细胞在健康的大脑功能中发挥关键作用在健康条件下，免疫细胞在维持大脑功能方面发挥着关键作用Brynskikh等人[24]表明免疫细胞直接参与大脑学习。具体而言，与野生型小鼠相比，免疫缺陷小鼠或具有适应性免疫耗竭的小鼠的学习结果显著受损[24]。此外，Ziv等人[25]表明，CD4+ T细胞有助于维持成人的神经发生和空间学习。此外，研究表明，适应性免疫的正常功能对于维持精神活动和应对可能导致认知缺陷的条件例如，Kipnis等人[26]表明，T细胞耗尽的成熟小鼠出现认知缺陷和行为异常，但随后在T细胞消除后恢复。值得注意的是，大脑的免疫区室不仅包括驻留免疫细胞-即小胶质细胞-而且还包括浸润免疫细胞。例如，Shechter et al.[27]报道，免疫细胞可以在稳态下通过作为免疫偏斜门的有孔脉管系统包膜进入免疫特权此外，Louveau等人[22]表明，在哺乳动物中存在持续的免疫监视。脑膜间室这些数据表明，免疫细胞在幼稚条件下存在于大脑3.1.2. CyTOF技术揭示了健康大脑由于健康大脑中免疫细胞的数量极低，因此在健康稳态下评估免疫细胞的作用在技术上具有挑战性。当使用传统的FACS方法时，这一点尤其明显。下一代测序（NGS）的最新进展提供了脑的各个部分中的驻留骨髓细胞的基因表达谱[28];然而，测序数据仅显示转录水平的基因表达，而不是蛋白质水平的基因表达。2017年，Korin等人[29]使用高维CyTOF技术系统审查了免疫群体并表征了幼稚小鼠的脑免疫区室。他们使用44种细胞表面标记物首次描述了幼稚脑中的免疫细胞亚群，包括CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞和DC[29，30]。值得注意的是，通过比较脑中的免疫细胞组成与外周血中的免疫细胞组成，CD44被鉴定为脑浸润白细胞的标志物[29]。2018年，Mrdjen等人[31]进一步证明了正常CNS中存在大量白细胞，包括脑驻留小胶质细胞和巨噬细胞样细胞、经典DC（cDC）、pDC、B细胞、NK细胞和自然杀伤T（NKT）细胞。3.2. CytTOF在病理性脑组织免疫微环境研究中的应用来自内部或外部刺激的挑战引起大脑炎症，即所谓的神经炎症。在神经炎症期间，白细胞的景观发生显著变化;然而，常用的图像依赖性免疫组织化学或传统的FACS使用少量样品鉴定各种类型的免疫细胞的能力有限。CyTOF是一种高维单细胞检测技术，可以全面揭示神经退行性变和神经炎症过程中的白细胞图谱和整个免疫景观。3.2.1. CytTOF在神经退行性疾病研究中的基于先前创建的免疫人群蛋白质组图谱[6，32]，Becher等人[32]使用CyTOF，使用神经变性小鼠模型广泛表征各种白细胞亚群。他们确定了稳态CNS期间的免疫景观。结合功能测定，这些学者鉴定了位于CNS区域的免疫细胞群，与实质相反-即CNS边界相关巨噬细胞（BAM），其可通过CD 38和主要组织相容性复合物II类（MHCII）区分[32]。他们还将小胶质细胞，DC和单核细胞鉴定为幼稚脑中的独立群体，并辅以广泛的细胞表面和蛋白质表型标记物。这些数据后来得到了Mrdjen等人[31]和Korin等人[29]的证实，他们通过比较稳态和病理条件下的数据揭示了额外的免疫细胞群。发现活跃的小胶质细胞表达更高水平的CD11 c和CD 14，伴随着不受调节的CD 86和CD 44以及程序性死亡配体-1（PD-L1）表达的下调[31]。还发现小胶质细胞中MHCII的表达略有增加，而小胶质细胞稳态检查点标志物趋化因子使用小鼠自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型和MS小鼠模型，Mrdjen等人[31]报告称，大多数浸润细胞为单核细胞来源的细胞，其次为T细胞。从表型上看，常驻小胶质细胞是Y. 王湾，澳-地Xu和L.薛工程16（2022）187190图1.一、 CyTOF实验程序概述。样品从人类活组织检查或动物模型中收集对于抗体制备，使用具有独特重金属同位素的缀合抗体为了制备脑单细胞悬液，首先将这些单细胞染色为活细胞或死细胞，然后用特定的条形码标记。单细胞用离子偶联抗体染色使用CyTOF机器测定获得的标记的单细胞数据分析可以使用Cytobank进行，并使用（但不限于）密度归一化事件的生成树进展分析（SPADE）、基于t分布随机邻居嵌入（viSNE）的高维单细胞数据的可视化、热图、主成分分析（PCA）或均匀流形近似和投影（UMAP）来表示EAE：脑脊髓炎; AD：阿尔茨海默Nd 142、Nd 145、Nd 150和Ir 191代表各种CyTOF通道; Tom、Tem和Tslec代表由CyTOF鉴定的各种细胞类型Y. 王湾，澳-地Xu和L.薛工程16（2022）187191最活跃的细胞，如表型标志物的激活所证明的[31]。与AD中的免疫应答相似，EAE模型中小胶质细胞稳态检查点标志物CX 3CR 1、MerTK和Siglec-H的表达降低，而CD 86、PD-L1和CD 44的表达增加。与EAE模型相反，AD小鼠模型中CD 14的表达降低，而Sca-1的水平升高[31]。在另一项研究中，Ajami等人[33]在EAE小鼠模型中使用CyTOF发现了三种新的CD11b+脑髓样细胞群，并分别将这三种细胞群命名为A、B和C。这些髓样细胞群仅在脑中发现，并且在外周血中不存在所有三种细胞群均表达典型的CD 45、CD 11b、CD 317和CD 39标记物。群体B和C也表达MHCII和CD86，而群体A为MHCII和CD86阴性。MHCII和CD 86先前已被鉴定为髓样细胞活化标志物[34]，表明群体B和C-而不是群体A-是活化的小胶质细胞群体[33]。利用信号表型标记物，包括转录因子和信号传导因子，如磷酸化信号转导子和转录激活子（STAT）转录因子（pSTAT 1、pSTAT 3、pSTAT 5）、磷酸化环磷酸 腺 苷 （ cAMP ） 反 应 元 件 结 合 蛋 白 （ pDREB ） 、 磷 酸 化 激 酶（pMAP-KAPK 2）和核因子-jB（NF-jB），Ajami等人[33]表明，群体B和C高度表达这些信号蛋白，而群体A则不表达。这些结果证实群体B和C确实是具有高表达功能标记的活性群体。为了进一步研究这三种细胞群的功能，使用HD模型中的R6/2小鼠和过表达突变型人超氧化物歧化酶的小鼠作为肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型[35][33]。在HD小鼠模型中，所有三种细胞群在疾病进展之前和期间都存在。此外，种群A和B的频率增加，而种群C的频率保持不变。在HD进展过程中的低水平。ALS小鼠模型中小胶质细胞群体的增加与先前关于HD模型中小胶质细胞数量增加的报道一致[35]。总之，本研究系统地研究了免疫细胞的活性状态，特别是三组不同的小胶质细胞（A，B和C）的活性状态。与神经退行性疾病条件下相比，它们的表型在稳态下显示出显著变化，提供了关于脑免疫反应的深入信息。此外，Willis等人[36]在MS小鼠模型中使用CyTOF鉴定了独特的CD8+T细胞群。Guilliams等人[37]提出了一种有效的方法来鉴定各种小鼠组织中的DC群体，包括肺、脾、肠、肾、肝和脑，使用无监督的质量细胞计数方法。他们的数据还揭示了人和小鼠组织中DC的异质性，这在以前使用常规细胞术尚未完全鉴定或定义[37]。3.2.2. 细胞飞行时间是一种系统研究缺血性脑卒中引起的神经炎症中风是人类死亡的主要原因之一，全球每年导致620万人死亡[38]。缺血性卒中-最常见的急性脑血管疾病-占全球卒中病例的约80%[39]。缺血损伤诱导神经功能缺损，包括微血管衰竭、脑血屏障（BBB）损伤、氧 化 应 激 和 脑 水 肿 [40] 。 死 亡 的 神 经 元 释 放 损 伤 相 关 分 子 模 式（DAMP），进一步导致缺血半球的神经炎症[41]。这种局灶性脑炎症加重了继发性脑损伤，并诱导了随后的脑炎症[42]。经过20多年的研究，现在人们普遍认为免疫反应起着重要作用。在缺血性卒中后的组织损伤和愈合过程中发挥关键作用[43]。先前的研究表明，各种免疫细胞参与缺血诱导的脑炎症，如脑驻留小胶质细胞[44]、浸润性T细胞[45-49]、单核细胞[5，50]、NK细胞[51]和中性粒细胞[52]。例如，为了探索不同T细胞亚群的功能，使用严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（具有免疫缺陷的动物小鼠）。一B6遗传背景技术），CD8不细胞缺陷小鼠（B6.129S2-Mapk9tm 1 Flv/J）和CD 4 T细胞受损的小鼠（B6.129S2-H2dlAb 1-Ea/J）进行大脑中动脉闭塞（MCAO）手术。两天后，野生型小鼠的梗死面积显著大于CD 8-和CD 4-小鼠，表明T细胞亚群在梗死面积和卒中结局中发挥作用[49]。此外，Gu等人[49]使用辅助性T细胞1（Th 1）免疫缺陷小鼠（B6.129S2-Mapk 9tm 1Flv/J）、Th 2免疫缺陷小鼠（C57 BL/6-Il 4tm 1Nnt/J）和调节性T细胞（Treg）免疫缺陷小鼠（B6.129X1-Ebi 3tm 1Rsb/J）进行了相同的手术，结果显示Th 1免疫缺陷小鼠脑梗死减少，而Th 2免疫缺陷小鼠脑损伤加重。提示Th1 CD4 T细胞具有促炎功能，而Th2 CD4 T细胞具有抗炎功能。除T细胞外，外周浸润性白细胞，如单核细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞发挥重要作用。例如，Fang等[5]显示，Ccr2敲除（KO）小鼠在MCAO后的急性期比野生型小鼠具有更小的梗死面积和Gan等人[51]表明，缺血后NK细胞通过神经元衍生的趋化因子C-X3-C基序配体1（CX 3CL 1）积聚。比较Rag 2-KO小鼠（缺乏T、NKT和B细胞）和Rag 2和cc双KO小鼠（缺乏T、NKT、B和NK细胞）的梗死面积，Gan等人[51]表明双KO小鼠（缺乏NK细胞）的梗死面积较小，表明NK细胞也会导致脑梗死，并且不依赖于T和B细胞。此外，已发现中性粒细胞参与卒中诱导的神经炎症并决定卒中结局[52]。肌球蛋白1f是一种免疫细胞迁移相关基因，在中性粒细胞中高度表达[53]。我们的研究表明，Myosin 1f-KO小鼠的神经功能缺损程度较低，梗死面积小于野生型小鼠，这表明嗜中性粒细胞在脑免疫应答中的作用[52]。然而，由于其有限的通道数量，传统的FACS技术不能用于使用相同的样品整合与这些免疫细胞变化相关的信息，或提供中风诱导的神经炎症的完整图片[46]。CyTOF无疑是系统揭示免疫反应图谱的更好选择。基于先前的FACS通道，我们设计了金属缀合的CyTOF板，以使用小鼠模型在中风后的多个时间点表征缺血性脑、外周血、脾和骨髓中的免疫组分。我们定量了MCAO后1 - 14天这些器官使用CyTOF，我们定量了来自同一缺血脑半球样品的淋巴细胞、巨噬细胞/小胶质细胞和DC，从而界定了采样期间的采集和处理误差为了更好地理解免疫细胞在组织间的相互作用，我们首次应用R编程来分析来自脑、外周血、脾和骨髓的免疫细胞之间的网络，目的是分析这些免疫细胞在不同器官和不同时间段之间的联系我们的数据显示，在缺血性中风后一天，全身的免疫细胞已经这一结果使我们能够更好地了解中风后的免疫反应，Y. 王湾，澳-地Xu和L.薛工程16（2022）187192多器官方面，为中风临床治疗提供了新的思路[54]。3.2.3. CytTOF在脑肿瘤研究中的原发性和转移性脑肿瘤是20-39岁年轻人癌症的第三大原因目前的标准治疗，如手术、化疗和放疗，仍有许多局限性，中位生存期仅为5此外，高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）只允许选择性的一组患者受益于免疫治疗。此外，程序性死亡-1（PD-1）阻断的临床试验（NCT 02017717）未显示复发性胶质母细胞瘤（GBM）的生存获益[57，58]。作为最异质的组织，脑TME不仅包含脑独特的驻留免疫细胞小胶质细胞，而且还包括来自外周的因此，定义脑肿瘤的免疫特征有助于理解肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用，这可能有助于预测免疫治疗结果[59]。为了鉴定肿瘤特异性侵入白细胞，Becher et al.[32]使用总共两个CyTOF组和74个参数，使用38个离体手术胶质瘤、脑转移瘤（BrM）和非肿瘤癫痫标本来全面评估骨髓细胞和谱系免疫他们的研究结果表明，胶质瘤和BRM具有不同的TME。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是胶质瘤中的主要免疫细胞，而肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是脑中的主要免疫细胞Kiss等人[60]表明，TME定义了TAM使用CyTOF技术，Friebal et al.[55] 表 明 TAM 是 由特 定 类型 的 肿瘤 驱 动的 例 如， 在 GBM 中 ，CD206+外周MoDM促进肿瘤抑制环境，特别是在世界卫生组织II级和III级肿瘤中。Fu et al.[61]证实，在初始和复发性GBM中，胶质瘤相关的小胶质细胞/巨噬细胞（GAM）是主要的免疫细胞，并有助于免疫抑制特征。与TAM聚集的大脑相反，外周脑肿瘤此外，在2018年，Alban et al.[62]使用CyTOF分析了259例GBM患者的血液样本，以研究免疫系统的变化。他们的数据显示，在新诊断的胶质瘤患者中，髓源性抑制细胞（MDSC）随着时间的推移而减少。此外，GBM患者的生存时间较长，而低级别胶质瘤患者的外周MDSC减少[62]。当Alban etal.[62]比较血液以确定肿瘤类型之间和疾病进展过程中免疫系统的变化，他们的数据显示GBM患者血液中非免疫抑制性常规T细胞的细胞数量增加。使用比较性CyTOF分析，Khalsa等人[63]表明，在GBM小鼠模型中，惰性肿瘤具有大量耗尽的CD 8 T细胞和驻留的巨噬细胞，而具有较少的嗜酸性粒细胞和Siglec-F+巨噬细胞。GBM患者的肿瘤浸润免疫细胞（TIIC）表型与这些患者的血液淋巴细胞表型显著不同[63]。除了GBM之外，CyTOF技术还被应用于弥漫性Fu等[64]用33个标记物分析了10个DA和4个OG临床样品中的免疫区室他们的数据显示，DA中肿瘤相关的小胶质细胞和巨噬细胞比OG中呈现出更高的免疫抑制特征此外，DA组PD-1+ CD 8+ T细胞、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3（TIM-3）+CD 4+T细胞和T细胞亚群均增加，可能促进了免疫抑制微环境的形成。值得注意的是，使用CyTOF的已发表数据一致表明脑内驻留的小胶质细胞和外周浸润的巨噬细胞都是各种脑肿瘤中的主要免疫成分。因此，了解TAM的功能将有助于脑TME的研究。3.2.4. CyTOF在脑癫痫研究中的据估计，全世界有超过1050万儿童可能患有活动性癫痫[65]。先前的研究表明，癫痫诱导的神经炎症在病因学和惊厥性疾病中起关键作用[66]。Owens等人[67]使用20种抗体标记物检测了10名儿童癫痫患者的脑浸润淋巴细胞（BIL），并使用CyTOF对其进行了分析。他们的数据显示，活化的T细胞，包括CD4、CD8和cdT细胞，在所有病例中都存在，这表明在那些严重癫痫发作的年轻患者中已经发生了自身免疫反应。利用CyTOF的高通量特征，他们进一步表明，T细胞几乎仅在BIL中，而在所有BIL部分中发现了CD 4 T细胞（CD 45 RO+、HLA-DR+和CD 69+）的活性效应记忆群体。此外，这些细胞还表达4. CyTOF在小胶质细胞研究中的应用小胶质细胞占成年CNS细胞的10%。在胚胎期，小胶质细胞的异质性达到最高点，而这种异质性在新生儿、幼年和成年阶段逐渐降低[68]。作为大脑在健康条件下，小胶质细胞在功能上支持神经元的发育，修剪突触，并使死亡细胞复活[70]。在疾病条件下，小胶质细胞对改变的环境做出反应并变得活跃，同时它们的异质性显著增加[68]。与其他免疫细胞类型相同，小胶质细胞是病理性脑中的主要免疫细胞类型[71]。它们所有高度多样化的功能使小胶质细胞成为大脑中最异质的细胞类型之一。基于小胶质细胞的高度异质性特征使用单细胞测序，Sankowskiet al.[71]和Masuda et al.[72]研究了小鼠和人类小胶质细胞的时空异质性他们的数据表明，在小胶质细胞中，不同的基因在发育和疾病阶段受到不同的调节。他们的结果显示MS[72]和人脑胶质瘤[71]中小胶质细胞的RNA表达异常。随着最近出现的CyTOF技术，该技术揭示了可用于提供相关途径信息的其他改变的标志物[68]。更具体地说，使用小鼠模型，Mrdjen等人[31]和Ajami等人[33]研究了实验性自身免疫性EAE模型和ALS模型，并报道了疾病阶段的小胶质细胞在细胞表面和功能标志物方面显示出显著变化。此外，CD44还可作为区分脑细胞和外周血细胞的标志物为了了解人类小胶质细胞的异质性，Böttcher等人[73]应用CyTOF并检测了来自五个不同脑区的人类小胶质细胞中57个标志物的表达。他们的CyTOF数据显示，标记物的较高表达与小胶质细胞活化密切相关此外，这些标记是空间依赖性的，Y. 王湾，澳-地Xu和L.薛工程16（2022）187193因为与其他脑区相比，它们主要在丘脑中表达[73]。在2019年，Sankowski等人[71]结合了单细胞测序和CyTOF技术，并表明胶质瘤相关的小胶质细胞具有疾病相关的特征。使用基因本体富集分析，显示最显著的变化与炎症反应（包括白细胞-细胞粘附、干扰素（IFN）- c反应和吞噬能力）和氧化应激反应密切相关此外，他们的数据指出，人类胶质瘤中小胶质细胞的代谢发生变化;具体而言，载脂蛋白E（APOE）主要在将血浆或间质液中的脂蛋白或脂质复合物结合至特定细胞表面受体方面发挥作用[74]。据报道，APOE在小胶质细胞中的表达在神经变性疾病中具有功能，特别是在调节小胶质细胞表型方面[75]。Sankowski等人[71]表明APOE也是在胶质瘤相关的小胶质细胞中不受调节，这进一步表明在脑疾病相关的小胶质细胞中脂质代谢和活化之间可能存在密切关系。5. SynTOF：CyTOF在脑突触研究中的应用SynTOF的应用，即CyTOF在脑突触研究中的应用神经元突触在信号传递中起着关键作用;然而，由于其复杂性和异质性，研究各种细胞之间的生物标志物表达具有挑战性。Gajera等人[76]是第一个采用CyTOF来分析人类突触体的人，来自大脑的富集神经元终端，并将这种方法命名他们用一种特定的神经元标记物小组对收集到的突触中的单个细胞进行染色，以确定突触体。该标记物组包括对脑细胞类型特异的表型标记物（例如，CD11b、CD56、CD298、胶质细胞酸性蛋白（GFAP ）和髓鞘碱性蛋白（MBP ））和突触（例如，CD47、多巴胺转运蛋白（DAT）、去甲肾上腺素转运蛋白（NET）和谷氨酸转运蛋白）。该小组还包括几个功能性标记物，如参与自噬的微管相关蛋白1轻链3 β（LC 3B）、氧化损伤的3-硝基酪氨酸和蛋白酶体降解的K48-泛素[76，77]。然后使用密度归一化事件的生成树进展分析（SPADE）[78]和基于t分布随机相邻嵌入（viSNE）的高维单细胞数据的可视化[79]对SynTOF数据进行可视化和分析。6. 结论和展望在复杂的异质组织中，特别是在脑中，在单细胞水平上研究细胞标志物及其表型是具有挑战性的。在神经炎症期间，外周白细胞通过BBB迁移到大脑中，导致更复杂的大脑微环境。高维度的CyTOF技术，其显着增加的染色通道数量，使用更少量的样品，使得有可能在单细胞水平上“看到”由各种免疫细胞，肿瘤细胞或突触组成的整体图像。它还提供了深入了解细胞的表型标志物如何与其功能和细胞信号传导相关联的机会。更重要的是，CyTOF使我们有可能概述网络复杂的细胞亚型及其关系（图）。 2）的情况。6.1. CyTOF的局限性与传统的流式细胞术和其他方法相比，CyTOF显示出了显著的优势然而，一些缺点是难以克服的。首先，细胞在采集阶段被破坏。因此，在使用CyTOF之后，可能仍然需要FACS分析和细胞分选，以便鉴定感兴趣的细胞。其次，抗体制备和标记的成本仍然过高，阻碍了CyTOF第三，虽然技术上质量通道之间没有信号干扰因此，最佳面板设计是图二、 质谱细胞术（Mass cytometry，简称CyTOF）可在稳态和病理条件下识别脑免疫细胞和突触。（a）在健康的幼稚大脑中，CyTOF技术可以检测到少量的免疫细胞。（b）在神经炎症条件下（包括神经退行性疾病、中风和脑肿瘤），CyTOF技术可以鉴定各种免疫细胞的表型、功能和活化标志物（c）在老化的大脑中，这种方法可以揭示免疫细胞的状态。带分支的细胞代表小胶质细胞（蓝色代表幼稚状态，红色代表病理状态）;紫色和粉红色的多核细胞代表粒细胞，深/浅蓝色细胞代表淋巴细胞，红色实心圆代表趋化因子，绿色实心圆代表细胞因子。（d）SynTOF可以使用细胞类型标记（蓝线）或功能标记（黄/红线）揭示突触的类型Y. 王湾，澳-地Xu和L.薛工程16（2022）187194这是为了使信号最大化并使干扰最小化而需要的。Takahashi等人[19]使用PBMC作为实验材料来优化CyTOF面板设计。 他们的结果表明，信号强度、标记物强度、通道灵敏度和信号干扰动力学是应考虑的基本因素[19]。更具体地说，相对强的标记物，如CD45，应与89Y、113In或115In配对，因为这些同位素相对较不敏感[19]。与传统的FACS一样，CyTOF的主要功能是通过细胞表面和细胞内标志物表达来检测和分析免疫细胞群体及其亚型。2013年，Newell等人[80]开发了一种将四聚体染色与CyTOF相结合的技术，以促进T细胞表位定位和表征。 该方法可以使用人血液样品筛选多达109个肽-MHC四聚体。如果这项技术可以用于脑相关研究，它将有助于我们确定衰老过程和脑相关疾病中可能的表位。该方法可能特别适用于脑感染，以预测哪些表位将被个体中的T细胞识别[81]。最后，CyTOF主要用于研究各种免疫成分;然而，尚不清楚该技术将如何推进其他研究领域的研究[76]。令人鼓舞的是，看到了一些CyTOF的初步应用，从床边研究细胞群及其在各种人类疾病中的功能，如脓毒性休克[82]、风湿性疾病和黑色素瘤[83]6.2. CyTOF与单细胞测序技术结合的新趋势单细胞测序和CyTOF的结合已经成为在单细胞水平上快速准确地研究基因信息、表达和功能更重要的是，这两种技术是互补的，因为单细胞测序提供转录水平的遗传信息，而CyTOF显示翻译水平的基因表达水平自2014年以来，已经有一些深入的大脑研究在他们的研究中应用了单细胞测序Patel等人[84]应用单细胞RNA测序来揭示原发性GBM中的肿瘤内异质性Pollen et al.[85]使用低覆盖率单细胞信使RNA（mRNA）测序显示了异质发育大脑皮层中的激活信号通路。随着测序技术的迅速升级，这项技术现在不仅可以揭示序列信息，还可以显示DNA和RNA中的基因修饰，如甲基化[86]。与单细胞测序类似，CyTOF是一种高通量和高维技术。然而，与测序技术相比，CyTOF可以在蛋白质表达水平上揭示信息因此，结合这两种技术可以在单细胞水平上提供更全面的地图。这种类型的组合研究已应用于泪腺再生[87]和人PBMC异质性研究[88]。由于脑是一种异质性最强的组织，因此，这种结合将成为一种很有前途的方法，以揭示更全面的脑图像，包括在不同生物条件下或在不同发育阶段的遗传和蛋白质信息变化。例如，Sankowski et al.[71]使用小鼠模型，通过CyTOF和单细胞RNA测序利用基于单细胞的免疫表 型 分 析 来 分 析 小 鼠 中 小 胶 质 细 胞 和 其 他 CNS 相 关 巨 噬 细 胞（CAM）单细胞测序和CyTOF的特征见表2[32，78，79，89新的方法也出现了，例如通过测序对转录组和表位进行细胞使用荧光肽标记的抗体，CITE-seq可以通过测序同时测量单细胞转录组和表面蛋白[97]。2017年，Peterson et al.[98]开发了一种组合方法，使用液滴微流体在单细胞水平上用DNA标记的抗体测量基因和蛋白质表达水平，他们称之为他们的数据显示，该方法可以在单个工作流程中检测超过20，000个基因，并使用82种条形码抗体定量蛋白质这两种方法都可以在转录和翻译水平上提供高通量的细胞信息因此，这两种方法可能提供未来的方法来检测信息在RNA和蛋白质水平的脑免疫成分的研究在单细胞水平。6.3. CyTOF与成像质谱联用的新趋势最近，已经开发了新技术来扩展CyTOF的检测维度，从研究悬浮液 中 的 单 细 胞 到 分 析 石 蜡 包 埋 的 组 织 切 片 。 成 像 质 谱 细 胞 术（IMC）于2014年首次进行[99]。在这种方法中，激光烧蚀应用于分析使用惰性气体的粒子羽流图像可以通过IMC从组织切片扫描仪重建，使该方法与显微镜相当[100]。与IMC类似，通过飞行时间的多路复用离子束成像（MIBI-TOF）是可以使用的新的趋势技术通过以亚细胞分辨率定量完整组织大区域中多种蛋白质的空间分布，研究单个细胞的表型与多细胞结构功
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