全雌鲤的培育成功使用cyp17a1缺陷型新鲤鱼的

工程8（2022）181研究基因工程-文章全雌鲤的培育成功使用cyp17a1缺陷型新鲤鱼的翟刚a，b，舒婷婷a，b，陈匡新a，b，楼启勇a，贾静怡c，黄剑飞a，b，史创a，b，夏进a，何江燕a，姜东火d，钱雪巧d，胡伟a，b，e，詹寅a，b，e，刘伟a中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室，武汉430072b中国科学院大学高等农业科学院，北京100101c华中农业大学水产学院，湖北d广东海德集团有限公司海德研究院，有限公司、邮编：511400中国科学院种子设计创新研究院，北京100101阿提奇莱因福奥文章历史记录：2021年1月7日收到2021年3月14日修订2021年3月15日接受2021年8月17日网上发售关键词：鲤性二型生长CYP17A1性类固醇全女性人口A B S T R A C T由于某些养殖鱼类在生长过程中的两性异形，单性别鱼类的生产对于水产养殖业是理想的。如今，最广泛使用的技术单性别鱼类种群大量繁殖的主要原因是性类固醇诱导的性逆转。在这里，一种新的策略，成功地生产全雌性（AF）普通鲤鱼（鲤），为了利用在该物种中记录的生长中的两性异形，已经使用基因工程通过单基因靶向操作而不使用任何外源激素处理来开发。首先使用成簇规则间隔的短回文重复序列 /CRISPR相关内切核酸酶9（CRISPR/Cas9）技术获得雄性和雌性杂合cyp 17 a1缺陷型鲤鱼。无论个体的性别决定基因型（XY或XX）如何，已经观察到纯合cyp17a1缺陷鲤鱼的全雄性表型。 一种新发现的雄性特异DNA标记在本实验室用PCR方法从CYP17A1基因缺失的新鲤群体中筛选出XX基因型的新鲤。这些新雄性鲤鱼发育正常的精巢结构，具有正常的精子发生和精子能力。采用人工受精的方法将新鲤与野生型（WT）鲤（cyp 17 a1+/+XX基因型）进行交配。结果表明，所有新雄性-野生型雌鱼交配的AF后代样本鱼均为cyp 17 a1+/-XX基因型，受精后8个月（mpf）性腺至卵巢发育正常率为100.00%。总共1000尾鲤鱼鱼种，500尾来自WT公鱼和母鱼，500尾来自新公鱼和WT在同一个池塘里混合饲养。CYP 17 a1+/-XX雌鲤的平均体重分别我们的研究表明，第一次成功生产的单性硬骨鱼种群的优势，在生长过程中的两性异形的基因操纵，针对一个单一的基因座。©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍在过去几年中，水产养殖业的粮食产量增长最快[1]。单性鱼生产在水产养殖中是理想的，因为一些鱼类在生长中表现出两性异形，其中一种性别比另一种性别生长得更快鱼类还表现出多种多样的性别决定机制*通讯作者。电子邮件地址：zyin@ihb.ac.cn（中）阴）。性别决定包括遗传性别决定和环境性别决定。然而，鱼类的性别决定通常比大多数哺乳动物更具可塑性。这一现象已在多种鱼类中得到很好的证明，其中在性别分化期间通过施用外源性类固醇激素可以逆转表型性别分化，改变个体的表型性别（如新雄性或新雌性鱼类）。例如，已经广泛报道，通过施用外源性雌激素（雌二醇）、雄激素（睾酮）或芳香化酶或雄激素受体的抑制剂，https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.03.0262095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engG. 翟氏T.Shu，K.Chen等人工程8（2022）181182[2因此，性逆转的激素诱导是渔业中大规模生产单性或不育鱼类种群的最广泛实践的技术之一。然而，由雌激素诱导的性逆转的产生和维持是不稳定和费力的，具有相对较长的饲养期[6]。此外，由于养鱼生产系统中使用的与鱼类有关的化学品的内分泌干扰作用，人们越来越关注人类健康和环境后果[7]。一些研究报道，使用温度和光周期与性不稳定诱导可能作为一种替代调节硬骨鱼性别。然而，只有性别偏见的人口可以实现这些操作[8，9]。因此，迫切需要开发利用基因工程获得单性或不育鱼类种群的性别逆转方法。鲤鱼（Cyprinus carpioL.）是第三大淡水养殖品种，因其生长特性和高经济价值而在世界范围内广泛种植。据报道，鲤鱼具有XX/XY型GSD。鲤鱼的生长是两性异形的，雌性的生长速度至少比雄性大10%，特别是在幼鱼阶段之后[10，11]。Wu等人[12]在该研究所进行了产生全雌性（AF）种群的先前尝试，他们发现通过雌核发育产生的XX基因型后代在用17α-甲基睾酮处理后可以转化为新雄马。更重要的是，表型为雄性但基因型为XX的新雄猴与野生型（WT）雌猴人工受精后可产生AF后代。除了使用17α-甲基睾酮外，还广泛报道了通过给予芳香酶抑制剂来曲唑和雌激素受体调节剂他莫昔芬可以逆转鲤鱼的性别控制[6]。在鱼类物种中已经鉴定了几个性别决定基因，包括dmY[13]，gsdfY[14]，sox3Y[15]，amhy[16，17]，[2019-02- 18] [2019 -02- 19][2019 - 02- 21][2019 - 02][2019 - 01][2019 - 019][2019-考虑这些潜在的性连锁标记和性别决定基因是必不可少的性别决定机制的调查然而，作为硬骨鱼性别分化研究的理想模型，鲤鱼性别决定基因的研究尚未见报道。青鳉是另一个著名的淡水鱼模型，具有XX/XY GSD系统[23]。Cyp 17 a1是细胞色素P450酶家族的一员，以前曾报道是合成17-羟孕酮的关键酶，17-羟孕酮是睾酮和雌二醇的前体。利用在P450c17基因中含有功能缺失突变的天然scl突变青鳉品系，已经证明该基因的缺失导致scl突变雄性（XY）和雌性（XX）的第二性征（SSC）的丧失，但不损害scl突变雄性（XY）的精子发育。有趣的是，在XXscl突变青鳉的性腺中，在双线期（受精后6个月（mpf））观察到精子和卵母细胞[24]。最近，我们培育出了cyp17a1缺陷的斑马鱼。在cyp17a1缺陷的斑马鱼中观察到能够正常精子发生和精子的全雄性表型然而，也记录了受损的雄性典型SSC和交配行为[2，25，26]。结合对scl青鳉的观察，这些结果证实了性类固醇对于雄性典型的SSC和交配行为是不可或缺的[2，24，26]。先前已经报道了实验室斑马鱼模型中GSD系统的丢失[27]。因此，这是有趣的，知道是否类似的表型cyp 17 a1-缺陷斑马鱼，如全雄性纯合子，其中包括潜在的新雌鱼种群，可以实现在cyp 17 a1-缺陷的普通鲤鱼与报告的GSD系统。在本研究中，我们的目的是产生AF普通鲤鱼，使用CYP17A1 敲除以产生新雄性鱼类和继代随后在对照雌鱼和新雄性鱼之间进行人工受精。首先，在cyp17a1缺陷型鲤鱼中也观察到了与cyp17a1缺陷型斑马鱼在性别分化和性别特征方面相似的表型，即全雄性纯合子，没有雄性典型的SSCs。第二，cyp 17a1-/-XX基因型普通鲤鱼（称为新鲤），其发育为具有正常发育的睾丸结构、精子发生和精子能力的生理雄性，与WT雌性（cyp 17 a1+/+XX）交配。 第三，对人工交配产生的子代鱼进行雄性特异性标记检查，并进行组织学分析。结果表明，AF组子代鱼均为cyp 17 a1+/-XX基因型的雌性，且卵母细胞发育正常（100.00%，n= 81）。最后，在来自AF组和WT组的1000条鱼之间进行生长比较，AF组和WT组以1：1的比例混合并在同一池塘中培养。体细胞生长的性别二型现象早在8 mpf，AF组的平均体重比WT对照组高6.60%。总之，我们的研究证明了在水产养殖业中首次成功生产AF常见鲤鱼种群，而水生环境中没有类固醇激素污染物。2. 材料和方法2.1. 动物用于本研究中所有实验的黄河鲤鱼购自中国河南省郑州市的一个养鱼场。饲养所有的鱼，并进行所有的实验，根据《实验动物管理和使用指导原则》，并经中国科学院水生生物研究所批准（附录A）。2.2. Cyp17a1基因敲除成簇的规则间隔的短回文重复序列/CRISPR相关核酸内切酶9（CRISPR/Cas9）策略用于cyp 17 a1敲除。针对鲤鱼cyp17a1第一外显子的两个序列的向导RNA （gRNA ）如下：GGCATGAACAGAAAAGCCA和GGGAGTGATGG。GAGGCTTGG。将两个靶位点的gRNA转录并用Cas9重组蛋白和缓冲液注射到胚胎中（附录A）。2.3. 雄性特异性标记鉴定如前所述，基于DNA测序、从头基因组组装、读数作图和雄性特异性测序过滤鉴定雄性特异性标志物[28]（附录A）。2.4. 基因型检测本研究以基因组DNA为模板进行基因型检测.用于cyp17a1基因型鉴定的引物见表1，DNA提取程序详见附录A。2.5. 睾丸睾酮测量如前所述[2]（附录A第S5），测量睾丸中的睾酮浓度。简言之，样品制备后，酶联免疫吸附测定（ELISA）缓冲液、洗涤缓冲液、ELISA标准品、睾酮AChEG. 翟氏T.Shu，K.Chen等人工程8（2022）181183表1本研究中使用的引物。试验和靶基因引物方向和序列（50产品尺寸（bp）基因型鉴定（以基因组DNA为模板）CYP17A1- 1F：CCGATGACACTTAGATAGTTG717雄性特异标记R：CATGTTGGCTGCAGTGATACTCF：GAGCATCCACTGTCAACTT1209R：ACTCTTCCCAAACACTGATTcyp17a1验证（cDNA用作模板）CYP17A1- 2F：GAAGAGCTGGAGAACACTTG924R：CCAACATCATGAGTGCTGGTGqPCR胰岛素样生长因子3F：GGCTTGTGTTTCTGAGGCAA167insl3R：TGTGTCAGTGGAAGGATGCTGTF：CCTGATTCAGACCTTCACTTCGC181R：GCTCTGCTGGTGGGCTTATGTGb-肌动蛋白F：GCTATGTGGCTCTTGACTTCGAR：CCGTCAGGCAGCTCATAGCT85F：正向引物; R：反向引物; bp：碱基对; qPCR：实时定量聚合酶链反应; cDNA：互补DNA。示踪剂和睾酮ELISA抗血清制备。根据说明书设置平板。在405和420nm之间的波长下读取板，并使用Cayman计算机电子表格进行数据分析。2.6. 组织学分析对cyp 17 a1+/+XY鱼、cyp 17 a1-/-XY鱼、cyp 17 a1+/+XX鱼和cyp 17a1-/-XX鱼的性腺进行解剖学检查和组织学分析（苏木精和伊红染色）切片和染色程序按照详细描述进行[29]（附录A第S6）。比例尺在每个图像中提供。2.7. RNA提取和互补DNA（cDNA）合成RNA提取和cDNA合成按照详细描述进行[2]（附录A第S7节）。利用该cDNA进行cyp 17 a1基因型鉴定和胰岛素样生长因子3（IGF 3）和胰岛素样3（insulin-like 3）的实时定量聚合酶链反应（qPCR）。表1中列出了以cDNA为模板用于cyp17a1基因型确认的引物。2.8. 实时定量聚合酶链反应（PCR）根据制造商的说明书（附录A中的第S8节）使用Bio-Rad实时系统（Bio-Rad Systems，USA）用于igf 3、insl 3和b-肌动蛋白的qPCR的引物列于表1中。2.9. 扫描电子显微镜根据附录A中提供的详细描述，使用扫描电子显微镜（SEM）进行精子形态学检查。2.10. 统计分析使用GraphPad Prism 8软件（Graph-Pad软件，USA）分析数据。所有结果均表示为平均值±标准差（SD）。使用Student t检验评估差异对于所有统计学比较，认为结果具有统计学显著性（P0.05）。3. 结果3.1. 鲤鱼雄性特异DNA标记的鉴定通过对鲤鱼雌、雄基因组的比较分析，获得了一个含1209个碱基对的候选雄性特异性序列。用来自不同来源的同质和非同质群体的鲤鱼DNA样品，通过PCR测定对该DNA片段进行雄性特异性验证（附录A中的第S10）。 用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增的PCR产物的雄性特异性的评估完全匹配DNA样品与普通鲤鱼的性别模式（图1）。附录A中的S1）。本研究中用于该雄性特异性标记的基因型鉴定的引物列于表1中。用来自不同养殖区的100多个鲤鱼样品进行解剖学分析，验证了PCR产物的雄性特异性。根据Sanger测序结果，从雄性鲤鱼样品中扩增的特异性PCR产物然而，这一确认的雄性特异性DNA序列尚未与GenBank中提交的任何普通鲤鱼基因组DNA序列相匹配。在该雄性特异性DNA片段内也未鉴定出显著的潜在编码区3.2. CYP17A1基因缺失鲤的选育cyp17a1 基 因 全 长 1533 bp ， 编 码 510 个 氨 基 酸 。利 用CRISPR/Cas9策略，通过显微注射Cas9蛋白和cyp 17 a1 gRNA产生在两个靶位点中具有突变的FO cyp 17 a1 敲除鱼（图1B ）。 1（a））。将11条受精后1年（ypf）具有有效cyp17a1突变的F0雄鱼与WT雌鱼杂交在F1群体中，获得并检查了WT雌性和F0雄性的后代（标记有电标记编号700497）;在cyp 17 a1的第一个靶位点中观察到3 bp插入，在第二个靶位点中观察到14 bp缺失（图1（b））。将1ypf的cyp17a1杂合子进行杂交，获得了来自F2的cyp17a1cyp17a1靶PCR的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和溴化乙锭染色后的成像用于检查cyp17a1突变状态，因为cyp17a1PCR产物中的异源链是G. 翟氏T.Shu，K.Chen等人工程8（2022）181184Fig. 1.鲤鱼cyp17a1基因的敲除。(a)来自鲤鱼基因组DNA的cyp17a1序列。用于筛选的引物根据已加下划线并以粗体显示的序列设计。原型间隔区邻近基序区（NGG）序列以蓝色突出显示，设计的靶位点以黄色突出显示。cyp17a1的起始密码子ATG以红色字体显示（b）对照cyp17a1和cyp17a1突变等位基因的示意图cyp17a1在第一和第二靶序列处的突变以红色字体显示（c）使用基因组DNA进行PCR分析，并使用PAGE对来自鱼DNA的PCR产物进行基因分在第一次PAGE中可以鉴定来自cyp 17 a1+/-鱼的DNA的PCR产物，并且在第二次PAGE期间与WT鱼的DNA的cyp 17 a1PCR产物混合后，可以鉴定来自cyp 17 a1+/+鱼和cyp 17 a1-/-鱼的DNA的PCR产物（在第一次PAGE中用蓝色箭头标记）（在第二次PAGE中用绿色箭头（d）对照和突变体Cyp17a1的推定肽的示意图截短的蛋白质含有与对照Cyp17a1蛋白质相同的8个氨基酸（以绿色显示）和45个错编码氨基酸（以灰色显示），所述错编码氨基酸是从来自Cyp17a1突变鱼的Cyp17a1突变株系中的提前终止密码子TAA以红色字体显示AA：氨基酸。经变性、复性后可鉴定为杂合子相反，在cyp 17 a1+/+鱼和cyp 17 a1-/-鱼的cyp 17 a1PCR产物中观察到单一条带，并且在第二轮PCR中与WTcyp 17 a1 PCR产物混合后观察到异源链（图1（c））。使用基因组和cDNA作为模板产生的PCR产物均用于突变验证。结果表明，突变株系仅保留8个正确的氨基酸，并且在45个不正确的氨基酸后，发生过早停止（图1B）。1（d））。3.3. cyp17a1缺失导致性腺类固醇生成受损的全男性纯合子和1 ypf时的男性典型SSC图2（a-d）显示了鱼类性腺的检查。在6 mpf下的cyp 17 a1-/-普通鲤鱼的所有雄性纯合子也在1 ypf下观察到（图1A和1B）。2（b）和（d））。普通鲤鱼在体细胞生长中表现出两性异形;雌性比雄性生长得快[10，11]。鱼的体重从F2群体证实了在两种CYP 17 A1+/+鱼中雌鲤生长快于雄鲤的事实和CYP17A1+/- 鱼（图2（e））。然而，在cyp17 a1耗尽后，消除了体细胞生长中的两性异形，因为cyp 17 a1-/-XX鱼的体重与cyp 17 a1-/-XY鱼的体重相当（图2（e））。cyp 17 a1+/-XX基因型个体的体重比对照组个体高32.66%（cyp 17 a1+/-XX个体：（750.6 ±277.2）g，cyp 17 a1+/+个体：（565.8 ± 166.6）g）。同时，对F2群体中各基因型的数量和比例进行了统计分析，包括基因型cyp 17 a1+/+、cyp17 a1+/-和cyp 17 a1-/-的鲤鱼。我们发现总的衍生比率符合遗传规律（孟德尔尽管cyp 17 a1-/-鱼的睾丸睾酮水平显著降低（图2（f）），但cyp 17 a1-/-XX鱼和cyp 17 a1-/-XY鱼与cyp 17 a1+/+XY鱼没有区别（图1A和1B）。 2（g-i））。据报道，鳃盖和胸鳍上的鳃是雄性典型的SSC[30]。当检查来自1 ypf的F2种群的鱼时（图11）。对照组雄鱼的鳃盖和胸鳍上有结节（图3）。 3（a）），但不是在对照雌性鱼（图3（c））或cyp 17 a1-/-鱼，无论性染色体模式（图3（c））。3（b）和（d））。3.4. AF鲤种群鲤鱼体细胞生长的两性异形现象，使雌鲤比雄鲤更有价值，这表明，利用cyp 17 a1+/+XX鱼与cyp 17 a1-/-XX鱼（新鲤）杂交建立AF群体来自AF群体的鱼的基因型鉴定和性腺分化的组织学分析显示在图4中。如预期的，来自上述亲本的所有后代被鉴定为AF，因为在受精后5天（dpf）在AF群体中未观察到雄性特异性标记（100.00%，n=84）（图4（a），第13-96行）。此外，解剖来自cyp 17 a1+/+XX鱼和cyp 17 a1-/-XX鱼（新雌鱼）之间杂交的AF种群的性腺，并在8 mpf下 进 行 组 织 学 分 析 ; 所 有 这 些 都 被 鉴 定 为 已 经 发 育 成 卵 巢（100.00%，n = 81）（图1A和1B）。4（c）和（d））。3.5. 来自对照组和AF组的鱼之间的生长比较AF组（cyp 17 a1+/-XX基因型）共500条鱼在孵化后与对照组的500条鱼在同一池塘中饲养。在8mpf下，随机选择56条雄性对照鱼（图5（a））、70条雌性对照鱼（图5（b））和来自AF组的92条鱼（图5（c））的体重，取样，并进行统计学分析。G. 翟氏T.Shu，K.Chen等人工程8（2022）181185图二. cyp17a1的缺失导致在1ypf时全雄性纯合子鱼。（a-d）鱼性腺的解剖学检查。(e)具有上述基因型的鱼的体重比较。(f)cyp 17 a1+/+XY鱼、cyp 17 a1-/-XY鱼和cyp 17 a1-/-XX鱼中睾丸睾酮水平的测量（g-i）精子的形态学分析。T：睾丸激素。条形图（e）和（f）中的字母a和b表示显著差异。未注明：无显著性;**：P0.01。表22019年和2020年确定的各基因型鱼类数量和比例年CYP17A1+/+CYP17A1+/-CYP17A1-/-总之XXXYXXXYXXXY20194735998452333502020282578733957300总75601771579190650比11.54%百分之九点二三百分之二十七点二三百分之二十四点一五百分之十四百分之十三点八五百分百分 析 了 对 照 组 公 鲤 （ cyp 17 a1+/+XY ） 和 对 照 组 母 鲤 （ cyp 17a1+/+XX）的体重再次完美地反映了在8 mpf时母鲤比公鲤更快的生长（对照组公鲤：（1.348 ± 0.2428）kg vs对照组母鲤：（1.459± 0.2830 ）kg）。对 照组平均 体重为（1.410 ± 0.2705） kg/尾，AF组鱼体增重显著提高（1.503 ± 0.2127）kg（图1）。 5（d））。4. 讨论在本研究中，在普通鲤鱼中进行cyp17a1基因敲除，并在5 mpf、6 mpf和1 ypf下评估关于性性状的发育后果我们未能证实先前报道的鲤鱼中两个DNA片段的雄性特异性[31，32]。因此，我们不得不对雌、雄鲤鱼基因组进行比较分析我们新发现的男性特异性DNA图三.在鳃盖和胸鳍上的结节的大体外观（一）CYP17A1+/+XY鱼;（b）第（1）款CYP17A1-/-XY鱼;（c）第（1）款CYP17A1+/+XX鱼;(d)cyp 17 a1-/-XX鱼。白色箭头表示鳃盖结节。黑色箭头表示胸鳍结节。标记（第S10节和图S1（见附录A和表1）是从全雄Cyp17a1缺陷鲤中筛选出XX基因型新雌鲤的有效工具。这确保了选择G. 翟氏T.Shu，K.Chen等人工程8（2022）181186见图4。AF群体基因型鉴定及性腺分化的组织学分析。(a)用雄性特异标记进行性别鉴定。(b)cyp17a1的鉴定作为对照。在琼脂糖凝胶电泳图像上标记泳道编号1、24、25、48、49、72、73和96。泳道1至12，雄性特异性标记与对照鱼的DNA的PCR产物泳道13至96，cyp17a1与来自AF种群的鱼的基因组DNA的PCR产物（c，d）在8 mpf下来自AF种群（cyp 17a1+/-XX）的鱼的性腺的解剖学和组织学检查的代表性图像缺点：控制。图五. AF组和对照组鱼在8 mpf下的体细胞生长比较。（a-c）鱼的一般外观的代表性图像。(d)对照组109尾，AF组81尾，进行体重比较* ：P0.05;**：P0.01。新鲤（cyp 17 a-/-XX）与野生型雌鲤（cyp 17 a1+/+XX）人工受精的过程，并有效地产生了AF鲤种群（图1）。 4）. 结合我们以前在斑马鱼模型上的工作，我们证明了性类固醇的作用，在调控性腺发育和分化方面，无论GSD背景如何，在鲤科中都是相似的。我们还证明，AF组的鱼的平均体重显著高于对照组的鱼G. 翟氏T.Shu，K.Chen等人工程8（2022）1811878 mpf（图） 5）。使用cyp17a1缺陷的新雄性鱼成功地生产了AF鲤鱼种群，这表明了类固醇激素诱导在生长中利用性二型性的潜在替代方案20世纪80年代，Wu et al.[12]报道，雌核发育和用17α-甲基睾酮处理可以有效地用于产生新雄配子。随后，发现表型为雄性但基因型为XX的新瘤动物在WT雌性鱼人工受精后产生AF最近，通过将正常雌性与通过雌核发育和甲基睾酮处理产生的新雌鱼杂交获得的AF鲤鱼种群已经报道[33，34]。此外，据报道，来曲唑和他莫昔芬可诱导鲤鱼性别逆转[6]。为了建立AF种群，甲基睾酮和芳香酶抑制剂（法倔唑或来曲唑）已被广泛用于在几种水产养殖物种中产生新雌鱼，包括雌核发育黄鼓[35]、大西洋大比目鱼（Hippoglossus ligossusL.）[36]、桂鱼[37]、溪红点鲑[38]、黄颡鱼[39]、黑鲷[40]。本研究在前人研究的基础上，以斑马鱼为模型，采用基因组编辑的方法研究性类固醇激素对鲤鱼性腺发育和分化的调控机制及其在鲤鱼新雌生殖中的应用通过对CYP17A1基因敲除后的鲤鱼进行性别控制，建立了一种新的水产养殖用鲤鱼AF群体的性别控制技术在过去的几十年里，中国科学家已经在几种养殖鱼类中培育出了许多单性品种然而，在鲤鱼中生产AF群体的传统方法由于产生大量生理稳定的新鲤而变得复杂此外，类固醇激素相关的化学残留物及其内分泌干扰作用也令人担忧[7]。与传统的激素诱导法相比此外，在两个连续的田间比较试验中观察到的具有cyp 17 a1 +/- XX基因型的鱼的显著更高的平均体重证明了我们的技术方案用于大规模AF生产和利用鲤鱼养殖生长中的两性异形的有效性和实用性（图1A和1B）。 2和5）。有趣的是，在cyp 17 a1-/-XY和cyp 17 a1-/-XX鱼中没有观察到生长的性二型化（图2（e））。这些结果表明，鲤鱼生长过程中的两性异形是基于性激素介导的卵巢分化。缺陷精子发生具有被观察到雄激素由ar[41然而，在成年cyp17a1缺陷型斑马鱼和鲤鱼中观察到一种全雄性表型，睾丸发育和精子发生不受影响，但雄性典型的SSC丢失，即使类固醇生成显著受损。我们认为，尽管雄激素不足，但仍存在正常发育的睾丸和成熟的精子，这可能是由于其他代偿因素，因为许多研究表明，斑马鱼睾丸中产生的睾酮信号传导以及其他雄激素类固醇可能是促进和维持精子发生的替代信号。这一假说仍需进一步研究证实。与在双线期（6 mpf）也携带卵母细胞的XXscl突变青鳉性腺中观察到的精子发生相似，本研究中的cyp 17 a1-/-XX鲤在5 mpf（Sec.S11和图附录A中的S2）。然而，在5 MPF，在CYP 17 A1-/-XX鲤鱼性腺组织中观察到较高水平的细胞凋亡。随后，在6 mpf的cyp 17a1-/- XX鲤鱼性腺组织中观察到了均匀的睾丸发育和精子发生（切片S12和图3）。附录A中的S3）。这些观察结果与cyp17a1缺陷型斑马鱼的观察结果一致，后者在30 dpf（性腺分化的关键时期）显示睾丸分化和细胞凋亡根据我们在两种cyp17a1缺陷型鲤科鱼类（斑马鱼和鲤鱼）中的观察，卵母细胞发育完全停止，与scl突变型青鳉中观察到的表型不同[24]。在cyp17a1缺陷的鲤科鱼类（斑马鱼和普通鲤鱼）和scl突变的青鳉之间观察到的性腺分化的差异在cyp17a1缺陷的斑马鱼和cyp17a1缺陷的普通鲤鱼中观察到精子数量显着增加的肥大睾丸先前，我们已经证明，垂体Fshb的上调（可能是由于缺乏性类固醇的有效负反馈调节所致）刺激了cyp17a1缺陷型斑马鱼的睾丸发育和精子发生，因为cyp17a1缺陷型斑马鱼中fshb的额外敲除导致睾丸发育和精子数量正常化[2]。在6 mpf的cyp 17 a1-/-鲤鱼中的肥大睾丸也可能归因于垂体中促性腺激素的潜在上调，因为与cyp 17 a1 +/+鱼中的表达相比，cyp 17 a1-/-鱼的睾丸中fsh b、igf 3和insl 3的靶基因显著上调（图2）。S3）。近年来，一些基因敲除物种已经表现出雌性到雄性的性逆转，例如cyp19a1a和cyp17a1基因敲除的斑马鱼和罗非鱼，这表明这些性类固醇对于性腺分化的调节是不可或缺的[2，3]。即便如此，哺乳动物中cyp17 a1突变引起的表型与鱼类中cyp 17 a1突变引起的表型高度分化;例如，在人类和小鼠中，cyp 17 a1突变均引起性发育障碍和性成熟延迟[46在青鳉（另一种使用XX/XY GSD系统的鱼类模型）中，携带cyp 17 a1突变的scl突变鱼也表现出雄性典型SSC和交配行为的丧失，但精子发育未受损，如XX和XY突变体均表现出性腺与精子[24]。当将对cyp17a1缺陷型斑马鱼（一种没有鉴定的GSD系统的实验品系[27]）的观察结果与对cyp17a1缺陷型青鳉和鲤鱼的观察结果进行比较时，可以看出，三种cyp17a1突变硬骨鱼的表型在精原干细胞、精子发生和睾丸发育方面非常相似。这些结果表明，无论是否存在GSD系统，硬骨鱼类和哺乳动物的性腺发育中性类固醇激素的作用可能存在差异。此外，本研究还证实了鲤鱼的XX/XY性别决定系统是依赖性类固醇激素的。这些发现使我们能够建立一个新的性别控制策略，在养殖鱼类在水产养殖。通过这种遗传方法产生的AF鲤鱼种群包含一个经编辑的cyp17a1基因座的拷贝。已经建立了建立高比例新雄性群体的优化策略（附录A第S13节和图S4）。在未来，我们将尝试通过将我们的二倍体cyp 17 a1-/-新鲤鱼与四倍体雌性鲤鱼杂交，按照先前研究中所述的方法，生产无菌、快速生长和AF三倍体鲤鱼[50]。未来的AF三倍体鲤鱼将减少由于它们不能繁殖而造成的生态风险，这将防止人工cyp17a1位点在鲤鱼种群内的漂移。G. 翟氏T.Shu，K.Chen等人工程8（2022）1811885. 结论cyp 17 a1的去除是获得具有睾丸分化和精子发生功能的cyp 17 a1-/-虽然新雄猴表现出外部雌性SSC表型，但可以容易地从成熟的新雄猴收集大量有活力的精子，然后可以成功地用于使从WT雌性收集的成熟卵子受精。此外，与我们新鉴定的雄性特异性DNA标记一起，可以容易地从cyp17a1缺陷的全雄性鲤鱼中筛选出成熟的新雄性鲤鱼，用作AF群体产生的父本亲本鱼这使得能够通过水产养殖中使用的常规体外人工受精程序产生cyp 17 a1+/-采用这种遗传方法可以培育出缺失几个核苷酸和一个功能丧失基因的新雄性鲤鱼。这种新的遗传方法提供了一种替代方法，通过利用鲤鱼生长中的性别二型性以有利于水产养殖的方式大量生产稳定的鲤鱼AF群体。它还避免了传统的类固醇激素诱导的性逆转方法释放的内分泌残留物引起的内分泌干扰作用的问题。但仍有必要对这些鱼进行消毒，以防止突变型cyp17a1位点在鲤鱼种群中的遗传漂变。致谢这项工作得到了国家重点研究发展计划（2018 YFD 0900205）的支持;国家自然科学基金委员会（31972779和31530077），中国科学院（XDA 24010206）的先导计划A项目，中国科学院青年创新促进会（20200336），以及淡水生态与生物技术国家重点实验室感谢袁晓和邢振飞提供扫描电镜（SEM）服务（中科院水生生物研究所分析测试中心）。遵守道德操守准则翟刚、舒婷婷、陈匡新、楼启勇、贾敬义、黄剑飞、史创、金夏、何江燕、姜东火、钱雪巧、胡伟和殷占声明，他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。作者翟刚和舒婷婷进行了这项工作的大部分实验。翟刚准备好了所有的数据，写了草稿。楼启勇、贾静怡、黄剑飞、史闯、夏进和何江燕在基因分型、鱼类育种和饲养方面提供了帮助。Kuangxin Chen和Wei Hu在识别雄性特异性标记方面提供了帮助。姜东火、钱雪巧、詹寅为这项工作提供了见解，并发起和监督了研究小组。詹寅和翟刚主持了该项目并对论文进行了修改。所有作者都批准了最终的manu脚本，并同意对这项工作的各个方面负责附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.03.026上找到。引用[1] 孙毅，朱志.使用基因组编辑设计未来的养殖鱼类。中国生命科学2019;62（3）：420-2.[2] Zhai G，Shu T，Xia Y，Lu Y，Shang G，Jin X，et al.cyp17a1基因缺陷斑马鱼的性特征发育特征内分泌学2018;159（10）：3549-62。[3] 唐红，陈艳，刘艳，尹艳，李刚，郭艳，等。基于芳香化酶缺陷型斑马鱼的研究结果，对雌激素在雄性生育中作用的新认识。内分泌学2017;158（9）：3042[4] Fenske M，Segner H.芳香化酶调节改变发育中斑马鱼性腺分化。水生毒理学2004;67（2）：105-26。[5] JiangM，Wu X，Chen K，Luo H，Yu W，Jia S，et al. 生产YY超级雄性和XY生理雌性鲤鱼，以潜在地消灭这种入侵物种。J World Aquacult Soc 2018;49（2）：315-27.[6] 辛格AK。 引进现代内分泌技术培育单性别鱼类种群。 Gen Comp Endocrinol2013;181：146-55。[7] Hoga CA，Almeida FL，Reyes FGR.激素在鱼类养殖中的应用及其残留分析方法。CYTA J Food 2018;16（1）：679-91.[8] BrownEE，Baumann H，Conover DO. 温度和光周期对鱼类性别决定的影响。J Exp Mar Biol Ecol 2014;461：39-43.[9] DevlinRH，Nagahama Y. 鱼类的性别决定和性别分化：遗传、生理和环境影响综述。 Aquarium2002;208（3-4）：191-364。[10] KocourM，Linhart O，Gela D，Rodina M. 全雌鲤与雌雄混养鲤的生长性能。人口分布在欧洲中部的气候条件下。世界水产学会杂志2005;36（1）：103-13.[11] 吴昌俊，桂建芳。鱼类遗传育种工程。上海：上海科学技术出版社; 1999. 中文.[12] 吴春，陈瑞，叶燕，柯华。 鲤鱼雌核发育的研究及纯系的建立。Acta GenetSin1981;8（1）：50-5.[13] Matsuda M，Nagahama Y，Shinomiya A，Sato T，Matsuda C，Kobayashi T，et al. 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